معلومة

16.4: كيف يتم الاحتفاظ بالبروتينات الغشائية في الأغشية - علم الأحياء


يتكون المجال الكارثي للماء لبروتينات الغشاء المتكامل من منطقة أو أكثر من المناطق الهيدروفيلية التي تتفاعل مع الأجزاء الداخلية الكارهة للماء للأغشية. تميل المجالات المحبة للماء إلى امتلاك بنية ثلاثية مع أسطح محبة للماء ، وبالتالي فهي تواجه العصارة الخلوية المائية والجزء الخارجي من الخلية. اثنين من البروتينات عبر الغشاء تم رسمها أدناه.

يعبر البروتين الموجود على اليسار الغشاء مرة واحدة ، بينما يعبر البروتين الموجود على اليمين الغشاء ثلاث مرات. كيف يتم إدخال بروتين عبر الغشاء في الغشاء أثناء التوليف يحدد مواقع نهايتيه N و C. يمكن لبروتينات الغشاء في الواقع عبور غشاء أكثر من مرة ، والذي يحدد أيضًا موقع طرفيه N و C. ينتهي الطرف N من عديد ببتيد غشاء البلازما دائمًا بالتعرض للخارج للخلية. المجالات الحلزونية ألفا التي تثبت البروتينات في الأغشية هي في الغالب غير قطبية وكارهة للماء. كمثال ، ضع في اعتبارك الأحماض الأمينية في المجال الحلزوني ألفا لبروتين خلايا الدم الحمراء جليكوفرين أوهو بروتين غشائي يمنع خلايا الدم الحمراء من التكتل أو التكتل في الدورة الدموية. واحد جلايكوفرين A عديد ببتيد مع حلزون ألفا العابر للغشاء الكارتوني مسعور أدناه. يتزاوج الجليكوفرين A مونومرات لتكوين ثنائيات في غشاء البلازما.

قد تشتمل البروتينات التي تمتد على الأغشية عدة مرات على أحماض أمينية ذات سلاسل جانبية قطبية مشحونة ، بشرط أن تتفاعل هذه السلاسل الجانبية بين الحلزونات بحيث تكون محمية من بيئة الأحماض الدهنية في الغشاء. بسبب هذه التفاعلات المحبة للماء ، يمكن لهذه البروتينات أن تخلق المسام ل المواصلات من الجزيئات والأيونات القطبية. سنرى بعض هذه البروتينات لاحقًا. بروتينات الغشاء المتكامل التي لا تمتد على الغشاء لها أيضًا مجال حلزوني مسعور يثبتها في الغشاء ، بينما تتفاعل مجالاتها المحبة للماء عادةً مع الجزيئات داخل الخلايا أو خارج الخلية على سبيل المثال ، الاحتفاظ بالخلايا في مكانها لإعطاء الخلايا والأنسجة هيكلها ، إلخ.

إن وجود نطاقات ألفا حلزونية كارهة للماء في البروتينات عبر الغشاء يجعل عزلها عن الأغشية في صورة نشطة بيولوجيًا أمرًا صعبًا إن لم يكن مستحيلًا. على النقيض من ذلك ، فإن عديد الببتيد المحيطي السيتوكروم ج ينفصل بسهولة عن الغشاء الكريستالي ، مما يسهل تنقيته. لسنوات عديدة ، أدى عدم القدرة على تنقية حاملات الإلكترون الغشائية الكريستالية الأخرى في شكل نشط بيولوجيًا إلى الحد من فهمنا لهيكل ووظيفة نظام نقل الإلكترون في الميتوكوندريا.

المجالات الحلزونية ألفا الكارهة للماء هي في الواقع أ السمة المميزة من البروتينات الممتدة للغشاء. حتى أنه من الممكن تحديد البنية الأولية لعديد ببتيد مشفر بواسطة جين قبل عزل البروتين نفسه. على سبيل المثال ، بمعرفة تسلسل الحمض النووي للجين ، يمكننا استنتاج تسلسل الحمض الأميني للبروتين المشفر بواسطة الجين. أ كره الماء يمكن أن يخبرنا تحليل تسلسل الأحماض الأمينية المستنتج ما إذا كان من المحتمل أن يكون البروتين بروتينًا غشائيًا. دعونا نلقي نظرة على المعالجة المائية (كره الماء) مؤامرة (أدناه).

لمعرفة كيف يمكن لخطة المعالجة المائية أن تتنبأ بما إذا كان البروتين هو بروتين غشائي ، تحقق من الرابط أدناه.


AFM: أداة نانوية في بيولوجيا الغشاء

الأغشية الخلوية حيوية للحياة. إنها تحصر الخلايا ومقصورات العصارة الخلوية وتشارك في كل عملية خلوية تقريبًا. تشكل الأغشية الخلوية ملامسات خلوية وتصاقات بؤرية ، وتربط الهيكل الخلوي ، وتولد تدرجات للطاقة ، وتحول الطاقة ، وتحول الإشارات ، وتحرك الخلايا ، وتشكل مقصورات لتجميع بروتينات الغشاء المختلفة في كيانات وظيفية. ولكن كيف تؤدي الأغشية الخلوية هذه المهام؟ كيف تبدو آلات الأغشية الخلوية ، وكيف يتم التحكم فيها وتوجيهها؟ يسمح الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) بمراقبة الأسطح البيولوجية في بيئتها الأصلية بمعدل إشارة إلى ضوضاء أعلى من أي تقنية مجهرية ضوئية. مع الدقة المكانية التي تقترب من 1 نانومتر تقريبًا ، يمكن لـ AFM تحديد التجميعات فوق الجزيئية والبنية المميزة والتشكيل الوظيفي لبروتينات الغشاء الأصلية. في السنوات الأخيرة ، تطورت AFM من تطبيقات التصوير إلى "مختبر على طرف" متعدد الوظائف يسمح بمراقبة آليات الأغشية الخلوية والتلاعب بها. في وضع التحليل الطيفي للقوة ، يكتشف AFM التفاعلات بين خليتين منفردتين بدقة جزيئية. يمكن أيضًا استخدام التحليل الطيفي للقوة لسبر المرونة المحلية والمجموعات الكيميائية ومواقع مستقبلات الخلايا الحية. تحدد التطبيقات الأخرى التفاعلات الجزيئية التي تحرك طي بروتين الغشاء وتجميعه وتحويله بين الحالات الوظيفية. من الممكن أيضًا فحص مشهد الطاقة للتفاعلات الجزيئية الحيوية ، بالإضافة إلى مسارات التفاعل والأعمار المرتبطة والطاقة الحرة. في هذا الاستعراض ، نقدم نكهة للفرص الرائعة التي يوفرها استخدام AFM كأداة للتكنولوجيا الحيوية النانوية في بيولوجيا الأغشية الحديثة.


مضمنة في طبقة ثنائيةيمكن تضمينها جزئيًا = بروتينات رتيبةيمكن أن تمتد الغشاء بالكامل = بروتينات الغشاء الممتد أو عبر الغشاءيمكن أن تكون البروتينات الغشائية أحادية التمرير أو متعددة التمريرات

لا تخترق الطبقة الدهنية الثنائية ، بل ضع دهونًا تساهميًا في نهاية السيستينمثال على تعديلات الدهون:- مجموعات Prenyl ومجموعات farnesyl و geranylgeranyl- يمكن أن يلتصق الجليكوفوسفاتيدينوسيتول (GPI) بنهاية الكربوكسي لبعض بروتينات الغشاء

ثبت البروتين في الغشاء


مراجع

Bendre AD ، Peters PJ ، Kumar J (2021) رؤى حديثة حول بنية ووظيفة بروتينات الغشاء الفطري التي يسهلها Cryo-EM. J غشاء بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-021-00179-w

Bodosa J، Iyer SS، Srivastava A (2020) تقسيم البروتين التفضيلي في الغشاء البيولوجي مع تعايش السائل المرتب وسلوك الطور المضطرب السائل: مبادئ التصميم الأساسية. ي ميمبر بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-020-00150-1

Bondar AN (2020) ارتباط دهن الفوسفاتيديل جلييرول في الموقع النشط للبروتياز داخل الغشاء. ج ميمبر بيول 253 (6): 563-576

Bose D ، Chakrabarti A (2020) وظائف متعددة من سبيكترين: تأثيرات متقاربة. ج ميمبر بيول 253 (6): 499-508

Buwa N ، Mazumdar D ، Balasubramanian N (2020) Caveolin1 التيروزين -14 الفسفرة: دور في الاستجابة الخلوية للإشارات الميكانيكية. J Membr Biol 253 (6): 509-534

Cheerla R، Ayappa KG (2020) دراسة الديناميات الجزيئية لإعادة تنظيم الدهون والكوليسترول بسبب ارتباط الغشاء وتكوين المسام بواسطة Listeriolysin O.J Membr Biol 253 (6): 535-550

Crilly SE ، Puthenveedu MA (2020) ، إشارات GPCR المجزأة من الأغشية داخل الخلايا. ي ميمبر بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-020-00158-7

Dadhich R ، Kapoor S (2020) جوانب مختلفة من الدهون المسببة للأمراض في الأمراض المعدية: استكشاف التفاعل الضار للدهون المضيفة وقدرتها على الأدوية. J Membr Biol 253 (5): 399-423

Gujar N ، Nikte SV ، Joshi RS ، Joshi M (2021) التوصيف الجزيئي لمستقبلات الأوكتوبامين التي تشبه β 2 من Helicoverpa armigera. J غشاء بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-021-00172-3

Mahapatra A، Uysalel C، Rangamani P (2021) الميكانيكا والديناميكا الحرارية لتشكيل الأنابيب في الأغشية البيولوجية. ي ميمبر بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-020-00164-9

Mandal T، Kar S، Maji S، Sen S، Gupta A (2020) التنوع الهيكلي والوظيفي بين أعضاء CTR ، عائلة غشاء ناقلة النحاس. J Membr Biol 253: 459–468. https://doi.org/10.1007/s00232-020-00139-w

Mishra D ، Pahujani S ، Mitra N ، Srivastava A ، Srinivasan R (2021) تحديد تسلسل محتمل لاستهداف الغشاء في الطرف C لبروتين فصل البلازميد F SopA. ي ميمبر بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-020-00157-8

Mondal AK، Verma P، Lata K، Singh M، Chatterjee S، Chattopadhyay K (2020) تنوع التسلسل في الأشكال المكونة للمسام لسموم البروتين الضارة بالغشاء. ج ميمبر بيول 253 (5): 469-478

باتنايك جي بي ، تشاكرابورتي إتش (2020) مثبطات الدخول: وسائل فعالة لمنع العدوى الفيروسية. ج ميمبر بيول 253 (5): 425-444

Pawar AB، Sengupta D (2021) دور الكوليسترول في إضعاف الغشاء لمستقبل عامل النمو ErbB2. ي ميمبر بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-021-00168-z

Rajwar A و Morya V و Kharbanda S و Bhatia D (2020) الأجهزة النانوية للحمض النووي لفحص وبرمجة تنظيم الغشاء والديناميات والتطبيقات. ي ميمبر بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-020-00154-x

Sarkar S و Das S و Dagar S و Joshi MP و Mungi CV و Sawant AA و Patki GM و Rajamani S (2020a) الأغشية Prebiological ودورها في ظهور الحياة الخلوية المبكرة. J Membr Biol 253 (6): 589-608

Sarkar P ، Jafurulla M ، Bhowmick S ، Chattopadhyay A (2020b) الصرامة الهيكلية والطبيعة المثلى لمتطلبات الكوليسترول في وظيفة مستقبلات السيروتونين 1A. ج ميمبر بيول 253 (5): 445-457

Shanbhag K ، Mhetre A ، Khandelwal N ، Kamat SS (2020) ، lysophosphatidylserines - فئة ناشئة من الليزوفوسفوليبيدات للإشارة. J Membr Biol 253 (5): 381–397

Singh KD، Karnik SS (2021) الاتجاهات الحالية في تخصيص GPCR. ي ميمبر بيول. https://doi.org/10.1007/s00232-020-00167-6


تشكل الأغشية الداخلية في الخلايا حقيقية النواة عضيات

يوجد داخل غشاء البلازما الذي يحيط بالخلايا حقيقية النواة العديد من الأغشية الأخرى التي تحدد الأجزاء داخل الخلايا أو العضيات. كل من هذه العضيات لها وظائف مميزة وتحتوي على مكملات محددة من البروتينات التي تتكيف مع هذه الأدوار. باستثناء عدد قليل من البروتينات التي تم ترميزها بواسطة جينوم الميتوكوندريا ، يبدأ تخليق جميع البروتينات المطلوبة في هذه العضيات على الريبوسومات في السيتوبلازم ، وبالتالي يجب توجيه البروتينات إلى الوجهة الصحيحة. لقد رأينا سابقًا كيف يتم تحقيق ذلك من خلال بروتينات الغشاء ، ومعظم العضيات لديها نوع من تسلسل الإشارات الذي يمكن التعرف عليه بواسطة مستقبلات مختلفة والذي يضمن وصول البروتين إلى العضية الصحيحة.

العضيات لها تركيبات دهنية مميزة

إلى جانب مكمل البروتين المحدد لكل عضية ، يختلف التركيب الدهني للطبقات الثنائية المحيطة بالعضيات. يتم تصنيع الدهون في ER ، وتنقل flippases جزيئات الدهون بين منشورات الطبقة الثنائية. بالنسبة للعضيات في المسار الإفرازي وغشاء البلازما ، يتم نقل الدهون في هذه المقصورات عن طريق حركة الغشاء الحويصلي عبر المسار. يزيد تركيز الكوليسترول في الأغشية من ER عبر Golgi إلى غشاء البلازما. يجعل الكوليسترول الأغشية أكثر سمكًا وأكثر صلابة ، وبالتالي فإن المستويات المنخفضة من الكوليسترول في غشاء ER تجعله رقيقًا ويسهل إدخال الغشاء المركب حديثًا والبروتينات الإفرازية. يصبح الكمبيوتر الشخصي أقل وفرة نسبيًا من خلال هذا المسار ، مع وجود المزيد في ER أكثر منه في غشاء البلازما. تم العثور على PS و PE في جميع أنحاء المسار الإفرازي في نشرة العصارة الخلوية للأغشية. يتم تحقيق هذه التركيبة الدهنية التفاضلية من خلال المسار الإفرازي من خلال استهداف دهون معينة في حويصلات النقل. تعمل البروتينات الموجودة في هذه الحويصلات بمثابة ملصقات وتوجه الدهون إلى الحيز الأيمن. الحويصلات الأمامية (الأمامية) الموجهة لغشاء البلازما غنية بالكوليسترول. تتحرك الدهون أيضًا للخلف عبر المسار الإفرازي ، من غشاء البلازما نحو ER. يُعرف هذا باسم حركة المرور إلى الوراء. يتم إثراء الحويصلات المرتجعة من جولجي بالدهون مثل PC ، والتي تتركز في ER.

يختلف التركيب الدهني للميتوكوندريا اختلافًا كبيرًا عن تكوين مقصورات المسار الإفرازي. أغشية الميتوكوندريا أكثر ثراءً في PE والكارديوليبين من ER. يتم تصنيع الكارديوليبين في الميتوكوندريا ويقتصر في الغالب على هذه العضية. نظرًا لأن بروتينات الغشاء قد تطورت جنبًا إلى جنب مع عضياتها والدهون المحيطة بها ، فإن ذلك يعني أن تركيبات الدهون المختلفة مطلوبة في عضيات مختلفة من أجل النشاط الأمثل للبروتينات داخل أغشيتها. تم حل بنية حاملة ADP / ATP في الميتوكوندريا ووجد أنها تشتمل على جزيئات Cardiolipin و PC المرتبطة بالبروتين. يعتمد نشاط هذا البروتين الحامل على وجود الكارديوليبين ، وهو متوفر بكثرة نسبيًا في أغشية الميتوكوندريا.

يجب أن تستهدف البروتينات العضية الصحيحة حتى تعمل الخلايا

تمت مناقشة استهداف الغشاء المركب حديثًا والبروتينات الإفرازية إلى ER بإيجاز. ومع ذلك ، هناك العديد من الوجهات المختلفة داخل الخلية التي يمكن إرسال البروتين إليها ، وفي بعض الأحيان توجد البروتينات في أكثر من واحدة من هذه. إن الإشارات وآليات البروتين المطلوبة لاستهداف البروتينات إلى الحيز الصحيح كثيرة ومتنوعة ، والكثير من تفاصيل الآليات الدقيقة المعنية لم يتم توضيحها بعد.

النقل الحويصلي

تتم حركة المرور عبر المسار الإفرازي عن طريق النقل الحويصلي في كلا الاتجاهين الأماميين والرجوع. يمكن تضمين البروتينات والدهون واستبعادها من الحويصلات بوسائل مختلفة من أجل التحديد الانتقائي للجزيئات التي تتحرك للأمام أو للخلف عبر المسار. الحويصلات مغلفة بالبروتينات التي تحدد وجهتها. بشكل عام ، تكون بروتينات الغلاف هذه (COPs) اتجاهية - COPII تغلف حويصلات أمامية ، ومعاطف COPI تغلف حويصلات رجعية. يتم اختيار البروتينات التي تنتقل في الحويصلات (يشار إليها باسم البضائع) إما عن طريق التفاعل مع المستقبلات في الحويصلات أو عن طريق التفاعل المباشر مع بروتينات الغلاف. يحدث اختيار الحمولة في مرحلة التبرعم ، عندما تبدأ بروتينات الغلاف في تشويه الغشاء المانح (مثل ER) في حويصلة. بمجرد اختيار الشحنة وتجميع بروتينات الغلاف ، تنفجر الحويصلة وتنتقل إلى الغشاء المستقبِل (على سبيل المثال ، جولجي في حالة حويصلات COPII من ER) إما عن طريق الانتشار أو بمساعدة البروتينات الحركية التي ' المشي "الحويصلة على طول الهيكل الخلوي. ثم تندمج الحويصلة مع الغشاء المستقبِل ، وترسب حمولتها والدهون المكونة لها (الشكل 11).

إنتاج الحويصلات ونقلها ودمجها.

يتم عرض الأحداث الرئيسية في النقل الحويصلي للبضائع. يتم اختيار البضائع وتعبئتها في حويصلات تتكون من بروتينات الغلاف (1 و 2). تم دمج GTPase Rab أيضًا في الجزء الخارجي من الحويصلة ويسهل الخطوات الموضحة. ثم تنتقل الحويصلة على طول بروتينات الهيكل الخلوي باتجاه وجهتها بعد تفكك بروتينات الغلاف (3). يتم ربط الحويصلة بالغشاء المانح بمساعدة بروتينات الربط ومجمعات SNARE (4) ، مما يسمح بدمج الغشاء وإطلاق الحمولة (5).

يتم عرض الأحداث الرئيسية في النقل الحويصلي للبضائع. يتم اختيار البضائع وتعبئتها في حويصلات تتكون من بروتينات الغلاف (1 و 2). تم دمج GTPase Rab أيضًا في الجزء الخارجي من الحويصلة ويسهل الخطوات الموضحة. ثم تنتقل الحويصلة على طول بروتينات الهيكل الخلوي باتجاه وجهتها بعد تفكك بروتينات الغلاف (3). يتم ربط الحويصلة بالغشاء المانح بمساعدة بروتينات الربط ومجمعات SNARE (4) ، مما يسمح بدمج الغشاء وإطلاق الحمولة (5).

يتطلب تكوين الحويصلات واندماجها بشدة ، حيث تتطلب هذه العمليات كسر الطبقة الثنائية المستقرة من أجل قرص حويصلة جديدة ، ثم دمجها بغشاء مختلف. كل من الطاقة وآلات البروتين المتخصصة مطلوبة للتغلب على حاجز الطاقة هذا.

بمجرد أن تبرعم الحويصلة ، وتنتقل عبر العصارة الخلوية وتصل إلى وجهتها ، يجب أن تندمج مع غشاء المستقبل الخاص بها. مرة أخرى ، هذه عملية غير مواتية بقوة ، ويجب استخدام آلات البروتين للسماح بدمج طبقتين. تعتبر بروتينات SNARE أساسية في عملية اندماج الحويصلة. تحمل الحويصلات v-SNAREs التي ترتبط بأغشية t-SNARE محددة على الأغشية المستهدفة. لا يضفي هذا خصوصية في استهداف الحويصلات فحسب ، بل أيضًا تسهل SNAREs اندماج الغشاء عند وصول الحويصلة. تشكل كل من v-SNAREs و t-SNARE المتفاعلة حزمة من أربعة حلزون عند الواجهة بين الغشاءين ، وتتكون من ثلاث حلزونات من t-SNARE ولولب واحد من v-SNARE. يُعتقد أن هذا التفاعل المستقر يوفر الطاقة المجانية اللازمة لتمكين الغشاءين من الاقتراب الشديد والانصهار. عندما تصبح الطبقتان أقرب ، يمكن أن تتلامس الدهون في الوريقتين الخارجيتين مع بعضها البعض ، مما يزيد من الطبيعة الكارهة للماء للموقع وتمكين الأغشية من الانضمام والتغلب على حاجز الطاقة. يُعتقد أيضًا أن مجالات الغشاء في SNAREs متورطة في اندماج الغشاء ، لأنه عندما يتم استبدالها بالدهون تجريبياً ، لا يحدث الاندماج. عند الاندماج ، تدخل الحمولة إلى الحجرة المستهدفة ، وتنتشر الدهون والبروتينات الغشائية التي شكلت الحويصلة في الغشاء المستهدف.

يعد تحديد آليات التبرعم الغشائي أمرًا مهمًا لفهم كيفية قيام الفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) بإنتاج جزيئات فيروسية جديدة. على عكس التبرعم في المسار الإفرازي الموصوف سابقًا ، تتبرعم جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية بعيدًا عن السيتوبلازم ، في الفضاء خارج الخلية. يحدث هذا التبرعم الفيروسي في نفس اتجاه التبرعم الذي يحدث داخل الإندوسومات. يشار إلى البروتينات التي تمكّن هذا التبرعم بمجمعات الفرز الباطنية المطلوبة للنقل (ESCRTs). يقوم فيروس نقص المناعة البشرية "باختطاف" آلية ESCRT لتمكينها من التبرعم من غشاء البلازما ، من السيتوبلازم إلى الفضاء خارج الخلية. تعمل التفاعلات بين بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية وبروتينات ESCRT على تجنيد آلية ESCRT للخلايا المضيفة في الحويصلة الناشئة ، مما يسمح بقطع الغشاء وإطلاق الحويصلة. يمكن للفيروسات الأخرى أن تتبرعم دون مساعدة من ESCRTs ، ويُعتقد أن فيروس نقص المناعة البشرية قد يكون قادرًا أيضًا على التبرعم بطريقة مستقلة عن ESCRT. إن فهم المزيد عن أحداث تبرعم الأغشية وانفصالها أمر بالغ الأهمية لتوضيح كيفية تكاثر الفيروسات وكيف يمكننا تثبيط العمليات عن طريق التدخلات الدوائية.

تهريب البروتين في المسار الإفرازي

كما تم وصفه سابقًا ، فإن امتدادًا كارهًا للماء يتكون من 20-30 من الأحماض الأمينية مع طرف N أساسي ومنطقة قطبية عند الطرف C الخارجة من الريبوسوم يتسبب في توجيه البروتين إلى ER ، حيث يتم الانتهاء من التوليف. يمكن شق هذا التمدد الكاره للماء في حالة البروتينات القابلة للذوبان ، أو يمكن أن يظل مرتبطًا. يُشار إلى تسلسل الإشارة غير المكسور بتسلسل مرساة الإشارة ، حيث يشير كلاهما إلى استهداف ER ثم ينتقل إلى تثبيت بروتين في الغشاء ، ويصبح مجالًا عبر الغشاء في البروتين المطوي بالكامل. تعتبر خطوة الاستهداف المعتمدة على SRP شائعة لبروتينات ER وكذلك البروتينات الموجهة لـ Golgi أو غشاء البلازما ، أو ليتم إفرازها من الخلية.

يُعتقد أن خروج ER يسمح ببعض اختيار البروتينات المتبقية في ER وأي البروتينات تترك وتتحرك في حويصلات نحو Golgi. تقع مواقع خروج ER في مناطق ER بالقرب من Golgi ، وهي غنية ببروتينات طبقة COPII. لا يُفهم بالضبط ما هي خصائص البروتين التي تحدد ما إذا كان سيترك ER في حويصلات COPII ، ولكن يُعتقد حاليًا أن طول المجال عبر الغشاء عامل مهم. يبدو أن نطاقات الغشاء الأطول تؤهب البروتينات للخروج من ER والسفر نحو Golgi. هذا يتوافق مع حقيقة أن سمك الغشاء يزداد من خلال المسار الإفرازي بسبب زيادة محتوى الكوليسترول ، كما هو موضح سابقًا.

عند الوصول إلى رابطة الدول المستقلة-جولجي ، يمكن بعد ذلك استرجاع البروتينات إلى ER ، أو البقاء في Golgi ، أو الانتقال إلى غشاء البلازما. لم يتم فهم الاسترجاع إلى ER بشكل كامل ، لكن بعض البروتينات تحتوي على أشكال استرجاع ، مثل نموذج KDEL المكون من أربعة أحماض أمينية والذي يتعرف عليه المستقبل ويسمح بتعبئة البروتين في حويصلات COPI رجعية. يبدو أن بروتينات أخرى تتنقل بين ER و Golgi بدون عناصر استرجاع معروفة. تتحرك البروتينات في كلا الاتجاهين التراجعي والرجعي عبر مكدس جولجي. يمكنهم بعد ذلك مغادرة عبر-جولجي وتنتقل إلى غشاء البلازما في الحويصلات.

يمكن أن تنتقل البروتينات الموجودة في غشاء البلازما إلى الخلية في الحويصلات عن طريق الالتقام الخلوي (على سبيل المثال عندما يتم استيعاب المستقبلات السطحية للتحلل في الجسيمات الحالة). غالبًا ما تكون الحويصلات الداخلية مغلفة بالكلاذرين. Clathrin ، مثل COPs ، يشوه الغشاء إلى هياكل منحنية ، مما يسمح بتكوين الحويصلة. يشكل Clathrin شكلًا يشبه القفص يعزز تكوين الحويصلة وانفصالها بفضل الشكل الصلب لمجمعات البروتين التي تتشكل عند الغشاء. ليست كل حالات الالتقام الخلوية تعتمد على الكلاذرين ، وهناك بروتينات أخرى ، مثل الكافولين ، التي يمكن أن تسهل تكوين الحويصلات الداخلية.

استهداف الميتوكوندريا والبروتينات النووية

يتم استهداف البروتينات التي تم تصنيعها حديثًا والمخصصة للميتوكوندريا أو النواة بطريقة مختلفة ، بغض النظر عن المسار الإفرازي. يتم ترميز بعض بروتينات الميتوكوندريا بواسطة جينوم الميتوكوندريا ، بينما يتم ترميز البعض الآخر بواسطة الجينوم النووي. الميتوكوندريا لها غشاء مزدوج الطبقات. لذلك ، يجب أن تحتوي إشارات الاستهداف لبروتينات الميتوكوندريا على معلومات ليس فقط لتوجيه البروتين إلى العضية ، ولكن أيضًا لتحديد الغشاء الذي سيقع فيه (في حالة بروتينات الغشاء) ، أو ما إذا كان سيتم وضعه داخل الميتوكوندريا ( المصفوفة) أو في الفضاء بين الغشاء بين الأغشية الداخلية والخارجية (في حالة البروتينات القابلة للذوبان). تختلف أشكال استهداف الميتوكوندريا بشكل كبير ، ولكنها تقع عمومًا عند الطرف N للبروتين وهي غنية بالأحماض الأمينية موجبة الشحنة والطاردة للماء. يتم استهداف البروتينات الموجهة للنواة من خلال تسلسل التوطين النووي الذي يوجه البروتينات التي تم تصنيعها في السيتوبلازم من خلال مجمعات المسام النووية. مرة أخرى ، لا يتم حفظ هذه التسلسلات بشكل كبير ، ولكنها تحتوي بشكل عام على مجموعات من الأحماض الأمينية موجبة الشحنة.


نتائج

مشغل MAC والليزوزيم ه. القولونية تدهور جدار الخلية في مصل الإنسان

في الدراسات السابقة ، بحثنا في كيفية تأثير MAC على سلامة جدار الخلية وصلاحيته ه. القولونية باستخدام مكونات مكملة منقى. لاحظنا أن MAC يضر بكفاءة الغشاء الخارجي والداخلي للبكتيريا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا البكتيرية. ومع ذلك ، كشفت الصور المجهرية متحد البؤر أن البكتيريا المعالجة بـ MAC تظل على شكل قضيب ، وهو ما يتماشى مع حقيقة أن هذه البكتيريا احتفظت بانتثارها الأمامي والجانبي عند قياسها عن طريق قياس التدفق الخلوي [10 ، 18]. على عكس هذه الشروط المطهرة ، لاحظنا ذلك ه. القولونية بدأت البكتيريا تختفي من بوابة قياس التدفق الخلوي بعد حوالي 40-60 دقيقة عندما تم تحضينها بنسبة 5٪ من المصل البشري (الشكل 1 أ). لمزيد من التحقيق في هذا الأمر ، قمنا بتعديل إعدادات الاستحواذ لتجربة قياس التدفق الخلوي لدينا لتحديد عدد الجسيمات في العينة ، عن طريق قياس حجم ثابت. تم تصنيف الجسيمات على أنها بكتيريا على شكل قضيب عندما كان مبعثرها الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) مشابهًا للبكتيريا غير المعالجة (التحكم في الشكل 1 أ). تم تعيين عتبة على SSC ، لمنع اكتشاف أحداث الخلفية التي يسببها المصل. أدى تعريض البكتيريا للمصل إلى تقليل عدد الجزيئات المكتشفة بشكل كبير ، مما يشير إلى أن هذه البكتيريا فقدت شكلها الطبيعي القضيب (الشكل 1 أ و 1 ب). نظرًا لأن طبقة الببتيدوغليكان البكتيرية مهمة في الحفاظ على شكل الخلية البكتيرية ولمنع التحلل البكتيري من ضغط التورم [22] ، فقد تساءلنا عما إذا كان الليزوزيم في المصل مسؤولًا عن الفقد الملحوظ للجسيمات. على الرغم من أن الليزوزيم عادة ما يكون غير فعال ضده ه. القولونية، افترضنا أن العمل المشترك للمكمل والليزوزيم في مصل الدم قد يعزز تدهور جدار الخلية البكتيرية. لاختبار ذلك ، استنفدنا & gt99٪ من الليزوزيم الداخلي من تجمع المصل (مصل الإليزوزيم). في حين أن تركيز الليزوزيم في مصل الدم هو

0.01 ميكروغرام / مل في مصل الإليزوزيم (S1A و S1B الشكل والجدول S1). عندما عولجت البكتيريا بمصل Δlysozyme ، لم يكن هناك تحول كبير في FSC / SSC مقارنة بالبكتيريا غير المعالجة ، مما يشير إلى أن هذه البكتيريا احتفظت بشكلها الطبيعي (الشكل 1 أ و 1 ب). عندما تمت إضافة 5 ميكروغرام / مل من الليزوزيم المنقى إلى مصل الإليزوزيم ، لاحظنا فقدان جزيئات أكثر كفاءة من المصل غير المستنفد (الشكل 1 أ و 1 ب) ، على الأرجح لأن تركيز الليزوزيم هذا يتجاوز تركيز 5٪ من المصل الطبيعي بعامل 100. قمنا بعد ذلك بمعايرة الليزوزيم إلى 5٪ من مصل الليزوزيم للتحقق مما إذا كانت التركيزات الفسيولوجية لليزوزيم يمكنها أيضًا استعادة تأثير مصل الإليزوزيم (الشكل 1 ج). هنا ، لاحظنا زيادة تعتمد على الجرعة في فقد الجسيمات ، حيث كان الليزوزيم يعمل بالفعل بتركيزات 0.05 ميكروغرام / مل ، وهو ما يمكن مقارنته بالتركيز الموجود بشكل طبيعي في 5 ٪ مصل lysozyme (الشكل 1 ج). كانت فعالية الليزوزيم في المصل تعتمد على وجود مسام MAC ، حيث لم تختف أي جزيئات في وجود مثبط C5 OmCI ، والذي يمنع تكوين MAC [23] (التين 1 ج و S1C). علاوة على ذلك ، فإن إضافة الليزوزيم المعطل بالحرارة إلى مصل الإليزوزيم لا يؤدي إلى أي فقد إضافي للجسيمات (الشكل 1 ج). الانخفاض الطفيف في الجزيئات الذي لاحظناه في 5٪ مصل lysozyme دون إضافة المزيد من الليزوزيم (الشكل 1 ج) يعتمد على وجود مسام MAC ، لأنه كان غائبًا في وجود مثبط C5 OmCI (الشكل 1 ج). من المحتمل أن يحدث هذا بسبب تسرب البروتينات المحيطة بالبروتينات أو تدفق بروتينات المصل والببتيدات من خلال مسام MAC.

أ) مخططات التدفق الخلوي (FSC / SSC) لعدد ه. القولونية جزيئات في 10 ميكرولتر بعد التعرض للعازل أو 5٪ مصل أو مصل lysozyme مع أو بدون 5 ميكروغرام / مل من الليزوزيم لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم تعيين عتبة SSC بناءً على البكتيريا غير المعالجة لتصفية ضوضاء الخلفية ولتحديد التغييرات في FSC / SSC عند العلاج بظروف مصل مختلفة. ب) عدد الخلايا في حجم حضانة 10 ميكرولتر ه. القولونية تمت معالجته بنطاق تركيز من NHS أو مصل lysozyme مع أو بدون 5 ميكروغرام / مل من الليزوزيم لمدة 60 دقيقة و 37 درجة مئوية. يمثل عدد الخلايا الأحداث في عينة 10 ميكرولتر التي تم قياسها ضمن الظروف الموضحة فيها أ. ج) عدد الخلايا في حجم حضانة 10 ميكرولتر ه. القولونية تمت معالجته بمحلول منظم أو 5 ٪ من اليوزيم في وجود أو عدم وجود 20 ميكروغرام / مل من OmCI ومعايرة الليزوزيم أو الليزوزيم المعطل بالحرارة (HI) لمدة 60 دقيقة و 37 درجة مئوية. د) رسوم بيانية لقياس التدفق الخلوي لتلف الغشاء الخارجي (يسار: mCherry) وتلف الغشاء الداخلي (يمين: Sytox blue) للبكتيريا المعالجة بمخزن ، 1٪ مصل مع أو بدون 20 ميكروغرام / مل من أومسي أو 1٪ مصل أليزوزيم. ميلادي) تمثل مخططات قياس التدفق الخلوي والمخططات التكرارية بيانات ثلاث تجارب مستقلة. ب ، ج) تمثل البيانات متوسط ​​± SD لـ 3 تجارب مستقلة.

نظرًا لأننا لاحظنا أن الليزوزيم يلعب دورًا مهمًا في تغيير شكل الخلية البكتيرية في المصل ، فقد تساءلنا بعد ذلك عما إذا كان الليزوزيم يساهم في تلف الغشاء الخارجي أو الداخلي. على الرغم من أننا لاحظنا سابقًا أن الليزوزيم ليس ضروريًا لتلف الغشاء الداخلي أو قتل ه. القولونية في 10٪ من المصل [18] ، قد يلعب دورًا أكثر أهمية في تركيزات مصل الدم المنخفضة. لدراسة الضرر المحتمل لكل من الأغشية البكتيرية على حدة ، استخدمنا الهندسة الوراثية ه. القولونية السلالة التي تعبر عن mCherry في periplasm و GFP في السيتوبلازم (بيريمشيري /سيتوGFP ه. القولونية MG1655) [18]. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتضمين صبغة DNA غير منفذة بشكل طبيعي (Sytox) لقياس عدم استقرار الغشاء الداخلي. عالجنا البكتيريا بمصل 1٪ أو مصل lysozyme وقمنا بقياس كثافة التألق للواسمات الثلاثة. لوحظ انخفاض إشارة mCherry وزيادة في شدة Sytox وانخفاض قابلية البقاء في وجود وغياب الليزوزيم ، مما يدل على أن الليزوزيم ليس ضروريًا لتلف الأغشية البكتيرية لهذا. ه. القولونية سلالة في المصل (التين 1 د و S1D). على النقيض من ذلك ، كان تلف الغشاء الخارجي والداخلي الناجم عن المصل يعتمد على MAC ، حيث ظل كلا الأغشية سليمة وبقيت البكتيريا على قيد الحياة في وجود OmCI (التين 1 د و S1D). إجمالاً ، الضرر المعتمد على MAC لكل من الأغشية البكتيرية لا يعتمد على الليزوزيم. ومع ذلك ، فإن الليزوزيم ضروري لزيادة تدهور غلاف الخلية البكتيرية في مصل الدم ، مما يؤدي إلى تغييرات في FSC / SSC كما تم قياسه بواسطة قياس التدفق الخلوي.

يؤدي MAC والليزوزيم في مصل الدم إلى حدوث تغييرات في مورفولوجيا ه. القولونية

بعد ذلك ، تساءلنا عما إذا كانت البكتيريا التي لم تعد قابلة للاكتشاف باستخدام إعدادات قياس التدفق الخلوي في الشكل 1 قد تم تفكيكها تمامًا ، أو ما إذا كان شكلها قد تغير بطريقة ظهرت بشكل مختلف في مؤامرات FSC / SSC. لتتبع التغييرات في FSC / SSC للبكتيريا المعرضة للمصل ، قمنا بتسمية LPS الخاصة بهم بصبغة DBCO-Cy3 من خلال كيمياء النقر باستخدام KDO-azide المدمج في التمثيل الغذائي (الشكل 2 أ) [24]. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتخفيض عتبة SSC في إعدادات قياس التدفق الخلوي لدينا ، لاكتشاف الجسيمات الأصغر في العينات. تعرضت البكتيريا التي تحمل علامة Cy3 إلى 5 ٪ من مصل الدم أو مصل الإليزوزيم مع أو بدون 5 ميكروغرام / مل من الليزوزيم المنقى ، وبعد ذلك تم تحديد عدد الجسيمات الإيجابية لـ Cy3 ضمن حجم ثابت. على عكس فقدان الجسيمات الذي لاحظناه في الشكل 1 ، ظل العدد الإجمالي للأحداث الإيجابية لـ Cy3 متماثلًا في جميع الظروف (الشكل 2 ب). يشير هذا إلى أن العدد الإجمالي للجسيمات البكتيرية التي تم اكتشافها بواسطة مقياس التدفق الخلوي لا يتغير عن طريق الحضانة مع المصل. عندما قمنا بتحليل FSC / SSC لهذه الجسيمات الإيجابية لـ Cy3 ، لاحظنا مرة أخرى أن البكتيريا المعرضة للمصل لها حجم وشكل متغير ، كما يتضح من التحول في FSC / SSC (الشكل 2 ج) ، والذي كان أقل وضوحًا في حالة عدم وجود الليزوزيم. يمكن تفسير حقيقة أن التحول في نمط تشتت البكتيريا المعالجة بمصل اليوزيم أكثر وضوحًا مما في الشكل 1 ، من خلال إجراء وضع العلامات الذي خضعت له هذه البكتيريا ، مما قد يجعلها أكثر عرضة لتلف الغشاء بواسطة MAC ومكونات المصل الأخرى (التين 1 أ و 2 ج). انخفض عدد الجزيئات الإيجابية لـ Cy3 داخل بوابة FSC / SSC بشكل كبير عندما تمت إضافة 5 ميكروغرام / مل من الليزوزيم إلى مصل الإليزوزيم (الشكل 2 ج و 2 د). إجمالاً ، تُظهر هذه البيانات أن الجمع بين MAC والليزوزيم في مصل الدم يؤدي إلى حدوث تغييرات في شكل وحجم ه. القولونية، والتي نلاحظها من خلال تحول FSC / SSC مقارنة بالبكتيريا غير المعالجة. على الرغم من أن هذه البكتيريا لا تتفكك تمامًا ، إلا أن جدار الخلية يتضرر بطريقة تؤدي إلى تغيير مورفولوجيا البكتيريا بشكل جذري.

أ) تمثيل تخطيطي لوصف Cy3 لـ ه. القولونية LPS عبر انقر فوق الكيمياء. يتم تحضين البكتيريا باستخدام KDO-azide (الأخضر) ، والذي يتم دمجه في LPS. يمكن أن يتفاعل DBCO (الأزرق) المرتبط بـ fluorophore Cy3 (أحمر) لاحقًا مع مجموعة azide عبر كيمياء النقر. OM = الغشاء الخارجي ، PG = الببتيدوغليكان ، IM = الغشاء الداخلي. ب) عدد Cy3 موجب ه. القولونية في عينة 10 مايكرولتر بعد التعرض لنطاق تركيز من مصل الدم أو مصل الإليزوزيم مع أو بدون 5 ميكروغرام / مل من الليزوزيم. تم قياس العينات دون عتبة SSC. ج) Flow cytometry plots (FSC/SSC) of Cy3-positive E. القولونية particles in 10 μl sample after exposure to buffer, 5% nhs, or 5% Δlysozyme serum with or without 5 μg/ml lysozyme for 60 minutes at 37°C. د) Cy3-labeled E. القولونية was treated with a concentration range of serum or Δlysozyme serum with or without 5 μg/ml lysozyme for 60 min 37°C. For each condition, the number of Cy3-positive particles within the FSC/SSC gate of untreated bacteria was quantified in 10μl. B-D) The lysozyme concentration that was used exceeds the concentration in 5% serum by a factor 100. B, D) Data represent mean ±SD of 3 independent experiments. ج) Flow cytometry plots represent data of three independent experiments.

The combination of the MAC and lysozyme alters the cell shape of E. القولونية from rod-shaped to spherical

To further validate our observations by flow cytometry, we aimed to visualize the effect of serum on the morphology of E. القولونية in more detail by confocal microscopy. We treated perimCherry/سيتوGFP E. القولونية with serum and analyzed their morphology in time. We added an impermeable DNA dye (ToPro-3) to monitor inner membrane destabilization. Control bacteria that were exposed to buffer remained ToPro-3 negative and almost all bacteria were classified as rod-shaped (S2A and S2B Fig). The inner membrane of serum-treated bacteria was efficiently damaged after approximately 10 minutes. After 25 minutes of serum exposure, the cell shape of almost all imaged bacteria had changed from rod-shaped to spherical, suggesting that also the peptidoglycan layer was affected (Figs 3A و S2B). We subsequently addressed the role of lysozyme in these experiments by exposing bacteria to 5% Δlysozyme serum with and without 0.5 μg/ml purified lysozyme. Although we observed inner membrane damage in Δlysozyme serum within 25 minutes, there was no significant decrease in the number of rod-shaped bacteria compared to the buffer control (Figs 3B و S2B). The small decrease in the number of cells that was classified as rod-shaped is in line with the flow cytometry observations where Δlysozyme serum causes slight alterations in the scattering pattern (Fig 1C). Noteworthy, although a higher percentage of bacteria that were treated with Δlysozyme serum was classified as non-rod-shaped, many of these bacteria have an intermediate phenotype. This could potentially be caused by other serum proteins and peptides that can enter through MAC pores or by leakage of periplasmic proteins. In contrast, when bacteria were exposed to Δlysozyme serum that was supplemented with purified lysozyme, a significant number of the imaged bacteria lost their rod-shape within 25 minutes (Figs 3B و S2B). Lysozyme-dependent alterations in cell shape were also dependent on the presence of MAC pores, since there was no decrease in the percentage of rod-shaped bacteria in the presence of the C5 inhibitor OmCI (Figs 3C و S2B). To better visualize the differences in cell shape of these bacteria, 3D reconstructions were generated of the conditions described in Fig 3B (exposed for 45 minutes at room temperature, S2C Fig). Altogether, these confocal images confirm that the MAC in serum allows lysozyme to trigger alterations in the shape of E. القولونية from rod-shaped to spherical.

Confocal microscopy images of PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية bacteria that were immobilized onto poly-L-lysin coated coverslips and treated with أ) 5% serum or ب) 5% Δlysozyme serum with (bottom) or without (top) 0.5 μg/ml lysozyme. All incubations were done in the presence of To-pro-3 as a readout for inner membrane damage. Images were taken after أ) 0, 10 and 25 minutes or ب) 0 and 25 minutes at 37°C. في ج), bacteria were treated with 5% Δlysozyme serum with 0.5 μg/ml lysozyme in the presence of 20 μg/ml OmCI to block MAC formation. B, C) The lysozyme concentration that was used exceeds the concentration in 5% serum by a factor 10. أ-ج) Scale bars: 20 μm. Images represent data of three independent experiments.

A completely assembled MAC pore sensitizes E. القولونية to the antimicrobial actions of lysozyme and hGIIA

Next, we investigated whether a complete MAC pore is required for further destruction of the cell envelope by other immune factors. Bacteria were pre-incubated with C9-depleted serum (ΔC9 serum), leading to C5b-8 complex formation on the bacterial surface. C5b-8-labeled bacteria were washed, after which purified C9 was added in the presence or absence of a concentration range of lysozyme. A minor increase in Sytox was observed when bacteria were treated with ΔC9 serum alone, indicating that C5b-8 complexes already slightly damage the bacterial inner membrane (S3A Fig). Although the bacterial inner membrane was more efficiently damaged in the presence of C9 (S3A Fig), there were hardly any alterations in FSC/SSC detected (Fig 4A و 4B). Lysozyme by itself did not trigger inner membrane damage or alterations in the FSC/SSC on bacteria with C5b-8 complexes (Figs 4A, 4B and S3A). In contrast, the number of particles inside the FSC/SSC gate decreased when lysozyme was added in combination with C9 (Fig 4A و 4B). To validate whether outer membrane damage by the MAC is responsible for the lysozyme-dependent particle loss, we next titrated C9 onto bacteria with C5b-8 complexes in the presence or absence of 5 μg/ml lysozyme, and monitored mCherry leakage and particle loss simultaneously. Indeed, lysozyme-induced particle loss coincided with the leakage of mCherry from the periplasm (Fig 4C).

أ) Flow cytometry plots (FSC/SSC) and ب) particle count of PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية that was pre-treated with buffer or 10% ΔC9 serum and, after washing (indicated with an @), exposed to buffer, 100 nM C9 and/or a concentration range of lysozyme for 60 minutes. في أ, the flow cytometry plots of 0 and 5 μg/ml lysozyme are depicted. ب) A gate was set on untreated bacteria as depicted in أ, after which the number of particles was counted within those gates. ج) Outer membrane damage (left: mCherry signal (relative to the mean of the mCherry signals of the 0 nM C9 controls)) and particle count (right) of PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية that were treated with 10% ΔC9 serum, and after washing, exposed to a concentration range of C9 in the presence or absence of 5 μg/ml lysozyme for 60 minutes. Particle count represents the number of particles in the FSC/SSC gate of untreated bacteria. د) GFP intensity of PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية that was pre-treated with 10% ΔC9 serum and, after washing, exposed to a concentration range of C9 in the absence (control) or presence of 5 μg/ml lysozyme and/or 1 μg/ml hGIIA for 30 minutes. The GFP intensity (Geomean) of the total number of events is presented. أ) Flow cytometry plots represent data of three independent experiments. B-D) Data represent mean ±SD of 3 independent experiments.

Next, we investigated whether the MAC also sensitizes E. القولونية to immune factors with a different mechanism of action. Therefore, we included an antimicrobial protein that hydrolyzes the cytoplasmic membrane of bacteria, Type IIA secreted phospholipase A2 (hGIIA)[21]. Similar to lysozyme, hGIIA cannot cross the outer membrane of Gram-negative bacteria and is therefore considered to act specifically against Gram-positive bacteria [25,26]. Since hGIIA acts on the cytoplasmic membrane, we now also included leakage of cytoplasmic GFP as a readout for inner membrane damage. To prevent full particle loss in conditions with the MAC and lysozyme, we shortened the final incubation step with C9 and lysozyme to 30 minutes, leading to a shift in FSC/SSC but no complete loss of particles. This allowed us to simultaneously study the effect of these two antibacterial proteins on alterations in bacterial morphology and levels of cytoplasmic GFP (S3B Fig). Despite the alterations in FSC/SSC of bacteria that were treated with C9 and lysozyme, these bacteria remained GFP positive (Fig 4D). This suggests that lysozyme did not affect the integrity of the inner membrane. In line with previous observations, the MAC alone did also not affect the level of cytoplasmic GFP (Fig 4D)[10]. We then measured whether the MAC could also sensitize E. القولونية to 1 μg/ml recombinant hGIIA (250x excess compared to non-inflamed conditions or comparable to the concentration in inflamed serum [27,28]). Although some particles were lost from the FSC/SSC gate when bacteria with C5b-8 complexes were exposed to hGIIA, the effect was much more substantial when hGIIA was combined with C9 (S3B and S3C Fig). Bacteria that were still detected after treatment with a combination of hGIIA and C9 appeared within the FSC/SSC of untreated bacteria (S3B Fig), but were all GFP negative (Fig 4D), indicating that their inner membrane was severely damaged by hGIIA. We also observed a small drop in GFP signal when hGIIA was added to bacteria with C5b-8 complexes in the absence of C9, suggesting that some hGIIA can enter the periplasmic space through C5b-8 complexes in the outer membrane (Fig 4D 0 nM C9 condition). A decrease in GFP signal was also observed when physiologically relevant concentrations of hGIIA (6 ng/ml) were used in combination with C9 (S3D Fig). As expected, almost all events were lost when bacteria were treated with a combination of C9, lysozyme and hGIIA (S3B and S3C Fig). Altogether, we conclude that the MAC sensitizes E. القولونية to antimicrobial proteins with different effector functions, lysozyme acting on the peptidoglycan layer and hGIIA on the bacterial inner membrane.

The MAC sensitizes E. القولونية to killing by neutrophils

For intracellular killing by neutrophils, Gram-negative bacteria are taken up into phagolysosomes that contain a large number of highly-concentrated antimicrobial proteins and peptides [16,29]. Several of these proteins, including lysozyme and hGIIA, are considered inactive against Gram-negative bacteria and require other factors in the phagolysosome (such as lactoferrin, defensins and bactericidal permeability increasing protein (BPI)), to first damage the bacterial outer membrane [12,30–33]. Given that the MAC efficiently sensitizes E. القولونية to antimicrobial proteins in serum, we hypothesized that it may also sensitize bacteria to antimicrobial factors inside neutrophils. To test this, we treated PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية with Δlysozyme serum to allow MAC formation while maintaining cell shape (Fig 5A), and exposed them to human neutrophils to allow phagocytosis. Intracellular bacteria were efficiently degraded, as evidenced by the diffused GFP signal and the absence of clear rod shape bacteria (Fig 5A). Quantification of the number of rod-shaped versus non-rod-shaped bacteria inside the imaged neutrophils revealed that 100% of the imaged bacteria was non-rod-shaped (S4A Fig). In serum, bacteria are efficiently labeled with C3b molecules, which enhances phagocytosis and thereby facilitates bacterial killing by neutrophils [34,35]. However, the contribution of MAC pores to killing by neutrophils is less well understood. To directly study the effect of MAC pores on sensitizing bacteria to neutrophils, we incubated PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية with ΔC5 serum to label the bacterial surface with C5 convertase as previously described [18]. These bacteria were then exposed to buffer, or to purified C5-C9 to allow pore formation. When convertase-labeled bacteria were internalized by neutrophils, 82% of the imaged bacteria remained rod-shaped within the measured time-frame (Figs 5B و S4B). Instead, when convertase-labeled bacteria were first exposed to purified MAC components (C5-C9) and then internalized by neutrophils, only 23% of the imaged bacteria remained rod-shaped (Figs 5B و S4B). Importantly, a higher laser intensity was needed to detect the GFP signal in the samples with MAC components and a lower number of round-shaped bacteria was imaged per neutrophil (S4B Fig). Besides the fact that GFP is more diffuse in these conditions, it might also be degraded inside the phagolysosome. To test whether a full MAC pore is required to sensitize bacteria to neutrophils, we included a condition in which C9 was omitted, to allow MAC formation up to C8. When these bacteria were phagocytosed, approximately 60% of the imaged bacteria remained rod-shaped. The other 40% of the imaged bacteria became spherical or had an intermediate phenotype (S4B and S4C Fig). This suggests that incomplete MAC pores (C5b-8) can also partly sensitize E. القولونية to (small) intracellular factors. One of these factors could be hGIIA, that has some activity on bacteria with C5b-8 pores (Fig 4D).

أ) Confocal microscopy images of PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية (green) treated with 5% Δlysozyme serum for 60 minutes at 37°C. After washing, bacteria were incubated with buffer (left) or neutrophils (red, right) for 20 minutes at 37°C, fixed in 1.5% paraformaldehyde and imaged. ب) Confocal images of PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية (green) that were pre-labeled with 10% ΔC5 serum (for deposition of C5 convertases), washed and exposed to buffer or C5-C9 for 30 minutes at 37°C. 10 nM C5 and C6, 20 nM C7 and C8 and 100 nM C9 was used. After washing, bacteria were exposed to neutrophils for 20 minutes at 37°C, fixed in 1.5% paraformaldehyde and imaged. A, B) Neutrophils membranes (red) were stained with Alexa-647 labeled Wheat Germ Agglutinin. ج) Relative GFP intensity of neutrophils after phagocytosis of PerimCherry/سيتوGFP E. القولونية. Bacteria were pre-labeled with 10% ΔC8 serum and, after washing, exposed to a concentration range of C8 in the presence or absence of 2.5 nM C9 for 30 minutes at 37°C. After washing, bacteria were incubated with neutrophils for 20 minutes at 37°C, after which the GFP signal of the neutrophils was analyzed by flow cytometry. GFP intensity was normalized against the GFP intensity of bacteria that were treated with ΔC8 serum only. Neutrophils without bacteria (green dot) served as basal value for the GFP signal. د) Bacterial viability (CFU/ml) of E. القولونية that was pre-treated with MAC components similar to ج, and exposed to buffer or neutrophils. After 20 minutes, neutrophils were lysed for 15 minutes in MQ, after which bacterial survival was determined (CFU/ml). ج, د) Bacteria/neutrophil ratio used: 10/1. A, B) Images represent two (أ) or four (ب) independent experiments in which the 488-laser settings were adjusted to the GFP intensity. ج ، د) Data represent mean ±SD of 3 independent experiments. د) Statistical analysis was done using a ratio paired t-test in which each condition was compared to the buffer control (no C9 and no neutrophils) within the same C8 concentration. Significance was displayed only when significant as *P ≤ 0.05 or **P≤ 0.01.

We next performed flow cytometry experiments to study the role of the MAC inside neutrophils in a more high-throughput manner. We carefully titrated the number of MAC pores on PerimCherry/سيتوGFP bacteria by exposing them to ΔC8 serum and, after washing, a concentration range of C8 in the presence or absence of C9. Low concentrations of C8 and C9 were added to trigger outer membrane damage of E. القولونية by the MAC, without inducing killing (Fig 5C and 5D). These bacteria were subsequently exposed to neutrophils. The GFP signal within the neutrophil population drastically decreased when pre-labeled bacteria were incubated with both C8 and C9. In contrast, it remained relatively stable when only C8 was added (Fig 5C). The decrease in GFP signal when bacteria were pre-treated with full MAC pores also explains why a higher 488-laser intensity was required in the confocal experiments to detect GFP inside neutrophils in these conditions. We next repeated the experiment with bacteria of which the LPS was labeled with Cy3 to verify that the efficiency of phagocytosis was unaffected by the pre-treatment with different combinations of MAC components. Although there is a slight drop in Cy3 signal of the neutrophil population when bacteria were pre-treated with C8 and C9, this effect is minimal compared to the loss of GFP signal, suggesting that the drop of GFP is not caused by impaired phagocytosis (Figs 5C and S4D). This also suggests that, due to the loss of GFP signal, we were unable to image all bacteria by confocal microscopy, since we counted a lower number of bacteria inside the neutrophils when these were pre-treated with full MAC pores (S4B Fig). Finally, we used the same experimental setup to assess whether the MAC also increases bacterial killing (CFU/ml) by neutrophils. When only C8 was added to bacteria pre-treated with ΔC8 serum, no killing was observed in the presence or absence of neutrophils (Fig 5D). At the highest concentration of C8 (50 pM), E. القولونية was efficiently killed in the presence of C9, and therefore only a slight additive effect of neutrophils could be measured (Fig 5D). However, at the C8 concentrations where addition of C9 or neutrophils alone was not sufficient to kill these bacteria (12.5 and 25 pM), the combination of both triggered efficient killing of these bacteria (Fig 5D). Altogether, these results show that the MAC enhances cell wall degradation and killing of E. القولونية inside neutrophils.


Lipids in lipid rafts

Despite the above reservations, Triton X-100 insolubility and subsequent flotation on sucrose density gradients is a very useful tool and is the best available biochemical indication of partitioning into lipid rafts. TX-DRMs are enriched in cholesterol, glycosphingolipids, sphingomyelin and saturated glycerophospholipids [2, 21]. These DRM lipids can by themselves form a liquid-ordered-like state in which acyl chains are tightly packed, highly ordered and extended, supporting the raft hypothesis [22]. Extensive lipid analyses have revealed that, in TX-DRMs from resting mast cells, 60% of the phospholipids are either saturated or mono-unsaturated compared with 50% of the phospholipids in the total plasma membrane [23]. Interestingly, after crosslinking of the immunoglobulin E receptor FcεRI, the proportion of polyunsaturated phospholipids in the TX-DRM fraction increased by 12-22%. السبب لذلك غير واضح. It has been shown that TX-DRMs from Jurkat T cells are also enriched in saturated and mono-unsaturated phospholipids [24] and that the production of diacylglycerol from phosphatidylinositols occurs in response to lipid-raft aggregation [25]. In contrast, a floating fraction from epidermal cells prepared without detergents does not have the enrichment of saturated and mono-unsaturated phospholipids [20], although it does have more cholesterol and sphingomyelin than does a mixed membrane fraction.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


Experimental approaches to study contact sites

Contact sites were first observed in electron micrographs (EM) as early as the 1950s, but for several years they were mostly overlooked given their transient nature or variable abundance within different cell types. In addition, to this day it remains challenging to visualize contact sites or purify them and therefore ascertain that they are present, understand their functions and study how environmental and genetic perturbations affect them. Hence, any study wishing to characterize contact-site components or functions faces first the issue of unequivocally identifying the contact, following its function and monitoring its changes upon perturbations. Below are approaches so far employed to study contacts as well as our recommendations for reliable contact-site visualization (See also Table 1 for the summary of pros and cons for each method).

Epifluorescence and confocal microscopy of organelle proximities

Perhaps the most commonly used approach to visualize contacts is confocal microscopy of cells expressing fluorescent proteins targeted to the two compartments of interest, or where markers of the subcellular structures of interest have been appropriately immunostained. This approach was introduced in a landmark paper identifying ER–mitochondria juxtaposition as sites of Ca 2+ transfer between the two organelles 5 . There, it was performed on live cells expressing GFP spectral variants targeted to the two organelles, coupled to fast imaging, deconvolution and 3D reconstruction of ER and mitochondria. This approach has been extended by using multi-spectral image acquisition to visualize six different organelles simultaneously and compute their areas of contact 84 .

While tagging two organelles each with a different color is fast, easy and amenable to adaptation to high-content approaches, it suffers from intrinsic limitations. First, most contact sites are smaller than the optical diffraction limit: on the x–ذ axis, resolution is limited to 250 nm on the ض-axis, point spread functions of microscopes limit resolution to approx. 500-700 nm. Second, chemical fixation and single-plane confocal microscopy can alter contacts and offer a partial representation of interactions that occur in three dimensions. Third, visual quantification of proximity measured in confocal microscopy experiments must be accompanied by indexes of pixel-by-pixel overlap like Pearson’s and Manders’ coefficients. In conclusion, while contact-site measurements based on confocal pseudo colocalization experiments are important, they are more conclusive when (i) accompanied by a second approach that is endowed with a resolution power amenable to detect distances in the range of contact sites (ii) performed on live cells, using piezoelectric z-stepper or other similar approaches, to acquire the whole cellular volume in very short times (iii) accompanied by careful experiments of reconstitution of organelle shape and number to exclude possible artifacts caused by variability in these traits.

Epifluorescence and confocal microscopy of contact-site residents

A different approach to visualize contact sites is based on imaging of characterized contact-site residents. Such residents often have a unique punctate appearance specific to the interface and are therefore very useful for accurate representation of the interaction space. While this approach has been powerful in enabling live imaging of contact sites in various cell types, one must remember that the various residents may not reside in the entire contact site and that it may even be that different contacts exist between the same two organelles 60 . Hence, different patterns for a contact site between the same organelles might result from using different markers. For example, using different tethering molecules to visualize the ER–PM contact gives rise to visualization of domains that are shaped as “patches” (when using E-Syt2/3 45 ) or “punctae” (when using ORP5/8 49,85 ). In addition, such approaches are clearly limited to the analysis of a subset of contacts whose components have already been identified.

Proximity ligation assays for quantifying organelle proximities

Proximity ligation assays (PLA) between two contact-site components on opposing membranes have been employed to extract quantitative information on the distance between two membranes or the extent of contact 86 . This can be very powerful to study alterations that occur in response to genetic or environmental perturbations. While this approach can indeed give a sense of membrane proximities, it also suffers from a number of limitations: first, reductions in PLA signals can be caused by changes in expression or localization of one of the PLA partners second, it requires that the PLA partners are unequivocally localized at the contact site third, it might not recognize changes in contact-site extent not accompanied by changes in proximity between the two proteins measured in the PLA. We, therefore, believe that PLA can be a powerful tool to corroborate protein–protein interaction in situ especially in عبر, but we do not recommend PLA as the tool to measure contact extent. If used it should be very carefully controlled.

FRET/split fluorescence reporters of contacts

Similarly, to PLA, fluorescence resonance energy transfer (FRET) and split fluorescence sensors can detect proximities between two membranes based on the effect of proximity on the fluorescence of the pair and can be used in live cells. Such probes can be broadly divided in three classes:

FRET-based reporters: The transfer of energy between two fluorophores has been used to visualize organelle proximities such as ER–mitochondria juxtaposition 87 . Importantly, FRET reporters are exquisitely sensitive to the distance between the membranes as energy transfer is inversely proportional to the sixth power of distance between the fluorophores, and since no dimerization occurs. By adding a rapamycin-induced dimerization domain, maximal FRET measurements can be obtained, thus enabling quantitative measurements of contact distance at any given time point and cross-sample comparison. The greatest shortcoming of this probe is the requirement for equimolar expression of the two FRET pairs (unless FRET is measured by fluorescence-lifetime imaging microscopy, which is not affected by the relative amount of the two fluorophores). A modified version of an ER–mitochondria FRET-based probe, overcame this complication by expressing the two fluorophores as a single mRNA with a self-cleavable TAV2a sequence between them 88 . By changing the targeting sequence of the individual fluorescent proteins, this approach can be adapted to measure any potential contact site. However, FRET measurements require proficient experimenters and dedicated equipment, thereby limiting the utilization of such probes.

Irreversible split fluorescence probes: Split fluorescence probes, such as split Venus or green fluorescent protein (GFP), are based on the appearance of a fluorescent signal when two nonfluorescent fragments targeted to the partner organelles bind each other once the juxtaposed membranes are in proximity 18,52,89,91,91 . Since it is now clear that a signal appears at the interface no matter which proteins on the two organelles are chosen to be tagged 18 , this approach does not require any pre-existing knowledge about a contact site and enables discovery of novel contact sites. However, these probes suffer from the fact that complementation of the two fragments is thermodynamically stable, leading to contact-site stabilization. In such approaches the dynamics of contact sites cannot be studied, and some contacts may become toxic under some conditions, when they cannot be eliminated. It is important to also remember that these approaches do not discriminate between close associations of organelles and tethered contacts and can cause synthetic expansion of the associations.

Reversible or quasi-reversible fluorescent probes: This method is similar to the above method of bimolecular complementation but depends on usage of protein fragments that have very low intrinsic affinity of the two halves of the fluorophore. So far, two types of such probes have been utilized for contact-site detection: ddGFP 88,92 , which is based on a reversibly dimerizing dsRED fluorescent protein genetically modified to emit in the green zone of the light spectrum (hence called GFP) and split infra-red reporters 52,93 . However, the intrinsically low fluorescence of these probes might restrict their application. Brighter versions will be required for increased usage.

Importantly, all above probes enable proximity measurements between two organellar membranes. While this can be highly important for detecting the presence of a contact site, it should be utilized carefully in measuring the effect of any single tether, functional molecule or spacer. To date, all contact sites described have more than a single tethering pair in them—hence loss of any one protein does not necessarily cause reduction in either the amount of contact or the distance between organelles. Moreover, increased distance between two organelles does not necessarily mean loss of contact and could also represent the formation of alternate, wider, contact areas by an alternate tethering mechanism as a compensation.

Super-resolution and atomic force microscopy

Since contacts are below the diffraction limit of light microscopy, super-resolution 94 , or atomic force microscopy 95 can be powerful tools to accurately visualize them and study the localization and the distribution of the proteins that reside within these structures. Super-resolution methods that can be used include structured illumination microscopy, stimulated emission depletion (STED) microscopy and single molecule localization microscopy, however, all such techniques require highly dedicated microscopes and technical expertise, and despite the ongoing development of sub-diffraction microscopy techniques, their application to contact-site analysis is still limited.

Transmission electron microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is an atomic-resolution microscopy system that provides static, high-resolution, ultrastructure information on contact sites within the cellular context 45,85,96 , which very often cannot be explored with other experimental approaches. Hence, TEM is often considered the “gold standard” for the study of the fine architecture of contact sites and to reveal their morphological and functional diversity. However, this approach is often only useful for either highly abundant contact -sites (rare contact sites will not be spotted in EM fields), or those that have very good marker proteins that can be used for immunodetection 75,97,98 or correlative light electron microscopy (CLEM) approaches 99 . The latter two approaches can also both be used to pinpoint a protein specifically at a contact site and is therefore considered the best proof of it being a resident protein.

Unfortunately, TEM is a very low-throughput technique, affected by the commonly used chemical fixation procedures, limited to the analysis of a single plane, and therefore not suitable to measure the extent of contact in cells unless multiple parameters are taken into consideration (surface of the organelles of interest, extent of the contact, intermembrane distance at the contact etc…) and computed into one index that is applied in extensive morphometric experiments 100 . We therefore recommend that TEM be used to provide qualitative and quantitative features of contact sites but not to study occurrence and changes in the extent, unless rigorous morphometric analyses are included.

Electron tomography (ET)

An exciting “spin-off” of conventional TEM is ET. Conventional and cryo-ET offer the advantage of generating three-dimensional (3D) reconstructions of a cellular structure in a fully hydrated and unstained environment, providing more exhaustive and complete insights into its organization and possible functions. In ET multiple images are captured as the sample is tilted along an axis. The images are then aligned and merged using computational techniques to reconstruct a 3D picture, or tomogram. ET can be combined with immunostaining, allowing localization of proteins in the 3D reconstructions 101 . ET has been successfully employed to study contact sites such as the ER–mitochondria 53,96 or ER–PM 47 as well as to generally map contact sites in small structures such as axons 102 . ET is the most reliable approach to validate the presence of linkers at the contacts 103,104 .

However, ET often requires serial sectioning to reconstruct the 3D model of the entire structure, and the combination of such laborious approaches could be technically challenging. Also, it should be considered that the 3D reconstructions created from ET tilt series of images are not complete representations. This is due to the limited tilt range of the microscope holder in ET that leaves the 3D reconstruction with regions empty of information appearing as undefined cone shaped areas (so-called “missing wedge”). Nonetheless, combined with advances in cryo-ET sample preparation, such as the introduction of focused ion beam milling to thin samples to ideal thicknesses for imaging, the potential for cryo-ET imaging is constantly increasing.

المسح المجهري الإلكتروني

Volume EM techniques based on scanning electron microscopy (SEM) enable high-resolution 3D imaging of large specimen volumes. 3D-SEM techniques overcome the artifact of the “missing wedge” in ET, and are therefore a potent tool for gaining insight into the 3D morphology of contacts 105 . However, despite recent improvements, 3D-SEM resolving power is still limited and requires extended research time and computer power for processing the large amount of datasets produced.

Cell fractionation

The biochemical characterization of contact sites occurred contemporaneously with their discovery by EM. Commonly, protocols for isolating membrane contacts utilized subcellular fractionation followed by sucrose gradient centrifugation. Any successful isolation of heterotypic contacts must consider that these have features of two organelles or maybe of neither. Moreover, purification of such contact regions can be challenging as they need to resist dilution and cell fractionation. Additionally, during the lengthy fractionation procedure, potential protein modifications and interactions (such as phosphorylation or dimerization) might be reversed, which could destabilize or alter contacts.

Most of the early protocols that biochemically detected interorganellar contacts dealt with areas of strong association between ER and mitochondria. As early as the 1950s, it was observed that liver mitochondria preparations obtained from sucrose fractionation were “always contaminated with ER” 106 . The characterization of lipid-synthesizing membranes in the early 1970s assigned mitochondrial lipid synthesis to these contacts, although this was not formally recognized 107,109,109 . Following this insight, attempts to subfractionate domains of the ER led to further insight about this contact such as that it comprised only a specific portion of the rough ER membrane 110,112,112 . The real breakthough came with the identification of specific enzymes enriched in these domains, cementing the understanding that these were unique sites of lipid transfer between the two organelles 4,113,115,115 . These sites, from thereon termed mitochondria-associated membranes, became the first functional characterization of a contact-site function.

Similar to ER associations with mitochondria, the isolation of the PM via sucrose gradients from reticulocytes led to the identification of ER tethered to the PM 116 , but the significance of this finding, in particular for Ca 2+ entry, was initially overlooked. PM-associated membranes were also shown to have unique lipid biosyntehtic capacities 6 .

The biochemical isolation of ER–peroxisome contacts (EPCONS) 117,119,119 takes advantage of the sustained attachment of ER tubules to peroxisomes under conditions that separate mitochondria from peroxisomes. Moreover, they have enabled proteomic analysis of these contacts 117 .

Hence, biochemical fractionation assays for contact sites are important tools for studying functional aspects of the contacts as well as identifying their unique lipid composition and resident proteins. Unfortunately, such protocols have not yet been developed for all contact sites.

Proximity labeling

A new way to define contact-site proteins is by using biotinylation approaches. APEX 120 has been used to identify new contact-site proteins 121 . At the heart of this methodology lies an engineered version of ascorbate peroxidase (APEX), which can catalyze the oxidation of biotin phenol. This radical version of phenol is both short lived (<1 ms), has a small labeling radius (<20 nm), and can covalently react with electron-rich amino acids (Tyr, Trp, His, and Cys). Thus, by localizing the APEX protein to a contact site and then shortly exposing the cell to hydrogen peroxide and biotin phenol, all proteins within this compartment will be modified by biotin. Biontinylated proteins can then be easily extracted using the well-established streptavidin system, and identified via mass spectrometry. If no proteins are known for a specific contact it is possible to map the entire proteome of the outer membrane of two organelles and then look for overlapping proteins which may be residents of the contact sites 122 . APEX has also been used alongside biochemical fractionation to reach a better purity of contact residents 121 . In addition, a split APEX 123 has recently been created, enabling each half to be expressed on one organelle and complementation to occur only at contact sites. Similarly, a nonspecific biotin ligase such as the BirA* can be used to biotinylate proximal proteins in a method called BioID 124,125 . A split-BioID has been described 126 which, again, can be used to study contact sites by labeling two opposing membranes and retrieving biotinylation activity only at the areas of interface.

Functional studies and genetics

Since each contact site has its unique function, different approaches will be required to measure the functionality of a contact. For example, a great deal of attention has been given to transfer of lipids 127 and Ca 2+ 53 at ER–mitochondria or at ER–PM contacts. Such approaches should be developed to appraise if changes in contact extent or composition affects cellular physiology. Appropriate functional analyses need to be performed in combination with the imaging approaches detailed above, to draw conclusions on whether contact sites are present and/or changed in the studied system.

Care should be taken not to confuse a lack of effect on any singular function as an indication that a protein is not a tether or a functional contact-site protein. This is because deletion of a tether is often backed up by many other tethering molecules and its effect will therefore not necessarily be measurable if a function that it does not carry out is measured (for example, deletion of a lipid-binding tether which probably functions in lipid transfer and measurement of the effect of Ca 2+ transfer).

Conversely, many tethers have functions outside of the contact site and thus their loss-of-function phenotype may not be due to their contact-site role. To give just one example, many of the mitochondrial contact-site proteins in yeast (Mdm10, Tom70 and Tom40 59,62,128,129 ) function in both tethering as well as mitochondrial protein translocation. In such cases, it is necessary to generate separation-of-function alleles to inactivate just contact sites while maintaining the other function.


Integral Protein Structure

While the structure of an integral protein outside of the plasma membrane binding region can vary widely based on function, there are only three common themes of binding to the plasma membrane within living cells that we currently know of. The first two involve the sequence of amino acids which makes up the protein, and the third involves a modification to the protein after it is created which gives it a lipid-based anchor within the plasma membrane.

The Alpha Helix

The alpha-helix is a shape produced by a certain chain of amino acids which looks exactly as its name implies. The interactions between the amino acids next to each other make a downward and inward bend, creating a structure similar to a spiral staircase. Alpha helices tend to be non-polar, giving them a distinct advantage to staying bound within the hydrophobic tail-region of the membrane. أ transmembrane alpha helix spans all the way through the membrane. An integral protein may only have one region of alpha helix, as shown in the far left of the image below.

Many other proteins employ several alpha helices, which span the membrane. This allows for the creation of a protein channel, or a hole in the plasma membrane which allows various substances to pass. Common among bacteria is the third image, the beta barrel.

The Beta Barrel

أ ورقة بيتا is a complexly folded chain of amino acids which forms a flattened, rigid sheet. Like the alpha helix, it is one of the principle shapes a chain of amino acids can take on. When many beta sheets extend through the membrane, creating a pore, the structure is called a beta barrel. The outsides of the beta sheets have hydrophobic residues, and the integral protein can be locked into the plasma membrane. Like the transmembrane alpha helix, the beta barrel requires the correct sequence of amino acids for the integral protein to maintain contact with the membrane.

The Lipid Anchor

أ lipid anchor is a non-polar, hydrophobic attachment to some proteins which allows it to be embedded within the plasma membrane. Instead of being coded into the genetic code of the protein, the protein itself is modified through a different process. Through a biochemical reaction, a fatty acid or other lipid is covalently bonded to the protein itself, usually at one end. The lipid is then used in the constitution of the plasma membrane, where it becomes trapped by its nature with the other lipids of the tail regions of the الفسفوليبيد. An integral protein with a lipid anchor is not picture in the above image.

1. Which of the following is the defining feature of an integral protein?
أ. Portion which binds to the hydrophobic region of the plasma membrane
ب. Attaching to the plasma membrane in any way
ج. Conducting enzyme reactions near the membrane

2. A scientist in the laboratory has learned how to separate integral proteins from the plasma membrane. He simple puts cells in a solution containing detergent, like dish soap, and the proteins are extracted from the membrane. What must detergent be doing to the proteins to extract them whole?
أ. Destroying the bonds of their amino acids
ب. Replacing the bonds of the plasma membranes with those of the detergent molecules
ج. Physically cutting the integral protein from the membrane

3. By only looking at the genetic code, what is one way to distinguish an integral protein from a protein which does not bind to the membrane?
أ. There is no way to tell simply by looking at the genetics
ب. Look at how many A’s vs T’s there are in the code
ج. Look for signs of alpha helices and beta barrels


شاهد الفيديو: Protein Digestion and Absorption (شهر نوفمبر 2021).