معلومة

Deinococcus radiodurans - علم الأحياء


  1. Takala، H.، Niebling، S.، Berntsson، O.، Björling، A.، Lehtivuori، H.، Häkkänen، H.، Panman، M.، Gustavsson، E.، Hoernke، M.، Newby، G. and Zontone ، F. ، 2016. التغيرات الهيكلية التي يسببها الضوء في لون جرثومي أحادي.الديناميات الهيكلية, 3(5) ص 054701. بي دي إف
  2. Feliks، M.، Lafaye، C.، Shu، X.، Royant، A. and Field، M.، 2016. المحددات الهيكلية للإضاءة المحسنة في عائلة من البروتينات الفلورية تحت الحمراء القائمة على البكتيريا: رؤى من الحسابات الكهروستاتيكية المستمرة والجزيئية المحاكاة الديناميكية. الكيمياء الحيوية, 55(31) ، ص 4263-4274. بي دي إف
  3. Shcherbakova، D.M.، Baloban، M.، Pletnev، S.، Malashkevich، V.N.، Xiao، H.، Dauter، Z. and Verkhusha، V.V.، 2015. الكيمياء والبيولوجيا,22(11) ص 1540-1551. بي دي إف
  4. Takala، H.، Björling، A.، Linna، M.، Westenhoff، S. and Ihalainen، JA، 2015.مجلة الكيمياء البيولوجية, 290(26) ، ص 16383-16392. بي دي إف
  5. Li، F.، Burgie، E.S.، Yu، T.، Héroux، A.، Schatz، GC، Vierstra، R.D. and Orville، A.M.، 2015. يستحث إشعاع الأشعة السينية نزع توتر كروموفور بيلين في فيتوكروم D. radiodurans البلوري. مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية, 137(8) ص 2792-2795. بي دي إف
  6. Takala، H.، Lehtivuori، H.، Hammarén، H.، Hytönen، V.P. و Ihalainen، J.A، 2014. العلاقة بين خصائص الامتصاص والتغيرات التوافقية في فيتوكروم Deinococcus radiodurans. الكيمياء الحيوية, 53(45) ، ص 7076-7085. بي دي إف
  7. Burgie ، E.S. ، Wang ، T. ، Bussell ، A.N. ، Walker ، J.M. ، Li ، H. and Vierstra ، R.D. ، 2014. تكشف التحليلات المجهرية البلورية والإلكترونية لفيتوكروم بكتيري عن إعادة ترتيب محلية وعالمية أثناء التحويل الضوئي.مجلة الكيمياء البيولوجية, 289(35) ، ص 24573-24587. بي دي إف
  8. Takala، H.، Björling، A.، Berntsson، O.، Lehtivuori، H.، Niebling، S.، Hoernke، M.، Kosheleva، I.، Henning، R.، Menzel، A.، Ihalainen، J.A. and Westenhoff، S.، 2014. تضخيم الإشارة ونقلها في مستشعرات ضوئية بلون فيتوكروم.طبيعة سجية, 509(7499) ، ص 245. بي دي إف
  9. Nieder، J.B.، Stojković، E.A.، Moffat، K.، Forest، KT، Lamparter، T.، Bittl، R. and Kennis، JT، 2013. Pigment – ​​Protein Interactions in Phytochromes Probed by Fluorescence Line Shectroscopy. مجلة الكيمياء الفيزيائية ب, 117(48) ص 14940-14950. بي دي إف
  10. Lehtivuori ، H. ، Rissanen ، I. ، Takala ، H. ، Bamford ، J. ، Tkachenko ، N.V. and Ihalainen ، J. مجلة الكيمياء الفيزيائية ب, 117(38) ، ص 11049 - 11057. بي دي إف
  11. Falklöf، O. and Durbeej، B.، 2013. نمذجة أطياف امتصاص الفيتوكروم. مجلة الكيمياء الحاسوبية, 34(16) ص 1363-1374. بي دي إف
  12. أولدريدج ، إم إي بي دي إف ، ساتيشور ، كا ، أنستروم ، دي إم. and Forest ، K.T. ، 2012. تعمل الهندسة الموجهة بالبنية على تحسين البروتين الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القائم على فيتوكروم. مجلة الكيمياء البيولوجية, 287(10) ، الصفحات من 7000 إلى 7009. بي دي إف
  13. Li H ، Zhang J ، Vierstra RD ، Li H. التنظيم الرباعي لثنائي اللون فيتوكروم كما تم الكشف عنه بواسطة الفحص المجهري للبرودة الإلكترونية. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم. 2010 15 يونيو ؛ 107 (24): 10872-7. بي دي إف
  14. Matute ، R.A. ، Contreras ، R. and González ، L. ، 2010. DFT المعتمدة على الوقت على Phytochrome Chromophores: A Way to the Right Conformer. مجلة رسائل الكيمياء الفيزيائية, 1[4) ، ص 796-801. بي دي إف
  15. Bornschlögl، T.، Anstrom، D.M.، Mey، E.، Dzubiella، J.، Rief، M. and Forest، KT، 2009. شد العقدة في فيتوكروم بواسطة الفحص المجهري للقوة الذرية أحادية الجزيء. مجلة بيوفيزيائية, 96[4) ص 1508-1514. بي دي إف
  16. Kaminski، S.، Daminelli، G. and Mroginski، M.A، 2009. محاكاة الديناميات الجزيئية لموقع ربط chromophore لـ Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome باستخدام معلمات مجال قوة جديدة لحامل الكروموفور phytochromobilin. مجلة الكيمياء الفيزيائية ب, 113[4) ، ص 945-958. بي دي إف
  17. von Stetten، D.، Günther، M.، Scheerer، P.، Murgida، DH، Mroginski، MA، Krauß، N.، Lamparter، T.، Zhang، J.، Anstrom، DM، Vierstra، RD and Forest، KT ، 2008. عدم تجانس الكروموفور والتحويل الضوئي في بلورات فيتوكروم ومحلول تمت دراسته بواسطة التحليل الطيفي للرنين رامان.Angewandte Chemie International Edition, 47(25) ص 4753-4755. بي دي إف
  18. Wagner، JR، Zhang، J.، von Stetten، D.، Günther، M.، Murgida، DH، Mroginski، MA، Walker، JM، Forest، KT، Hildebrandt، P. and Vierstra، RD، 2008. Mutational analysis of يكشف Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome عن الأحماض الأمينية الأساسية اللازمة لدورة اللونية الضوئية ودورة تبادل البروتون في الكروموسومات النباتية. مجلة الكيمياء البيولوجية, 283(18) ، ص 12212-12226. بي دي إف
  19. Yoon و JM و Hahn و T.R. و Cho و M.H. و Jeon و J.S. و Bhoo و S.H. and Kwon، Y.K.، 2008. مجال PHY مطلوب لتحقيق الاستقرار التوافقي والسلامة الطيفية للكروم الجرثومي من Deinococcus radiodurans.الكيمياء الحيوية والبيوفيزيائية تبحث في الاتصالات, 369[4) ، ص 1120-1124. بي دي إف
  20. Wagner، J.R.، Zhang، J.، Brunzelle، J.S، Vierstra، R.D. and Forest، KT، 2007. بنية عالية الدقة من Deinococcus جرثومة الفيتوكروم تعطي رؤى جديدة في بنية وتطور فيتوكروم. مجلة الكيمياء البيولوجية, 282(16) ص 12298-12309. بي دي إف
  21. Wagner ، J.R. ، Brunzelle ، JS ، Forest ، K.T. and Vierstra، R.D.، 2005. عقدة حساسة للضوء تم الكشف عنها من خلال بنية مجال ربط الكروموفور للفيتوكروم. طبيعة سجية, 438(7066) ، ص 325-331. بي دي إف
  22. Bhoo، S.H.، Davis، S.J.، Walker، J.، Karniol، B. and Vierstra، R.D.، 2001. Bacteriophytochromes عبارة عن كينازات هيستيدين فوتوكرومية باستخدام كروموفور biliverdin. طبيعة سجية, 414(6865) ، ص 776-779. بي دي إف
  23. Takala، H.، Niebling، S.، Berntsson، O.، Björling، A.، Lehtivuori، H.، Häkkänen، H.، Panman، M.، Gustavsson، E.، Hoernke، M.، Newby، G. pdf
  24. Björling، A.، Berntsson، O.، Lehtivuori، H.، Takala، H.، Hughes، AJ، Panman، M.، Hoernke، M.، Niebling، S.، Henry، L.، Henning، R. and Kosheleva ، I. ، 2016. التنشيط الضوئي الهيكلي لنبات فيتوكروم بكتيري كامل الطول. تقدم العلم, 2(8) ، ص. e1600920. بي دي إف
  25. لامبارتر ، T. ، 2006. نهج حسابي لاكتشاف وظائف النباتات النباتية البكتيرية عن طريق تحليل توزيعات متجانسة. المعلوماتية الحيوية BMC, 7(1) ، ص 1. بي دي إف

النموذج: الفئة


نظام مضادات الأكسدة من Deinococcus radiodurans

تشتهر Deinococcus radiodurans بمقاومتها الشديدة لمختلف الضغوط مثل الإشعاع المؤين (IR) والجفاف والإجهاد التأكسدي. لا تزال الآلية الأساسية للمقاومة الاستثنائية لهذه البكتيريا القوية غير واضحة. ومع ذلك ، فقد تم اعتبار النظام المضاد للأكسدة لـ D. radiodurans هو العامل المحدد لمقاومته التي لا مثيل لها ويحمي البروتين أثناء الإجهاد ، ثم يمارس نظام إصلاح الحمض النووي ونظام التمثيل الغذائي وظائفهما لإعادة الخلية إلى الحالة الفسيولوجية الطبيعية. النظام المضاد للأكسدة ليس مجهزًا فقط بأنواع الأكسجين التفاعلية الشائعة (ROS) لإنزيمات الكسح (على سبيل المثال ، الكاتلاز والأكسيد الفائق) ولكن أيضًا مسلح بمجموعة متنوعة من مضادات الأكسدة غير الإنزيمية (على سبيل المثال ، الكاروتينات وأنواع المنغنيز). وتلعب مجمعات المنغنيز الصغيرة دورًا مهمًا في نظام مضادات الأكسدة لـ D. radiodurans. ميزت الدراسات الحديثة العديد من المنظمين (على سبيل المثال ، PprI و PprM) في D. radiodurans ، والتي تلعب أدوارًا مهمة في حماية البكتيريا من الضغوط المختلفة. في هذا الاستعراض ، نقدم بانوراما للتقدم فيما يتعلق بخصائص نظام مضادات الأكسدة في D. radiodurans وتطبيقه في المستقبل.

الكلمات الدالة: نظام مضادات الأكسدة Deinococcus radiodurans Manganese PprI PprM أنواع الأكسجين التفاعلي.

حقوق النشر © 2019 معهد باستير. تم النشر بواسطة Elsevier Masson SAS. كل الحقوق محفوظة.

بيان تضارب المصالح

إعلان تضارب المصالح يذكر المؤلفون أنهم لم ينشروا أو يقدموا المخطوطة في مكان آخر.


هيكل الخلية والتمثيل الغذائي

D. radiodurans هي بكتيريا موجبة الجرام تتكون عادة في أزواج كروية أو رباعيات. [4] الجانب الأكثر إثارة للاهتمام حول بنية الخلية D. radiodurans هو أنها تحتفظ بـ4-10 نسخ من جميع جيناتها في أي وقت حسب مرحلة نموها الحالية. يعتقد العديد من الباحثين أن هذا يتعلق بالسبب الذي يجعله يتحمل الكثير من الإشعاع. هذه القدرة لا تعتمد على بعض الجينات "السحرية" التي تحميها من الإشعاع ، بل على ما يبدو D. radiodurans قادر على إصلاح الشقوق المزدوجة في الحمض النووي بشكل أكثر كفاءة والتي تنتج عن التلف الإشعاعي بفضل هذه النسخ الإضافية وبعض البروتينات الخاصة الأخرى. [2]


المواد والأساليب

الوسائط والمواد الكيميائية

تم استخدام أجار المغذيات (NA ، Oxoid) للاختيار والصيانة الروتينية الإشريكية القولونية سلالات. للتجارب ، بكتريا قولونية نمت الخلايا باستخدام وسط Luria-Bertani (LB). تمت إضافة المكملات حسب الحاجة: 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. جرثومة المعدة تم شراء 26695 سلالة من المجموعة الوطنية للثقافات النوعية للصحة العامة في إنجلترا وتم الاحتفاظ بها على لوحات كولومبيا Blood Agar (CBA) التي تحتوي على 5 ٪ من دم الأغنام منزوع الرجفان (Thermo Fisher Scientific) في غرف ميكرويروفيليك (Oxoid) حيث تم الحفاظ على الغلاف الجوي باستخدام CampyGen 2.5 L الكيس (أوكسويد). تمت إضافة المكملات على النحو المطلوب: 5 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول ، 10 ميكروغرام / مل كاناميسين. ما لم يذكر خلاف ذلك ، تم الحصول على جميع المواد الكيميائية والكواشف من Sigma-Aldrich.

هيليكوباكتر بيلوري تحويل

لتوليد جرثومة المعدة المسوخ ، تم تنشيط سلالات المتلقي من مخزون الجلسرين على لوحات CBA الطازجة عند 37 درجة مئوية. تم توسيع مستعمرات كل سلالة بشكل متسلسل على ألواح CBA حتى تم الوصول إلى طبقة متكدسة. تم ضغط هذه الخلايا في كرة وتركت لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية لتعزيز التطور الطبيعي للكفاءة الجينية. تم بعد ذلك نقل كتلة الخلايا إلى لوحة CBA مُسخنة مسبقًا وتركت لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تمت إضافة خمسة ميكروغرام من الحمض النووي بحجم & لتر 10 ميكرولتر برفق فوق الكرة وخلطها باستخدام حلقة التلقيح. ثم تم ضغط الخلايا واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. أخيرًا تم نشر الخلايا بعد ذلك على صفيحة CBA مُجهزة مسبقًا تحتوي على مضاد حيوي وحضنت عند 37 درجة مئوية. ظهرت المحولات بشكل عام بعد 4-5 أيام.

تعبير البروتين وتنقيته

ال الحمض النووي تم تضخيم الجين من كل نوع بواسطة PCR باستخدام إما الحمض النووي الجيني أو الجين الاصطناعي (GenScript) واستنساخه في pSP015 الذي يحتوي على His14-SUMO-FLAG3 بطاقة شعار. تم تضخيم البلازميدات في DH5α ثم تحويلها إلى BL21 (DE3) - pLysS. نمت السلالات في وسط LB عند 37 درجة مئوية. في أ600 تمت إضافة 0.6 ، 1 ملي مولار IPTG وحضنت الثقافات لمدة 4 ساعات عند 30 درجة مئوية. ل B. الرقيقة الحمض النووي ، تم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 7000 جم لمدة 20 دقيقة ، وإعادة التعليق في 40 مل من Ni 2+ Binding Buffer (30 ملي مولار HEPES [pH 7.6] ، 250 ملي غلوتامات البوتاسيوم ، 10 ملي أسيتات المغنيسيوم ، 20٪ سكروز ، 30 ملي إيميدازول ) يحتوي على 1 قرص مثبط للبروتياز خالي من EDTA (Roche # 37378900) ومضغوط مجمدة في النيتروجين السائل. تم إذابة معلقات الحبيبات الخلوية واحتضانها باستخدام 0.5 مجم / مل من الليزوزيم على الجليد لمدة ساعة واحدة. تم تعطيل الخلايا عن طريق صوتنة (5 دورات من 3 دقائق عند 30 واط مع 2 ثانية نبضات / فترات الراحة). لإزالة حطام الخلية ، تم طرد المحللة عند 24000 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم مر خلال مرشح 0.2 ميكرومتر لمزيد من التوضيح. تم إجراء جميع خطوات التنقية الإضافية عند 4 درجات مئوية باستخدام FPLC بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.

تم وضع المحللة الموضحة على عمود HisTrap HP سعة 1 مل (GE) ، وغسله ب 10 مل من Ni 2+ High Salt Wash Buffer (30 ملي مولار HEPES [درجة الحموضة 7.6] ، 1 م غلوتامات البوتاسيوم ، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم ، 20٪ سكروز ، 30 ملي إيميدازول) و 10 مل من 10٪ Ni 2+ Elution Buffer (30 ملي HEPES [pH 7.6] ، 250 ملي غلوتامات البوتاسيوم ، 10 ملي أسيتات المغنيسيوم ، 20٪ سكروز ، 1 م إيميدازول). تمت التصفية من البروتينات باستخدام تدرج خطي 10 مل (10-100٪) من Ni 2+ Elution Buffer. تم تطبيق الكسور التي تحتوي على البروتين على عمود تقارب HiTrap Heparin HP سعة 1 مل معادل في H Binding Buffer (30 ملي مولار HEPES [درجة الحموضة 7.6] ، 100 ملي غلوتامات البوتاسيوم ، 10 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم ، 20٪ سكروز). تمت التصفية من البروتينات باستخدام تدرج خطي 20 مل (20-100٪) من H Elution Buffer (30 ملي مولار HEPES [درجة الحموضة 7.6] ، 1 مولار غلوتامات البوتاسيوم ، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم ، 20٪ سكروز). تم تجميع الأجزاء التي تحتوي على DnaA (عادة ما يكون إجمالي 3 مل) وهضمها طوال الليل باستخدام 10 ميكرولتر من 10 مجم / مل.14-بروتياز Tev-SUMO (23).

تم تطبيق التفاعل المهضوم على عمود HisTrap HP سعة 1 مل لالتقاط المونومرات غير المشقوقة ، His14-علامة سومو وصاحب-14-بروتياز TEV-SUMO. تم جمع بروتينات DnaA المشقوقة في التدفق وتأكد نقاوتها باستخدام SDS-PAGE. تمت إضافة الجلسرين (20٪ نهائيًا) وتم تجميد قسامات البروتينات في النيتروجين السائل قبل تخزينها عند -80 درجة مئوية.

تنقية متماثلات الحمض النووي من الليسترية المستوحدة, المكورات العنقودية الذهبية و المكورات المعوية البرازية تم إجراءه على النحو الموصوف أعلاه باستثناء أنه تم تخفيف العينات إلى تركيز نهائي من غلوتامات البوتاسيوم يبلغ 100 ملي مولار قبل تطبيقها على عمود الهيبارين.

تنقية متماثلات الحمض النووي من Synechococcus elongatus, هيليكوباكتر بيلوري و Deinococcus radiodurans تم إجراؤه كما هو موضح أعلاه مع الاستثناءات التالية. أولاً ، تم حذف عمود الهيبارين. ثانيًا ، قبل تطبيق البروتينات المهضومة على عينات عمود HisTrap HP تم تخفيفها إلى تركيز إيميدازول نهائي قدره 50 ملي مولار.

مقايسة الارتباط التناظرية الفلورية ATP

تم تحضين البروتينات (8 ميكرومتر نهائي) باستخدام 0.16 ملي مولار من (2 ′ - (أو -3 ′) -ا- (t ri n itro p henyl) ثلاثي فوسفات الأدينوزين (TNP-ATP) (Thermo Fisher Scientific) ، في 50 ميكرولتر من مخزن التجليد المؤقت (10 مم HEPES-KOH [الرقم الهيدروجيني 8] ، 100 ملي غلوتامات البوتاسيوم ، 5 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم). تم استخدام تفاعل يحتوي على 8 ميكرومتر من الليزوزيم كعنصر تحكم سلبي. تم إجراء جميع التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في لوح أسود مسطح من البوليسترين ذو 96 بئر (Costar # CLS3694). تم تحفيز TNP-ATP عند 410 نانومتر وتم اكتشاف انبعاث مضان بين 500-650 نانومتر باستخدام قارئ لوحة (CLARIOstar Plus ، BMG Labtech).

سقالات الحمض النووي

تم تحضير سقالات الحمض النووي في تفاعل 20 ميكرولتر مع كل قليل النوكليوتيد (10 ميكرومتر) مختلط في Oligo Annealing Buffer (30 ملي مولار HEPES - KOH [الرقم الهيدروجيني 8] ، 100 ملي أسيتات البوتاسيوم و 5 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم). تم تسخين العينات في آلة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تبريدها من 1 درجة مئوية / دقيقة إلى 20 درجة مئوية قبل الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية قبل التخفيف إلى 1 ميكرومتر في مخزن أوليجو للتليين وتخزينها عند درجة حرارة -20 درجة ج. تم تصوير السقالات المفصولة بواسطة رحلان جل بولي أكريلاميد الكهربائي (يحتوي على Cy3 و Cy5 fluorophore) باستخدام ماسح ضوئي ليزر من طراز Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare) عند 400 فولت مع إثارة عند 532 أو 635 نانومتر ومرشح انبعاث LPR (580BP أو 665LP على التوالي). تمت معالجة الصور باستخدام فيجي (https://doi.org/10.1038/nmeth.2019). تم تحليل مجسات الحمض النووي التي تحتوي على كل من Cy5 و Black Hole Quencher-2 (BHQ-2) باستخدام قارئ لوحة (CLARIOstar Plus ، BMG Labtech) مع مرشحات محددة مسبقًا لـ Cy5 fluorophore (الإثارة 610-30 ، Dicroic 637.5 ، الانبعاث 675- 50) تحديد الكسب عند 2800.

في محاولة للحفاظ على تيم من قليل النوكليوتيدات ، تم تحوير DnaA-trios مع الحفاظ على المحتوى الأساسي (انظر الجدول التكميلي S3). لقياس درجة حرارة انصهار ركائز MUT و WT و DnaA-trios المتعلقة بكل كائن حي ، قمنا بإعداد تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 0.4 ميكرومتر من المسبار في محلول رد فعل مختلف (انظر أدناه المخزن المؤقت للتفاعل المرتبط بكل مسبار). تم بعد ذلك إجراء منحنى انصهار من 20 إلى 95 درجة مئوية على التفاعل باستخدام آلة Rotor-GenQ qPCR (QIAgen) مع مرشح إثارة 563 ومرشح انبعاث عالي التمرير 610 (كسب: 10). تم الإبلاغ عن المنحنيات التي تم الحصول عليها وقيمة الانصهار لكل قمة في الجدول التكميلي S3.

مقايسة فصل حبلا الحمض النووي لتخفيض الثقب الأسود (BHQ-SSA)

تم تخفيف كل سقالة DNA تحتوي على أليغنوكليوتيد واحد مع BHQ2 ، وواحد مع Cy5 وواحد غير موسوم (تركيز نهائي 12.5 نانومتر) في مخازن مناسبة (انظر أدناه). تم إجراء التفاعلات باستخدام صفيحة 96 بئر من البوليسترين الأسود مسطحة القاع (Costar # CLS3694). تم إجراء جميع ردود الفعل في ثلاث نسخ وتم اكتشاف التألق كل دقيقة بإجمالي 90 دقيقة. لجميع التفاعلات تم إجراء تحكم سلبي بدون بروتين (خلفية). في كل نقطة زمنية ، يتم طرح متوسط ​​قيمة الخلفية من القيمة التجريبية ، وبالتالي الإبلاغ عن نشاط DnaA المحدد على ركيزة واحدة.

لتصور منتجات التفاعل مباشرة (الشكل 2 ب) ، تمت إزالة 20 عينة ميكرولتر وإضافتها إلى 3.7 ميكرولتر من محلول التوقف الذي يحتوي على 250 نانومتر منافس غير موسوم (نفس تسلسل قليل النوكليوتيد الذي يحتوي على Cy5) ، 0.4 ٪ SDS و 1 مجم / مل بروتيناز K. تم تخزين التفاعلات على الجليد ثم تحميلها على 4 ٪ بولي أكريلاميد (19: 1) هلام وتشغيلها عند 100 فولت لمدة 3 ساعات في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 45 ملي مولار تريس ، 45 ملي حمض البوريك و 5 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم.

فحص BUS محدد باستخدام B. الرقيقة DNAA. (أ) تسلسل سقالة الحمض النووي ل B. الرقيقة والتمثيل التخطيطي لمقايسة فصل حبلا Black Hole Quencher (BHQ-SSA). (ب) BHQ-SSA باستخدام B. الرقيقة يشير DnaA إلى أن ATP مطلوب لفك السقالة. هلام بولي أكريلاميد يظهر الفصل المحدد لأوليغنوكليوتيد المسمى Cy5 من السقالة. (ج) BHQ-SSA باستخدام B. الرقيقة تشير بروتينات DnaA إلى أن إصبع الأرجينين (DnaA R264A ، باللون البنفسجي) وبقايا ربط ssDNA (DnaA I190A ، باللون البرتقالي) مطلوبة لفك السقالة. (د) BHQ-SSA باستخدام B. الرقيقة يشير DnaA إلى أن كلاً من DnaA-box و DnaA-trios مطلوبان لفك السقالة. تمثل البيانات المتوسط ​​والانحراف المعياري من ثلاث تجارب مستقلة. يظهر المحور Y وحدة تعسفية مضان (AU).

فحص BUS محدد باستخدام B. الرقيقة DnaA. (أ) تسلسلات سقالة الحمض النووي ل B. الرقيقة والتمثيل التخطيطي لمقايسة فصل حبلا Black Hole Quencher (BHQ-SSA). (ب) BHQ-SSA باستخدام B. الرقيقة يشير DnaA إلى أن ATP مطلوب لفك السقالة. هلام بولي أكريلاميد يظهر الفصل المحدد لأوليغنوكليوتيد المسمى Cy5 من السقالة. (ج) BHQ-SSA باستخدام B. الرقيقة تشير بروتينات DnaA إلى أن إصبع الأرجينين (DnaA R264A ، باللون البنفسجي) وبقايا ربط ssDNA (DnaA I190A ، باللون البرتقالي) مطلوبة لفك السقالة. (د) BHQ-SSA باستخدام B. الرقيقة يشير DnaA إلى أن كلاً من DnaA-box و DnaA-trios مطلوبان لفك السقالة. تمثل البيانات المتوسط ​​والانحراف المعياري من ثلاث تجارب مستقلة. يظهر المحور Y وحدة تعسفية مضان (AU).

ل B. الرقيقة, بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية و E. faecalis كان المخزن المؤقت للتفاعل 10 ملي مولار HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 8) ، 100 ملي غلوتامات البوتاسيوم ، 2 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم ، 30٪ جلسرين ، 10٪ DMSO و 1 ملي نيوكليوتيد (ADP أو ATP).

ل L. monocytogenes ، S. elongatus, جرثومة المعدة و D. radiodurans كان المخزن المؤقت المستخدم هو 10 مم HEPES-KOH (درجة الحموضة 8) ، و 100 ملي غلوتامات البوتاسيوم ، و 2 ملي مولار من أسيتات المغنيسيوم ، و 30٪ جلسرين و 1 ملي نيوكليوتيد (ADP أو ATP).

تم تحضير جميع التفاعلات على الجليد لضمان ثبات مسبار الحمض النووي ، ثم تم السماح لها بالتوازن مع درجة حرارة التفاعل (20 درجة مئوية لـ L. monocytogenes, E. faecalis و بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية 25 درجة مئوية ل B. الرقيقة, S. elongatus و جرثومة المعدة 32 درجة مئوية ل د). تمت إضافة بروتين DnaA إلى التركيز النهائي البالغ 130 نانومتر لـ B. الرقيقة و D. radiodurans و 650 نانومتر ل L. monocytogenes, E. faecalis, بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية, S. elongatus و جرثومة المعدة. ل B. subitlis على DnaA-Box # 7 MUT و DnaA-Box # 6 تمت إضافة بروتين MUT عند التركيز النهائي البالغ 650 نانومتر للسماح بإزاحة جميع المجسات.

مناعي

تم إصلاح البروتين المنقى المستخرج من 1 مل من عمود تقارب HiTrap Heparin HP (GE) في محلول عينة NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتم حل المجمعات عن طريق تشغيل 8 ميكرولتر من كل عينة على NuPAGE Novex 4– 12٪ جل تريس أسيتات (Thermo Fisher Scientific). تم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF باستخدام جهاز نقل Turbo-Blot وحزم نقل Trans-Blot Turbo TM Midi PVDF (Bio-Rad). تم حظر الغشاء باستخدام PBS + 5٪ حليب لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة ثم تم تحضينه بمحلول حليب PBS + 1٪ يحتوي على جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ FLAG 1: 2000 (Sigma-Aldrich # F3165) لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. تم غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS + 0.05٪ Tween-20 ثم تم تحضينه بمحلول حليب PBS + 1٪ يحتوي على جسم مضاد ثانوي مترافق مضاد للفئران (Sigma-Aldrich # A9044). تم غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS + 0.05٪ Tween-20 ثم تم تحضينه لمدة 5 دقائق باستخدام ركيزة Pierce ECL Plus (Thermo Scientific). تم الكشف عن التلألؤ الكيميائي باستخدام جهاز تصوير ImageQuant LAS 4000 (GE Healtcare). تمت معالجة الصور باستخدام فيجي (https://doi.org/10.1038/nmeth.2019).

تشابك البروتين

تم تحضير سقالات الحمض النووي عن طريق خلط كل قليل النوكليوتيد (50 نانومتر تركيزات نهائية) في 10 ملي مولار HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 7.6) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي مولار EDTA ، التسخين إلى 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة حرارية ثم التبريد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. تم دمج بروتينات DnaA CC (250 نانومتر) مع سقالة DNA (25 نانومتر) في 10 ملي مولار HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني 8) ، 100 ملي غلوتامات البوتاسيوم ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي أسيتات المغنيسيوم ، 25٪ جلسرين ، 0.01٪ توين. -20 و 2 ملي نيوكليوتيدات (ADP أو ATP). تم تحضين التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 6 دقائق ، ثم تمت إضافة 2.5 ميكرولتر من 20 ملي مولار من بيسمالي إيثان (BMOE) (4 ملي مولار نهائي) (Thermo Fisher Scientific # 803561) إلى بروتينات DnaA CC للوصلة المتقاطعة. بعد 6 دقائق تم إخماد التفاعل بإضافة 5 ميكرولتر من 200 ملي سيستين (60 ملي مولار نهائيًا) لمدة 10 دقائق. تم إصلاح العينات في محلول عينة NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتم حل المجمعات وتصورها عن طريق تشغيل 8 ميكرولتر من كل تفاعل باتباع الطريقة الموضحة أعلاه. اعتمد تفسير الأنواع المتشابكة على هجرتها بالنسبة إلى علامات الوزن الجزيئي. تم إجراء جميع التجارب بشكل مستقل ثلاث مرات على الأقل ، ويتم عرض البيانات التمثيلية.

برنامج البحث عن تسلسل الحافلة

تم تصميم برنامج لتحديد تسلسل BUS في أصول التكاثر البكتيري بناءً على نمط مناطق الفك التجريبية والمتوقعة (22). خلال عملية التدريب ، تم تعديل البرنامج لإخراج نفس التسلسل المتوقع مثل تلك التي تم تحديدها بواسطة التحليل السابق لعشرين oriCs ، من أجل إنشاء المعلمات والقواعد المطلوبة من قبل البرنامج (الجدول التكميلي S1 والشكل S2). بشكل عام ، يتكون تسلسل BUS من ثلاثة أجزاء: DnaA-box ، والفاصل ، وزخارف DnaA-trios المتكررة. يتم تقديم المعلمات المحددة للأجزاء الثلاثة أثناء عملية التدريب على النحو التالي:

الشكل القياسي لصندوق DnaA. إذا كان النوع يحتوي على DnaA-box متشعب في DoriC (21 ، 24) ، فإن النموذج القياسي لـ DnaA-box هو النوع المحدد ، بينما في الحالات الأخرى كان بكتريا قولونية أعلى عزر DnaA-box تقارب (5′-TTATCCACA-3 ′).

عدم تطابق مربع DnaA المتوقع. إذا كان طول النموذج القياسي 9 نقاط أساس وكان هناك صندوق DnaA واحد فقط ، فسيتم تعيين الحد الأقصى لعدم التطابق على أنه 2. إذا كان طول النموذج القياسي 9 نقاط أساس وكان هناك زوج من صناديق DnaA موجودة ، عندئذٍ لا يكون الحد الأقصى لعدم التطابق أكثر من 2 (صندوق DnaA الأكثر حفظًا) أو 4 (صندوق DnaA الأقل حفظًا). إذا كان طول النموذج القياسي أكثر من 9 نقاط أساس ، فسيتم زيادة الحد الأقصى لعدم تطابق النعل (إذا كان مفردًا) أو الأكثر حفظًا (إذا كان مترادفًا) عند 3.

طول الفاصل بينتم تحديد موقع DnaA-box الأول وأول DnaA-trios. وفقًا للجدول التكميلي S1 ، نفترض أن أطول فاصل قد يشمل: التسلسل بين صندوقي DnaA (بحد أقصى 3 bp) ، وصندوق DnaA أقل حفظًا (بشكل عام 9 bp) ومنطقة الفجوة الثانية المسماة سابقًا منطقة GC-rich (4 نقاط أساس في المتوسط). لذلك ، يتم تعيين الحد الأقصى للطول المحدد مسبقًا للمباعد على 16 نقطة أساس ، وهو مجموع الأجزاء الثلاثة.

نمط ثلاثي DnaA. القاعدة في منتصف كل شكل ثلاثي النوكليوتيد DnaA-trios عبارة عن أدينين محفوظ. تحليل B. الرقيقة اقترح DnaA-trios أن مجموعة من ثلاثة أشكال كانت مطلوبة كحد أدنى لنشاط الأصل (22). لذلك ، تم تعيين النمط العام لـ DnaA-trios على أنه (.

تنقسم عملية البحث إلى خطوتين (الشكل التكميلي S2B). أولاً ، يبحث البرنامج عن تسلسل المرشح بالنمط العام لتسلسل BUS (الشكل التكميلي S2D). في هذه الخطوة ، تحدد موقع DnaA-box (أول صندوق DnaA الموجود) (عدم تطابق ≤2) بمسافة من 0 إلى 16 نقطة أساس من ثلاثي DnaA. بعد ذلك ، يتم البحث في مربع DnaA الثاني (عدم تطابق ≤4) عن المنبع أو المصب لمربع DnaA المحدد في الخطوة الأولى. وتجدر الإشارة إلى أنه إذا تم تحديد هذا الصندوق DnaA الأخير قبل أول واحد ويبدو أنه يحتوي على عدد أقل من عدم التطابق ، فسيتم حساب الطول الفعلي للمباعد من مربع DnaA الثاني الموجود ، وبالتالي ، سيكون أكثر من 16 بي بي.

تنقسم عملية الفرز إلى ثلاث خطوات (الشكل التكميلي S2C). أولاً ، يحافظ البرنامج على التسلسلات المرشحة ذات أعلى نقاط DnaA-trios. بعد ذلك ، يتم الاحتفاظ بالتسلسلات المرشحة التي تحتوي على الحد الأدنى لعدد حالات عدم التطابق في مربع DnaA (الوحيد إذا كان مفردًا أو الأكثر حفظًا إذا كان مترادفًا). بعد هاتين الخطوتين و gt94 ٪ من الجينومات لديها تسلسل مرشح واحد. ثالثًا ، يتم الاحتفاظ بالتسلسلات المرشحة بطول المباعد الأقرب إلى 13 زوجًا أساسيًا ، نظرًا لأنه يمثل طول المباعد الأكثر شيوعًا. بعد هذه الخطوة ، يتبقى لجميع الجينومات تقريبًا (& gt99٪) تسلسل مرشح واحد.


حول هذا الموقع

تم إنشاء هذا الموقع كمهمة لصف بيولوجيا الكائنات الحية في ربيع عام 2008. لقد طُلب منا إنشاء صفحة ويب على أي كائن حي من اختيارنا.

معلومات للتواصل

هل تعتقد أن الموقع كان رائعًا؟ هل لديك معلومات إضافية؟ تعتقد أن هناك حاجة إلى تصحيح؟ الرجاء التواصل معي.

شكر خاص!

أود أن أستغل هذا الوقت لإرسال شكر خاص لمايكل دالي لاستخدام صوره وكل الأبحاث الرائعة التي قدمها لي. أيضًا ، سمح لي دينيس كونكيل بلطف باستخدام صوره الإلكترونية المجهرية. ذهبت الدكتورة بوني براتينا عن طريقها لتزودني بصور من رحلتها إلى القارة القطبية الجنوبية. بالطبع ، لم يتم إنشاء الموقع بمساعدة الدكتور فولك والدكتور ساندلاند.

نبذة عن الكاتب

اسمي ميغان أرنولد وأنا مبتدئ في جامعة ويسكونسن لاكروس. أنا متخصص في العلوم الطبية الحيوية مع تخصص ثانوي في الكيمياء. تكمن جذوري في بلدة إيفانسفيل الزراعية الصغيرة بولاية ويسكونسن. مثل الغالبية العظمى من طلاب الجامعات ، فإن خططي المستقبلية معلقة في الهواء. سواء كان ذلك في الطب أو العلاج الطبيعي أو البحث ، فإن حبي لتعلم العلوم لا يتزعزع. المشاعر الأخرى لدي متنوعة تمامًا. الخبز ولعب البوق والسباحة والجري والأصدقاء والعائلة يشغلون الكثير من وقتي ، وأحيانًا أكثر مما ينبغي :). أنا أفضل في التسويف وأفتخر بقدرتي على خبز فطيرة تفاح مذهلة.

لماذا دينوكوكس ?

لذا ربما تتساءل عن كل كائن حي على tكوكبه ، لماذا أختار Deinococcus radiodurans؟ في مقدمتي إلى فصل علم الأحياء الدقيقة ، كان مطلوبًا تعلم مجموعة كاملة من الكائنات الحية الدقيقة. Deinococcus radiodurans دائما عالق في وجهي. أعني ، هيا ، يمكن أن ينجو من الإشعاع المؤين للنفايات النووية ، هل يصبح أكثر برودة من ذلك؟

باتيستا ، جي آر 1997. ضد كل الصعاب: استراتيجيات البقاء على قيد الحياة من Deinococcus radiodurans. المراجعة السنوية لعلم الأحياء الدقيقة. 51: 203-224.

بلاسيوس ، ميلاني ، ريبيكا بوب ، إيغور في شيفيليف ، وأولريش هوبشر. 2007. الإنزيمات المشاركة في ربط الحمض النووي والشفاء النهائي في البكتيريا المقاومة للإشعاع Deinococcus radiodurans. علم الأحياء الجزيئي BMC. 8:69.

بون ، ديفيد ر. ، وريتشارد دبليو كاستنهولز. 2001. Bergey & # 39s Manual of Systematic Bacteriology 2nd Ed. Springer-Verlag. نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

بريم ، حسن ، جيفري ب. أوزبورن ، هيذر إم كوستانداريثيس ، جيمس ك.فريدريكسون ، لورانس ب. واكيت ، ومايكل جيه دالي. 2006. Deinococcus radiodurans تم تصميمه من أجل مرافق تحلل التولوين الكاملة للحد من Cr (VI). علم الاحياء المجهري. 152: 2469-2477.

بريم ، حسن ، سارة سي ماكفارلان ، جيمس ك.فريدريكسون ، دينيث دبليو مينتون ، مين تشاي ، لورانس بي واكيت ، ومايكل جيه دالي. 2000. الهندسة Deinococcus radiodurans لمعالجة المعادن في بيئات النفايات المختلطة المشعة. التكنولوجيا الحيوية الطبيعة. 18: 85-90.

Dennis Kunkel Microscopy، Inc. 2007. & ltURL: http: //www.denniskunkel.com>. تم الوصول إليه في 14 أبريل 2008.

جروس ، مايكل. 1998. الحياة على الحافة: مخلوقات مذهلة تزدهر في بيئات قاسية. مطبعة بلينوم ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

هولومان وويليام ك. وجان شيراوسكي وروبن هوليداي. 2007. نحو فهم مقاومة الإشعاع المتطرفة Ustilago maydis. الاتجاهات في علم الأحياء الدقيقة. 15: 525-529.

ماديجان ومايكل تي وجون إم مارتينكو وبول ف. دنلاب وديفيد ب. كلارك. 2009. Brock Biology of Microorganisms الطبعة الثانية عشر. شركة بيرسون التعليمية ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا.

ماتيمور وفاليري وجون آر باتيستا. 1996. مقاومة الإشعاع Deinococcus radiodurans: الوظائف الضرورية للبقاء على قيد الحياة من الإشعاع المؤين ضرورية أيضًا للبقاء على قيد الحياة في الجفاف لفترات طويلة. مجلة علم الجراثيم. 178: 633-637.

أوميلتشينكو ، مارينا ف ، يوري آي وولف ، إيلينا ك. جايداماكوفا ، فيرا تي ماتروسوفا ، ألكسندر فاسيلينكو ، مين زاي ، مايكل ج دالي ، يوجين ف.كونين ، وكيرا ماكاروفا. 2005. علم الجينوم المقارن ثيرموفيلوس و Deinococcus radiodurans: طرق متباينة للتكيف مع مقاومة الحرارة والإشعاع. علم الأحياء التطوري BMC. 5:57.

ريني ، فريدريك أ ، فرناندا نوبري ، بيتر شومان ، إركو ستاكبرانت ، وميلتون إس كوستا. 1997. التنوع الوراثي للمكورات Deinococci كما تحدده مقارنة تسلسل الحمض النووي الريبوزومي 16S. الجريدة الدولية لعلم الجراثيم النظامي. 47: 510-514.

Zhdanova و Nelli N. و Tatyana Tugay و John Dighton و Victor Zheltonozhsky و Patrick McDermott. 2004. الإشعاع المؤين يجذب فطريات التربة. مجلات كامبريدج. 108: 1089-1096.


2 إجابات 2

وفقًا لقسم "التكيف الوظيفي" في صفحة الويب هذه ، فإن Deinococcus radiodurans يستخدم بروتينات إصلاح لربط الحمض النووي بعد التلف الإشعاعي. بمعنى ، بعد انفجار الإشعاع ، سيتحول الحمض النووي إلى أجزاء وستعيد البروتينات الإصلاحية تماسكه مرة أخرى. يبدو أن هذه الآلية لن تلعب دورًا خلال الأشكال الأخرى من طفرات الحمض النووي التي تحدث أثناء التكاثر ، مثل الطفرات النقطية أو الانقلابات.

Deinococcus radiodurans لم "يطور مقاومة للطفرات".

إنه قادر على إصلاح الكروموسوم الخاص به عندما يتشتت في قطع بواسطة الإشعاعات أو الجفاف ، بينما تموت البكتيريا الأخرى في مثل هذه الظروف.

لذلك هذا قابل للتكيف في البيئات القاسية ، مثل الصحاري (حيث تطور) أو لحم البقر المعلب (حيث تم اكتشافه).


المواد والأساليب

السلالات وظروف النمو والعلاج.

السلالات والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة موصوفة في الجدول 2. يتم تحديد جميع الجينات كما هو موضح في تسلسل الجينوم المنشور (http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.spl؟database=gdr). نمت جميع السلالات المشتقة من D. radiodurans عند 30 درجة مئوية في مرق TGY (0.5٪ تريبتون ، مستخلص الخميرة 0.3٪ ، و 0.1٪ جلوكوز) أو على أجار TGY (1.5٪ أجار). نمت سلالات E. coli في مرق Luria-Bertani (LB) أو على أطباق LB عند 37 درجة مئوية. تم نشر البلازميدات بشكل روتيني في سلالة E. coli DH5αMCR. تم تقييم مزارع D. radiodurans لقدرتها على النجاة من التعرض للعوامل الضارة بالحمض النووي في النمو الأسي (OD600 = 0.08 - 0.15 ، 5 × 10 6 - 1 × 10 7 cfu / ml). تم علاج جميع الثقافات عند 25 درجة مئوية. تم إجراء تشعيع جاما باستخدام جهاز تشعيع 484R 60 Co (J.L Shepherd and Associates ، سان فرناندو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) بمعدل 30 غراي / دقيقة. تم تحديد مقاومة ميتومايسين C بإضافة 1 مجم من ميتوميسين سي (سيغما ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة) إلى مزارع مرق 1 مل من سلالة D. radiodurans. تمت إزالة قسامات المزرعة المعالجة على فترات نصف ساعة على مدار الساعتين التاليتين ، وغسلها في 10 ملي مولار MgSO4 ، وطليها على أجار TGY لتحديد الصلاحية.

بناء TNK104 و TNK106 و TNK110.

الجينات ddrA و recA عن طريق الطفرات المستهدفة باستخدام التقنيات الموصوفة سابقًا (Funayama et al. 1999). تم إنشاء شريط حذف لكل موضع وتحويله إلى مرحلة أسية من ثقافة D. radiodurans R1. تم اختيار المواد المؤتلفة على لوحات TGY التي تحتوي على مضاد حيوي مناسب. نظرًا لأن D. radiodurans متعدد الجينات ، فقد تم فحص المستعمرات الفردية لتحديد ما إذا كانت متماثلة اللواقح للاضطراب عن طريق عزل الحمض النووي الجينومي من المؤتلفات المفترضة واستخدام التحليل القائم على PCR لتحديد ما إذا كان الجين المعني قد تم حذفه. فيما يلي تفاصيل حول كيفية إنشاء كل سلالة.

The construction of TNK104 began with the creation of a drug cassette capable of conferring hygromycin resistance on D. radiodurans. The hygromycin B phosphotransferase gene (hyg) from pHP45omega-hyg (Blondelet-Rouault et al. 1997) was spliced to the 120 bp of sequence immediately upstream of the initiation codon of the D. radiodurans katA gene (DR1998) (Funayama et al. 1999), using primers whose sequences overlapped. Subsequently, the katA–hyg fusion product was joined to PCR fragments (Horton et al. 1989) derived from the sequence 1.0 kbp immediately upstream and 0.9 kbp immediately downstream of ddrA. This hybrid fragment was cloned into pGEM-T (Promega, Madison, Wisconsin, United States), creating pTNK205. pTNK205 was propagated in E. coli DH5α-MCR. The deletion of ddrA was accomplished by transforming (Earl et al. 2002b) an exponential-phase R1 culture with linear pTNK205. Hygromycin-resistant recombinants were selected on TGY plates containing 37.5 μg/ml hygromycin.

To confirm gene replacement, primers, which anneal outside the coding sequence of ddrA, were used to generate PCR fragments from genomic DNA from hygromycin-resistant colonies and R1. The purified PCR products were restricted with EcoRI and EcoRV. ال hyg gene contains an EcoRI site, but ddrA لا. ddrA contains an EcoRV site, but hyg لا. In the recombinant, designated TNK104, a single 1.3-kbp fragment, corresponding to the katA–hyg cassette was amplified, whereas there was no trace of the 0.85-kbp fragment, indicative of ddrA amplification (see Figure 1A). EcoRI cleaved the product amplified from TNK104 into 0.2-kbp and 1.1-kbp fragments, while the R1-derived product remained intact (Figure 1B). EcoRV digested the amplicon from R1 into fragments of 0.4 kbp and 0.45 kbp, but it did not affect the TNK104-derived product (Figure 1C). We conclude that TNK104 carries a deletion of the ddrA coding sequence marked by the katA–hyg cassette and that the strain is homozygous for the deletion.

ال recA deletion strain TNK106 was constructed in a manner similar to that of TNK104. Initially, the katA promoter of D. radiodurans was fused to the chloramphenicol acetyltransferase gene (cat) from pBC (Stratagene, La Jolla, California, United States). This drug cassette was then spliced to PCR products corresponding to genomic DNA sequences 1.6 kbp upstream and 1.2 kbp downstream of recA by overlap extension, before being cloned into pGEM-T. The resulting plasmid was designated pTNK210. An exponential-phase R1 culture was transformed with the replacement cassette from pTNK210, and chloramphenicol-resistant recombinants were selected on TGY plates containing 3 μg/ml chloramphenicol. Genomic DNA of each recombinant was amplified to determine if the recA coding region was deleted. Purified PCR products amplified using primers that anneal to sequences flanking recA were treated with PvuII and BglII. ال قط gene carries a PvuII site, but recA لا. recA contains a BglII site, but قط لا. A 1.3-kbp fragment, corresponding to the katA–cat cassette, was obtained from a recombinant designated TNK106, but DNA from this recombinant did not generate the 1.5-kbp fragment corresponding to recA (Figure 1A). Amplifications of genomic DNA from R1 only produced the 1.5-kbp fragments (Figure 1A). The 1.3-kbp PCR product from TNK106 was cleaved by PvuII to 0.5-kbp and 0.8-kbp fragments, whereas the 1.5 kbp from R1 remained intact (Figure 1C). BglII cut the R1-derived 1.5 kbp to fragments of 0.45 kbp and 1.05 kbp, but not the product from TNK106 (Figure 1C). We conclude that recA has been replaced by katA–cat in TNK106 and that the strain is homozygous for this allele. TNK110 is a double mutant in which recA و ddrA are deleted. This strain was constructed by deleting recA from TNK104 using the protocol described for the creation of TNK106. The construct was verified by the scheme used to identify ddrA deletion in TNK104 and recA deletion in TNK106 (see Figures 1A and 1C).

Pulsed-field gel electrophoresis.

After irradiation at 5.0 kGy, cells were collected by centrifugation (6,000g, 15 min, 4 °C) and resuspended in either TGY broth or 10 mM MgSO4 solution, before being placed in a shaking incubator at 30 °C for 24 h. Aliquots of these cultures were removed at various time points, and cells were washed in 0.9% NaCl and suspended in 0.125 M EDTA (pH 8.0) at a density of 5 × 10 8 cells/ml. The suspensions were mixed with low-melting-point agarose (Sigma) to obtain a final concentration of 0.8% agarose. Agarose blocks containing the cell suspension were incubated overnight at 37 °C in 0.05 M EDTA (pH 7.5) containing 1 mg/ml of lysozyme. After lysozyme treatment, agarose plugs were placed in ESP buffer (EDTA 0.5 M [pH 9–9.5], 1% lauroyl sarcosine, 1 mg/ml proteinase K) at 50 °C for 6 h, followed by a 2-d incubation at 37 °C. Prior to digestion with restriction enzymes, agarose plugs were washed once with TE buffer (pH 7.5) containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and then four times with TE buffer (pH 7.5). DNA contained within the agarose plugs was digested with 10 U of NotI restriction enzyme (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, United States) overnight at 37 °C. Restriction digests were analyzed on 1% agarose gels in 0.5X TBE, using a CHEF-MAPPER electrophoresis system (Bio-Rad, Hercules, California, United States) at 6 V/cm for 22 h at 12 °C, with a linear pulse ramp of 10–60 s and a switching angle of 120°. Gels were stained with water containing 0.5 μg/ml ethidium bromide for 20 min and destained for 10 min in water.

Quantitative real-time PCR.

The protocol followed was the same as that described previously (Earl et al. 2002a). Total RNA was extracted from 1-l cultures of irradiated and nonirradiated exponential-phase D. radiodurans cultures using TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio, United States) following manufacturer's instructions. Cell disruption was accomplished by adding 100 μ1 of 0.1-mm zirconia/silica beads (Biospec Products, Bartlesville, Oklahoma, United States) and TRI Reagent to the cell paste from 1 l of cells and vigorously agitating this mixture for 6 min with a vortex mixer. Two micrograms of each DNase I–treated, purified RNA sample was converted to cDNA using SUPERSCRIPT II RNase H − Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, California, United States) combined with 25 pmol of random hexamers to initiate synthesis. Conditions for this reaction followed the manufacturer's instructions.

Approximately 100 bp of unique sequence from the genes encoding DdrA (DR0423), RecA (DR2340), and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (DR1343) were amplified using the following primer sets: DR0423up (5′-GGTGCAGGACCGACTCGACGCCGTTTGCC-3′), DR0423down (5′-CCTCGCGGGTCACGCCGAGCACGGTCAGG-3′), DR2340up (5′-GTCAGCACCGGCAGCCTCAGCCTTGACCTC-3′), DR2340down (5′-GATGGCGAGGGCCAGGGTGGTCTTGC-3′), and DR1343up (5′-CTTCACCAGCCGCGAAGGGGCCTCCAAGC-3′), DR1343down (5′-GCCCAGCACGATGGAGAAGTCCTCGCC-3′). The PCR reaction (50 μ1) for amplifying these genes contained the appropriate primers at a final concentration of 0.2 μM, 1 μ1 of the cDNA template, and SYBR Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems, Foster City, California, United States). Amplifications were carried out by incubating reactions at 95 °C for 3 min prior to 40 cycles of 30 s at 95 °C, followed by 30 s at 65 °C and 30 s at 72 °C. Data were collected and analyzed at each 72-°C interval. Each 96-well plate consisted of standard curves for each primer set run in duplicate. Standard curves were constructed using cDNA obtained from the unirradiated wild-type organism. A dilution series (1 to 1 × 10 −4 ) of each experimental sample was generated and run in duplicate. Negative controls without a cDNA template were run on every plate analyzed. All assays were performed using the iCycler iQ Real-Time Detection System (Bio-Rad). All data were PCR-baseline subtracted before threshold cycle values were designated and before standard curves were constructed. Mean concentrations of the transcripts in each sample were calculated from the standard curves generated using the recA primer set. Induction levels were determined by dividing the calculated concentration of transcript from the irradiated sample by the concentration of transcript from the unirradiated sample for each strain. The mean concentration of the gap transcript, a housekeeping gene whose expression is unaffected by ionizing radiation, was also determined before and after irradiation for each strain.

DNA content measurement in TNK104 and R1 cells.

Overnight cultures growing in TGY medium were harvested at room temperature. Control culture aliquots were fixed with 1% toluene (final vol/vol), shaken vigorously, and stored at 4 °C. The fixed bacteria were diluted (1/10, 1/100, and 1/1,000) in 3 ml (final volume) of dilution buffer: 10 mM NaCl, 6.6 mM Na2وبالتالي4, 5 mM N′-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES pH 7.0). The remaining cultures were centrifuged for 20 min at 4 °C at 7,000 rpm. Bacterial pellets were washed twice and resuspended in 10 mM MgSO4 for γ irradiation. Cell suspensions were irradiated at 5,000 Gy and incubated at 30 °C for 120 h. Aliquots were removed immediately following irradiation, at 48 h, and at 120 h postirradiation. Cells were toluene-fixed as described above 100 μ1 of DAPI (stock solution 3 μg/ml) was added to each dilution tube and mixed. The fluorescence intensity was determined after excitation at 350 nm by measuring emission at 450 nm.

Cloning, overexpression, and purification of DdrA.

ال ddrA gene was amplified using the genomic DNA from D. radiodurans strain R1. PCR primers were designed according to the ddrA gene sequence annotated in the genomic bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). The gene was cloned in E. coli overexpressing plasmid pEAW298. DdrA-overproducing cells were lysed with lysozyme, and the protein was precipitated from the supernatant by adding ammonium sulfate to 30% saturation. The protein was purified with DEAE and hydroxyapatite chromatography to greater than 99% purity. The identity of the purified protein was confirmed by N-terminal sequencing (Protein and Nucleic Acid Chemistry Laboratory, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, United States) and accurate mass determination (Biotech Center, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, United States). The protein was transferred into the storage buffer (20 mM Tris-acetate, 80% cation [pH 7.5]/50% glycerol [w/v], 0.5 M NaCl, 0.1 mM EDTA, and 1 mM DTT) and stored at −80 °C.

Determination of the extinction coefficient for pure DdrA protein.

The extinction coefficient for DdrA protein was determined using a modification of a published procedure (Marrione and Cox 1995). UV absorbance spectra were measured with a Cary 300 dual-beam spectrophotometer (Varian, Palo Alto, California, United States). The temperature was maintained using a circulating water bath. Cell-path length and bandwidth were 1 cm and 0.5 nm, respectively. The extinction coefficient for native DdrA protein was determined in the storage buffer, by comparing the absorbance spectra of the native protein to the absorbance spectra of the protein denatured in 6 M guanidine hydrochloride (Gnd–HCl) in storage buffer. The extinction coefficients at 280 nm of glycyl- L -tyrosylglycine and ن-acetyl- L -tryptophanamide in 6 M GND–HCl are 1,280 M −1 cm −1 and 5,690 M −1 cm −1 , respectively (Edelhoch 1948). In the DdrA protein there are five tyrosine, five tryptophan, and two cysteine residues in a protein with a total molecular mass of 23 kDa. Even if all cysteine residues were involved in disulfide bonds, the contribution of cystine to the absorbance of DdrA protein is predicted to be less than 1% and was neglected from our calculations. The extinction coefficient at 280 nm for denatured DdrA protein in εdenat, 280 nm = 5 × 5,690 + 5 × 1,280 = 3.485 × 10 4 M −1 cm −1 . Absorbance spectra of native and denatured (6 M GND–HCl) DdrA protein were scanned at 25 °C, from 320 to 240 nm, for five different dilutions and with two different protein preparations. DdrA protein was diluted in storage buffer or storage buffer plus 6 M GND–HCl (final concentration) in a total volume of 80 μ1 and was preincubated at 25 °C for 5 min before scanning. Each dilution was carried out in triplicate, and the absorbance values at 280 nm were averaged. The concentrations of native and denatured protein were equal to each other in each scan at each dilution. The extinction coefficient of native DdrA protein at 280 nm was determined according to the expression (Gill and von Hippel 1989): εnat, 280 nm = εdenat, 280 nm × Absnat, 280 nm/Absdenat, 280 nm. We used five determinations with two different protein preparations, yielding an average extinction coefficient of εnat, 280 nm = 2.8728 ± 0.1999 × 10 4 M −1 cm −1 in storage buffer at 25 °C. ال280/A260 ratio for the native DdrA protein is 1.575 ± 0.00091. The error in both cases is 1 s.d.

DNA binding assay.

The duplex oligonucleotide with a 3′ single-stranded extension was hairpin-forming oligonucleotide A (5′-TTA ACG ACC GTC GAC CTG CAG GTC GAC GGT CGT TAA CGT CTC TCA GAT TGT-3′), which was labeled at the 3′ terminus with [α- 32 P]ddATP, using terminal transferase. After labeling, hairpin formation generated an 18-bp duplex hairpin with a 16-nt 3′ extension. The duplex oligonucleotide with a 5′ single-stranded extension was hairpin-forming oligonucleotide B (5′-CGT CTC TCA GAT TGT TTA ACG ACC GTC GAC CTG CAG GTC GAC GGT CGT TAA-3′). The oligo was labeled at the 5′ end using [γ- 32 P] ATP and polynucleotide kinase. After labeling, hairpin formation generated a DNA with 18 bp in the hairpin duplex and a 15-nt 5′ extension. A blunt-ended duplex DNA fragment was prepared by annealing oligonucleotide C (5′-GGT CTT TCA AAT TGT TTA AGG AAG AAA CTA ATG CTA GCC ACG GTC CGA GCC-3′) 32 P-labeled at its 5′ end, with unlabeled oligonucleotide D (5′-GGC TCG GAC CGT GGC TAG CAT TAG TTT CTT CCT TAA ACA ATT TGA AAG ACC-3′). The single-stranded oligonucleotide was the end-labeled oligo C. EMSAs for DNA binding were carried out in 15-μl reaction mixtures containing the reaction buffer (40 mM Tris-acetate [pH 7.5],10% glycerol [w/v], 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) and 0.7 nM (60 nM nt) 32 P-labeled duplex DNA. The reaction was initiated by adding the DdrA protein to the required concentration. The reaction mixture was incubated at 30 °C for 30 min and loaded onto a 10% native polyacrylamide gel. The electrophoresis was performed in 1X TBE (89 mM Tris-borate [pH8.3], 2 mM EDTA) at room temperature. After the electrophoresis was completed, the gel was dried and exposed with a Phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, United States).

Identification of DdrA protein in DNA–protein complex.

The general strategy of this experiment was to incubate a DNA duplex with a 3′ extension with DdrA protein, resolve the protein complex in native PAGE, excise the complex from the gel, extract the protein from the slice, and analyze the protein in SDS-PAGE. If the protein is DdrA, it will comigrate with DdrA protein in SDS-PAGE.

A 32 P-labeled oligonucleotide (30 nt 5′-GTG CGC TCC GAG CTC AGC TAC CGC GAG GCC-3′) was annealed with a longer unlabeled oligonucleotide (50 nt 5′-GGC CTC GCG GTA GCT GAG CTC GGA GCG CAC GAT TCG CAC TGC TGA TGT TC-3′). Annealing was carried out in a 40-μ1 solution containing 0.5 μM of each oligonucleotide in 25 mM Tris HCl (pH 8), 50 mM NaCl, and 12.5 mM MgC12. The solution was heated briefly at 100 °C, by transferring the closed tube to a beaker of boiling water, and allowed to cool slowly overnight. The tube was refrigerated for several hours and then stored at −20 °C until use.

The resulting labeled duplex DNA with a 3′ extension (0.7 nM) was incubated with 4 μM DdrA protein under the DNA binding conditions described above. The mixture was loaded onto a 10% native polyacrylamide gel. Electrophoresis was performed as described above. The gel was exposed with X-ray film to map the position of the protein–duplex complex. The complex was cut out of the gel. The gel slice was frozen in liquid nitrogen and crushed into a slurry with a plastic stick. The slurry was mixed with an equal volume of SDS-PAGE loading buffer and boiled for 3 min. The mixture was loaded onto a 12% SDS-PAGE gel and the protein present compared to molecular weight standards and purified DdrA protein.

Exonuclease assay.

The duplex with a 3′ extension was prepared by annealing oligonucleotide A (5′-CTA GCA TTA GTT TCT TCC TTA AAC AAT TTG AAA GAC C-3′), which was labeled at the 5′ terminus with [γ- 32 P]ATP, and cold oligonucleotide B (5′-GGT CTT TCA AAT TGT TTA AGG AAG AAA CTA ATG CTA GCC ACG GTC CGA GCC-3′). The annealing generated a 14-nt 3′ extension at one end of the short duplex. Before adding the exonuclease, the 32 P-labeled duplex (60 nM nt) was preincubated with the DdrA protein at the indicated concentration in 15 μl of the exonuclease reaction buffer (40 mM Tris-acetate [pH 7.5], 0.1 M NaCl, 10 mM MgC12, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol) at room temperature for 10 min. In the control experiment, the DdrA protein was replaced with bovine serum albumin. Exonuclease I was added to 200 U/ml and the reaction mixture was incubated at 37 °C for 30 min. After the incubation was complete, the reactions 5 and 6 were deproteinized with 0.2% SDS and 0.2 mg/ml proteinase K at 37 °C for 15 min. The DNA–protein complexes were resolved in the native polyacrylamide gel as above.


Structural and biochemical evidence supporting poly ADP-ribosylation in the bacterium Deinococcus radiodurans

Poly-ADP-ribosylation, a post-translational modification involved in various cellular processes, is well characterized in eukaryotes but thought to be devoid in bacteria. Here, we solve crystal structures of ADP-ribose-bound poly(ADP-ribose)glycohydrolase from the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans (DrPARG), revealing a solvent-accessible 2'-hydroxy group of ADP-ribose, which suggests that DrPARG may possess endo-glycohydrolase activity toward poly-ADP-ribose (PAR). We confirm the existence of PAR in D. radiodurans and show that disruption of DrPARG expression causes accumulation of endogenous PAR and compromises recovery from UV radiation damage. Moreover, endogenous PAR levels in D. radiodurans are elevated after UV irradiation, indicating that PARylation may be involved in resistance to genotoxic stresses. These findings provide structural insights into a bacterial-type PARG and suggest the existence of a prokaryotic PARylation machinery that may be involved in stress responses.

بيان تضارب المصالح

يعلن الكتاب لا تضارب المصالح.

الأرقام

Crystal structures of apo and…

Crystal structures of apo and ADP-ribose-bound forms of DrPARG. أ , ب Structure…

Detailed view of the ADP-ribose…

Detailed view of the ADP-ribose binding pocket of DrPARG. أ detailed comparison of…

Detection of endogenous poly-ADP-ribose (PAR)…

Detection of endogenous poly-ADP-ribose (PAR) in Deinococcus radiodurans . أ PAR formation assayed…

Structural model of DrPARG-PAR (poly-ADP-ribose)…

Structural model of DrPARG-PAR (poly-ADP-ribose) complex in endo-glycohydrolase mode. أ Solvent-accessible surface of…

Enzyme activity of DrPARG. أ…

Enzyme activity of DrPARG. أ Michaelis–Menten plots of wild-type (WT), T267R, T267K, and…


Anderson, A. W., Nordon, H. C., Cain, R. F., Parrish, G. & Duggan, D. Studies on a radio-resistant micrococcus. I. Isolation, morphology, cultural characteristics, and resistance to γ radiation. Food Technol. 10, 575–578 (1956).

Hensel, R., Demharter, W., Kandler, O., Kroppenstedt, R. M. & Stackebrandt, E. Chemotaxonomic and molecular-genetic studies of the genus Thermus: evidence for a phylogenetic relationship of ثيرموس أكواتيكوس و Thermus ruber للجنس دينوكوكس. كثافة العمليات J. Syst. Bacteriol. 36, 444–453 (1986).

Murray, R. G. E. in دليل بيرجي لعلم الجراثيم النظامي (eds Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E. & Holt, J. G.) 1035–1043 (Williams & Wilkins, Baltimore, 1986).

Rainey, F. A., Nobre, M. F., Schumann, P., Stackebrandt, E. & da Costa, M. S. Phylogenetic diversity of the deinococci as determined by 16S ribosomal DNA sequence comparison. كثافة العمليات J. Syst. Bacteriol. 47, 510–514 (1997).

Weisburg, W. G., Giovannoni, S. J. & Woese, C. R. The Deinococcus–Thermus phylum and the effect of rRNA composition on phylogenetic tree construction. النظام. تطبيق ميكروبيول. 11, 128–134 (1989).

Woese, C. R. Bacterial evolution. ميكروبيول. القس. 51, 221–271 (1987).

Woese, C. R., Stackebrandt, E., Macke, T. J. & Fox, G. E. A phylogenetic definition of the major eubacterial taxa. النظام. تطبيق ميكروبيول. 61, 143–151 (1985).

Brooks, B. W. & Murray, R. G. E. Nomenclature for “Micrococcus radiodurans” and other radiation-resistant cocci: Deinococcaceae fam. نوفمبر و دينوكوكس الجنرال. nov., including five species. كثافة العمليات J. Syst. Bacteriol. 31, 353–360 (1981).

United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation. Effects of atomic radiation. Report A/RES/37/87. (New York, 1982).

Mattimore, V. & Battista, J. R. Radioresistance of Deinococcus radiodurans: functions necessary to survive ionizing radiation are also necessary to survive prolonged desiccation. J. باكتيريول. 178, 633–637 (1996).

Billi, D., Friedmann, E. I., Hofer, K. G., Caiola, M. G. & Ocampo-Friedmann, R. Ionizing-radiation resistance in the desiccation-tolerant cyanobacterium Chroococcidiopsis. تطبيق بيئة. ميكروبيول. 66, 1489–1492 (2000).

DiRuggiero, J., Santangelo, N., Nackerdien, Z., Ravel, J. & Robb, F. T. Repair of extensive ionizing-radiation DNA damage at 95 degrees C in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. J. باكتيريول. 179, 4643–4645 (1997).

Jolivet, E., Corre, E., L'Haridon, S., Forterre, P. & Prieur, D. Thermococcus marinus ص. نوفمبر و Thermococcus radiotolerans ص. nov., two hyperthermophilic archaea from deep-sea hydrothermal vents that resist ionizing radiation. Extremophiles 8, 219–227 (2004).

Jolivet, E., L'Haridon, S., Corre, E., Forterre, P. & Prieur, D. Thermococcus gammatolerans ص. nov., a hyperthermophilic archaeon from a deep-sea hydrothermal vent that resists ionizing radiation. كثافة العمليات J. Syst. Evol. ميكروبيول. 53, 847–851 (2003).

Jolivet, E. et al. Physiological responses of the hyperthermophilic archaeon “Pyrococcus abyssi” to DNA damage caused by ionizing radiation. J. باكتيريول. 185, 3958–3961 (2003).

Battista, J. R. & Rainey, F. A. in دليل بيرجي لعلم الجراثيم النظامي (eds Boone, D. R. & Castenholz, R. W.) 395–414 (Springer, New York, 2001).

Hirsch, P. et al. Deinococcus frigens ص. nov., Deinococcus saxicola ص. نوفمبر و Deinococcus marmoris ص. nov., low temperature and draught-tolerating, UV-resistant bacteria from continental Antarctica. النظام. تطبيق ميكروبيول. 27, 636–645 (2004).

Suresh, K., Reddy, G. S., Sengupta, S. & Shivaji, S. Deinococcus indicus ص. nov., an arsenic-resistant bacterium from an aquifer in West Bengal, India. كثافة العمليات J. Syst. Evol. ميكروبيول. 54, 457–461 (2004).

Corrections and Clarifications, علم 303, 766 (2004).

White, O. et al. Genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans R1. علم 286, 1571–1517 (1999). The description of the D. radiodurans R1 genome sequence it has served as a reference for almost all research on the species since 1999.

Lin, J. et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Deinococcus radiodurans. علم 285, 1558–1562 (1999).

Hansen, M. T. Multiplicity of genome equivalents in the radiation-resistant bacterium Micrococcus radiodurans. J. باكتيريول. 134, 71–75 (1978).

Harsojo, Kitayama, S. & Matsuyama, A. Genome multiplicity and radiation resistance in Micrococcus radiodurans. J. Biochem. (Tokyo) 90, 877–880 (1981).

Moseley, B. E. & Mattingly, A. Repair of irradiation transforming deoxyribonucleic acid in wild type and a radiation-sensitive mutant of Micrococcus radiodurans. J. باكتيريول. 105, 976–983 (1971).

Krasin, F. & Hutchinson, F. Repair of DNA double-strand breaks in الإشريكية القولونية, which requires recA function and the presence of a duplicate genome. جيه مول. بيول. 116, 81–98 (1977).

Burrell, A. D., Feldschreiber, P. & Dean, C. J. DNA-membrane association and the repair of double breaks in X-irradiated Micrococcus radiodurans. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 247, 38–53 (1971).

Daly, M. J. et al. Accumulation of Mn(II) in Deinococcus radiodurans facilitates γ-radiation resistance. علم 306, 1025–1028 (2004). The authors show that Mn(II) is necessary for the ionizing-radiation resistance of D. radiodurans and provide evidence that elevated intracellular Mn might also protect other species.

Gerard, E., Jolivet, E., Prieur, D. & Forterre, P. DNA protection mechanisms are not involved in the radioresistance of the hyperthermophilic archaea Pyrococcus abyssi و P. furiosus. مول. جينيه. علم الجينوم 266, 72–78 (2001).

Daly, M. J., Ling, O. & Minton, K. W. Interplasmidic recombination following irradiation of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. باكتيريول. 176, 7506–7515 (1994).

Daly, M. J. & Minton, K. W. Interchromosomal recombination in the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. باكتيريول. 177, 5495–5505 (1995).

Daly, M. J. & Minton, K. W. An alternative pathway of recombination of chromosomal fragments precedes recA-dependent recombination in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. باكتيريول. 178, 4461–4471 (1996).

Daly, M. J. & Minton, K. W. Recombination between a resident plasmid and the chromosome following irradiation of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. الجين 187, 225–259 (1997).

Daly, M. J., Ouyang, L., Fuchs, P. & Minton, K. W. في الجسم الحي damage and recA-dependent repair of plasmid and chromosomal DNA in the radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans. J. باكتيريول. 176, 3508–3517 (1994).

Minton, K. W. DNA repair in the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. مول. ميكروبيول. 13, 9–15 (1994).

Minton, K. W. Repair of ionizing-radiation damage in the radiation resistant bacterium Deinococcus radiodurans. موتات. الدقة. 363, 1–7 (1996).

Minton, K. W. & Daly, M. J. A model for repair of radiation-induced DNA double-strand breaks in the extreme radiophile Deinococcus radiodurans. بيوسيس 17, 457–464 (1995).

Mortimer, R. K. Radiobiological and genetic studies on a polyploid series (haploid to hexaploid) of خميرة الخميرة. رديات. الدقة. 66, 158–169 (1958).

Akerlund, T., Nordstrom, K. & Bernander, R. Analysis of cell size and DNA content in exponentially growing and stationary-phase batch cultures of الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 177, 6791–6797 (1995).

Maldonado, R., Jimenez, J. & Casadesus, J. Changes of ploidy during the Azotobacter vinelandii growth cycle. J. باكتيريول. 176, 3911–3919 (1994).

Levin-Zaidman, S. et al. Ringlike structure of the Deinococcus radiodurans genome: a key to radioresistance? علم 299, 254–256 (2003). The first formal discussion of the unusual nucleoid architecture associated with this species. Some of the conclusions have been controversial, stimulating several subsequent studies.

Zimmerman, J. M. & Battista, J. R. A ring-like nucleoid is not necessary for radioresistance in the Deinococcaceae. BMC Microbiol. 5, 17 (2005).

Archibald, F. S. & Fridovich, I. Manganese, superoxide dismutase, and oxygen tolerance in some lactic acid bacteria. J. باكتيريول. 146, 928–936 (1981).

Archibald, F. S. & Fridovich, I. Manganese and defenses against oxygen toxicity in اكتوباكيللوس بلانتاروم. J. باكتيريول. 145, 442–451 (1981).

Ghosal, D. et al. How radiation kills cells: survival of Deinococcus radiodurans و Shewanella oneidensis under oxidative stress. FEMS Microbiol. القس. 29, 361–375 (2005).

Englander, J. et al. DNA toroids: framework for DNA repair in Deinococcus radiodurans and in germinating bacterial spores. J. باكتيريول. 186, 5973–5977 (2004).

Wilson, R. W. & Bloomfield, V. A. Counterion-induced condesation of deoxyribonucleic acid. a light-scattering study. الكيمياء الحيوية 18, 2192–2196 (1979).

Dean, C. J., Feldschreiber, P. & Lett, J. T. Repair of X-ray damage to the deoxyribonucleic acid in Micrococcus radiodurans. طبيعة سجية 209, 49–52 (1966).

Lett, J. T., Feldschreiber, P., Little, J. G., Steele, K. & Dean, C. J. The repair of X-ray damage to the deoxyribonucleic acid in Micrococcus radiodurans: a study of the excision process. بروك. R. Soc. لوند. ب بيول. علوم. 167, 184–201 (1967).

Moseley, B. E. & Copland, H. J. R. Involvement of a recombination repair function in disciplined cell division of Micrococcus radiodurans. J. Gen. Microbiol. 86, 343–357 (1975).

Kastan, M. B. & Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. طبيعة سجية 432, 316–323 (2004).

Tanaka, M. et al. Deinococcus radiodurans' transcriptional response to ionizing radiation and desiccation reveals novel proteins that contribute to extreme radioresistance. علم الوراثة 168, 21–33 (2004). This manuscript identifies five 'hypothetical proteins' that contribute significantly to D. radiodurans radioresistance in RecA-dependent and RecA-independent processes, indicating that this species uses novel mechanisms to facilitate DNA repair.

Harris, D. R. et al. Preserving genome integrity: the DdrA protein of Deinococcus radiodurans R1. بلوس بيول. 2, 1629–1639 (2004). The DdrA protein protects the 3′ ends of DNA fragments في المختبر و في الجسم الحي . This manuscript provides evidence that mechanisms that limit DNA degradation post-irradiation contribute to radioresistance in this species.

Iyer, L. M., Koonin, E. V. & Aravind, L. Classification and evolutionary history of the single-strand annealing proteins, RecT, Redbeta, ERF and RAD52. علم الجينوم BMC 3, 8 (2002).

Weller, G. R. et al. Identification of a DNA nonhomologous end-joining complex in bacteria. علم 297, 1686–1689 (2002).

Lecointe, F., Shevelev, I. V., Bailone, A., Sommer, S. & Hubscher, U. Involvement of an X family DNA polymerase in double-stranded break repair in the radioresistant organism Deinococcus radiodurans. مول. ميكروبيول. 53, 1721–1730 (2004).

Narumi, I. et al. PprA: a novel protein from Deinococcus radiodurans that stimulates DNA ligation. مول. ميكروبيول. 54, 278–285 (2004). PprA is a protein of unknown function that is necessary for radioresistance in D. radiodurans . The protein will bind to the ends of double-stranded DNA and stimulate DNA ligation. The authors suggest that PprA helps mediate NHEJ in this species.

Haber, J. E. Partners and pathways repairing a double-strand break. اتجاهات الجينات. 16, 259–264 (2000).

Kim, J. I. et al. RecA protein from the extremely radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans: expression, purification, and characterization. J. باكتيريول. 184, 1649–1660 (2002).

Kim, J. I. & Cox, M. M. The RecA proteins of Deinococcus radiodurans و الإشريكية القولونية promote DNA strand exchange via inverse pathways. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 99, 7917–7921 (2002).

Satoh, K. et al. Characterization of RecA424 and RecA670 proteins from Deinococcus radiodurans. J. Biochem. (Tokyo) 131, 121–129 (2002).

Lipton, M. S. et al. Global analysis of the Deinococcus radiodurans proteome by using accurate mass tags. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 99, 11049–11054 (2002).

ليو ، واي وآخرون. Transcriptome dynamics of Deinococcus radiodurans recovering from ionizing radiation. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 4191–4196 (2003).

ماكاروفا ، ك.س وآخرون. Genome of the extremely radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans viewed from the perspective of comparative genomics. ميكروبيول. مول. بيول. القس. 65, 44–79 (2001).

Eggington, J. M., Haruta, N., Wood, E. A. & Cox, M. M. The single-stranded DNA-binding protein of Deinococcus radiodurans. BMC Microbiol. 4, 2 (2004).

Bernstein, D. A. et al. Crystal structure of the Deinococcus radiodurans single-stranded DNA-binding protein suggests a mechanism for coping with DNA damage. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 101, 8575–8580 (2004).

Wang, J. & Julin, D. A. DNA helicase activity of the RecD protein from Deinococcus radiodurans. J. بيول. تشيم. 279, 52024–52032 (2004).

Makharashvili, N., Koroleva, O., Bera, S., Grandgenett, D. P. & Korolev, S. A novel structure of DNA repair protein RecO from Deinococcus radiodurans. Structure (Camb.) 12, 1881–1889 (2004).

Leiros, I., Timmins, J., Hall, D. R. & McSweeney, S. Crystal structure and DNA-binding analysis of RecO from Deinococcus radiodurans. EMBO J. 24, 906–918 (2005).

Makarova, K. S., Wolf, Y. I., White, O., Minton, K. & Daly, M. J. Short repeats and IS elements in the extremely radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans and comparison to other bacterial species. الدقة. ميكروبيول. 150, 711–724 (1999).

Cobbe, N. & Heck, M. M. Review: SMCs in the world of chromosome biology — from prokaryotes to higher eukaryotes. J. الهيكل. بيول. 129, 123–143 (2000).

Jessberger, R. SMC proteins at the crossroads of diverse chromosomal processes. الحياة IUBMB 55, 643–652 (2003).

Volkov, A., Mascarenhas, J., Andrei-Selmer, C., Ulrich, H. D. & Graumann, P. L. A prokaryotic condensin/cohesin-like complex can actively compact chromosomes from a single position on the nucleoid and binds to DNA as a ring-like structure. مول. زنزانة. بيول. 23, 5638–5650 (2003).

Lisby, M. & Rothstein, R. DNA repair: keeping it together. بالعملة. بيول. 14, R994–R996 (2004).

Freifelder, D. & Trumbo, B. Matching of single-strand breaks to form double-strand breaks in DNA. البوليمرات الحيوية 7, 681–693 (1969).

Lewis, L. K., Kirchner, J. M. & Resnick, M. A. Requirement for end-joining and checkpoint functions, but not RAD52-mediated recombination, after سابقة بمعنى البيئةRI endonuclease cleavage of خميرة الخميرة الحمض النووي. مول. زنزانة. بيول. 18, 1891–1902 (1998).

Lewis, L. K. & Resnick, M. A. Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in خميرة الخميرة. موتات. الدقة. 451, 71–89 (2000).

Lewis, L. K., Westmoreland, J. W. & Resnick, M. A. Repair of endonuclease-induced double-strand breaks in خميرة الخميرة: essential role for genes associated with nonhomologous end-joining. علم الوراثة 152, 1513–1529 (1999).

Haber, J. E. & Leung, W. Y. Lack of chromosome territoriality in yeast: promiscuous rejoining of broken chromosome ends. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 93, 13949–13954 (1996).

Heitman, J., Zinder, N. D. & Model, P. Repair of the الإشريكية القولونية chromosome after في الجسم الحي scission by the سابقة بمعنى البيئةRI endonuclease. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 86, 2281–2285 (1989).

Green, P. N. & Bousfield, I. J. Emendation of ميثيلوباكتيريوم (Patt, Cole, and Hanson 1976) Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. نوفمبر corrig. Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. نوفمبر corrig. و Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. نوفمبر كثافة العمليات J. Syst. Bacteriol. 33, 875–877 (1983).

Ito, H. & Iizuka, H. Taxonomic studies on a radio-resistant Pseudomonas. ثاني عشر. Studies on the microorganisms of cereal grain. الزراعية. بيول. تشيم. 35, 1566–1571 (1971).

Nishimura, Y., Uchida, K., Tanaka, K., Ino, T. & Ito, H. Radiation sensitivities of Acinetobacter strains isolated from clinical sources. J. Basic Microbiol. 34, 357–360 (1994).

Phillips, R. W. et al. Kineococcus radiotolerans ص. nov., a radiation-resistant, Gram-positive bacterium. كثافة العمليات J. Syst. Evol. ميكروبيول. 52, 933–938 (2002).

Collins, M. D., Hutson, R. A., Grant, I. R. & Patterson, M. F. Phylogenetic characterization of a novel radiation-resistant bacterium from irradiated pork: description of Hymenobacter actinosclerus ص. نوفمبر كثافة العمليات J. Syst. Evol. ميكروبيول. 50, 731–734 (2000).

Ferreira, A. C. et al. Characterization and radiation resistance of new isolates of Rubrobacter radiotolerans و Rubrobacter xylanophilus. Extremophiles 3, 235–238 (1999).

Ito, H., Watanabe, H., Takeshia, M. & Iizuka, H. Isolation and identification of radiation-resistant cocci belonging to the genus دينوكوكس from sewage sludges and animal feeds. الزراعية. بيول. تشيم. 47, 1239–1247 (1983).


شاهد الفيديو: #BACTERIOPHAGES #BACTERIA #TRANSDUCTION (كانون الثاني 2022).