معلومة

9: حفظ البروتين - علم الأحياء


أهداف التعلم

في نهاية هذا المختبر ، يجب أن يكون الطلاب قادرين على:

  • تحديد الأحماض الأمينية برمزها المكون من حرف واحد.
  • شرح الفروق بين الدرجات العالية والمنخفضة في مصفوفة بلوزوم 62.
  • استخدم خوارزمية BLASTP لمقارنة تسلسل البروتين.
  • تحديد المناطق المحفوظة في محاذاة متعددة التسلسل.

مع تطور الأنواع ، تتغير بروتيناتها. يختلف معدل تغير تسلسل البروتين الفردي بشكل كبير ، مما يعكس الضغوط التطورية التي تتعرض لها الكائنات الحية والدور الفسيولوجي للبروتين. هدفنا هذا الفصل الدراسي هو تحديد ما إذا كانت البروتينات المشاركة في التخليق الحيوي Met و Cys قد تم حفظها وظيفيًا بين S. بومبي وس. الخباز، الأنواع التي تفصل بينها ما يقرب من مليار سنة من التطور. في هذا المعمل ، سوف تبحث في قواعد البيانات عن متماثلات S. cerevisiae تسلسل في عدة أنواع ، بما في ذلك S. بومبي. متماثلون هي تسلسلات DNA متشابهة تنحدر من جين شائع. عندما يتم العثور على متماثلات في أنواع مختلفة ، يشار إليها باسم تقويم العظام.

يشار إلى المتماثلات داخل نفس الجينوم باسم Paralogs. Paralogs تنشأ عن طريق الازدواجية الجينية ، ولكنها تتنوع بمرور الوقت وتتولى وظائف متميزة. على الرغم من حدوث ازدواجية في الجينوم بالكامل أثناء تطور S. cerevisiae (كيليس وآخرون.، 2004) ، فقط عدد قليل من الجينات في ممر الميثيونين الفائق لها نظائر بارالوج. ومن المثير للاهتمام، MET17 هو نظير لثلاثة جينات تشارك في نقل الكبريت: STR1 (CYS3), STR2 و STR4، مما يعكس ازدواجية الجينات المتعددة. يمنح وجود هذه الإنزيمات الأربعة المميزة مرونة غير عادية S. cerevisiae في استخدامه لمصادر الكبريت. ال SAM1 و SAM2 الجينات هي أيضًا نظائر Paralogs ، لكن تسلسلها ظل متطابقًا تقريبًا ، مما يوفر تكرارًا وظيفيًا إذا تم تعطيل أحد الجينات (الفصل 6).

ترتبط وظيفة البروتين ارتباطًا وثيقًا بهيكلها. سوف تتذكر أن الشكل النهائي المطوي للبروتين يتم تحديده من خلال تسلسله الأساسي ، تسلسل الأحماض الأمينية. تتغير وظائف البروتين بسرعة أقل أثناء التطور عندما تكون بدائل الأحماض الأمينية متحفظة. تحدث البدائل المحافظة عندما يتشابه حجم وكيمياء سلسلة جانبية جديدة من الأحماض الأمينية مع تلك التي تحل محلها. في هذا المعمل ، سنبدأ بمناقشة سلاسل الأحماض الأمينية الجانبية. ستستخدم بعد ذلك خوارزمية BLASTP لتحديد أخصائيي تقويم العظام في العديد من الكائنات الحية النموذجية. ستقوم بإجراء محاذاة تسلسلية متعددة تميز المناطق التي يتم الحفاظ عليها بدرجة أكبر من غيرها.

أثناء العمل خلال التمارين ، ستلاحظ أن تسلسل البروتين في قواعد البيانات مكتوب في رمز مكون من حرف واحد. يعد الإلمام بالرمز المكون من حرف واحد مهارة أساسية لعلماء الأحياء الجزيئية اليوم.


يقترح حفظ البروتين وتنوعه آليات تعديل نوع الخلية المحدد لمسارات الإشارة

الانتماءات EMBL / CRG Systems Biology Research Unit، Center for Genomic Regulation (CRG)، Barcelona، Spain، Universitat Pompeu Fabra (UPF)، Barcelona، Spain، Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)، Barcelona، Spain

الانتسابات وحدة أبحاث بيولوجيا أنظمة EMBL / CRG ، مركز تنظيم الجينوم (CRG) ، برشلونة ، إسبانيا ، جامعة بومبيو فابرا (UPF) ، برشلونة ، إسبانيا


يرتبط نمط حفظ الأشكال الخطية القصيرة ارتباطًا وثيقًا بوظيفة مجالات البروتين المتفاعلة

خلفية: تتعرف العديد من المجالات الممثلة بشكل جيد على التسلسلات الأولية التي يقل طولها عن 10 أحماض أمينية ، تسمى الزخارف الخطية القصيرة (SLiMs). كان التنبؤ الدقيق بـ SLiMs صعبًا لأنها قصيرة (غالبًا & lt 10 من الأحماض الأمينية) ومتحللة للغاية. في هذه الدراسة ، قمنا بدمج مصفوفات التسجيل المستمدة من مكتبة الببتيد وتحليل الحفظ لتحديد فئات البروتين المخصب من SLiMs الوظيفية المعترف بها من قبل مجالات SH2 و SH3 و PDZ و S / T kinase.

نتائج: كشف نهجنا المشترك أن SLiMs محفوظة بدرجة عالية في بروتينات من فئات وظيفية معروفة بتفاعلها مع مجال معين ، لكنها غير محفوظة في معظم مجموعات البروتين الأخرى. لقد وجدنا أن SLiMs التي تم التعرف عليها بواسطة مجالات SH2 تم حفظها بشكل كبير في كينازات المستقبلات / الفوسفاتازات وجزيئات المحولات وكينازات التيروزين / الفوسفاتازات ، وأن SLiMs التي تم التعرف عليها بواسطة مجالات SH3 كانت محفوظة بشكل كبير في الهيكل الخلوي والبروتينات المرتبطة بالهيكل الخلوي ، والتي تم التعرف عليها من قبل مجالات PDZ. محفوظة بشكل كبير في بروتينات الغشاء مثل القنوات والمستقبلات ، وأن SLiMs التي تم التعرف عليها بواسطة مجالات S / T kinase تم حفظها بشكل كبير في جزيئات المحول ، و Kinases S / T / phosphatases ، والبروتينات المشاركة في النسخ أو التحكم في دورة الخلية. لقد درسنا Tyr-SLiMs التي تم التعرف عليها بواسطة مجالات SH2 بمزيد من التفصيل ، ووجدنا أن Tyr-SLiMs المتعرف عليها SH2 على الجانب السيتوبلازمي لبروتينات الغشاء محفوظة بدرجة أكبر من تلك الموجودة على الجانب خارج الخلية. أيضًا ، وجدنا أن Tyr-SLiMs المتعرف عليها SH2 والمرتبطة بزخارف SH3 وعزف فسفرة التيروزين كيناز محفوظة بدرجة أكبر.

استنتاج: ينعكس التفاعل في مجالات البروتين من خلال الحفظ التطوري لـ SLiMs المعترف بها من قبل هذه المجالات. من خلال الجمع بين مصفوفات التسجيل المستمدة من مكتبات الببتيد وتحليل الحفظ ، سنكون قادرين على العثور على مجموعات البروتين التي من المرجح أن تتفاعل مع مجالات معينة.


تمارين الحفظ

قد تجد مستكشف الأحماض الأمينية من NCBI مفيدًا في هذا التمرين.

1. تحت التسلسل الأميني أدناه ، اكتب نفس التسلسل باستخدام الرمز المكون من حرف واحد. Met-Glu-Asn-Asp-Glu-Leu-Pro-Ile-Cys-Lys-Glu-Asp-Pro-Glu-Cys-Lys-Glu-Asp

2. ما هو صافي تكلفة هذا الببتيد؟ (حدد -1 لكل حمض أميني حمضي و +1 لكل حمض أميني أساسي. اجمع الشحنات الإجمالية.)

3. باستخدام مخطط Venn أعلاه ، اقترح بديلًا متحفظًا لما يلي:
Trp & # 8211 His & # 8211 Arg & # 8211 Leu & # 8211

4. اكتب اسم مجموعة موسيقية تستمتع بها. ثم انقل الاسم إلى تسلسل حمض أميني مكتوب برمز مكون من 3 أحرف. قم بتمرير تسلسل الأحماض الأمينية إلى صديق واطلب منه / لها فك تشفيرها. (ملاحظة: يستخدم الرمز المكون من حرف واحد كل الأبجدية ، باستثناء B و J و O و U و X و Z).

تمرين 2 & # 8211 مصفوفة BLOSUM62
  1. ابحث عن درجات BLOSUM الخاصة بالبدائل المحافظة التي اقترحتها في التمرين 1. هل تدعم بيانات BLOSUM فرضياتك؟
  2. أوجد الاثنين بدائل مع أعلى درجات BLOSUM. ما هي الطرق التي تشبه الخواص الكيميائية الحيوية للحمض الأميني البديل أو تختلف عن الأحماض الأمينية التي تحل محلها؟
  3. ابحث عن الأحماض الأمينية الثلاثة التي لا يوجد دليل على حدوث بدائل للأحماض الأمينية بشكل متكرر أكثر مما تم توقعه بالصدفة وحدها. ما هي الميزات الخاصة التي تتمتع بها هذه الأحماض الأمينية؟
التمرين 3 & # 8211 باستخدام BLASTP
  1. قم بتوجيه المستعرض الخاص بك إلى NCBI BLAST. اختر بروتين بلاست.
  2. أدخل رقم NP_ لـ S. cerevisiae البروتين الذي تدرسه مجموعتك.
  3. اختر السجلات المراد البحث عنها. لقاعدة البيانات ، حدد البروتينات المرجعية. بالنسبة للكائن الحي ، اكتب نيوروسبورا كراسا. (هذا هو Taxid 5141 من مربع القائمة المنسدلة.)
  4. قم بتوسيع معلمات الخوارزمية في أسفل الصفحة. سنستخدم القيم الافتراضية لحجم الكلمة (= 3) وقيمة العتبة (= 10) وعقوبة الفجوة (= 11). يمكن جعل البحث أكثر صرامة عن طريق زيادة حجم الكلمة أو قيمة الحد أو عقوبة الفجوة. يمكن جعل البحث أقل صرامة عن طريق تقليل هذه القيم.
  5. انقر فوق بلاست وانتظر ظهور النتائج.
  6. تحليل صفحة النتائج:
    • يمنحك الملخص الرسومي في الجزء العلوي نظرة عامة فورية حول مدى وقوة المباراة ن. كراسا التسلسلات. تُستخدم الألوان لتمييز المحاذاة بنطاقات مختلفة من درجات البت. يمثل السطر العلوي تطابقًا بين S. cerevisiae بروتين Metp وأقربه ن. كراسا تقويم العظام. قد تكون هناك مباريات أقصر وأقل أهمية مع الآخرين ن. كراسا تسلسل البروتين.
    • يوفر جدول الملخص البيانات الرقمية. المطابقات ذات القيمة E 1E-10 أو أقل وإجمالي الدرجات الأعلى من 100 من المرجح أن تكون مهمة.
    • حرك المؤشر لأسفل لرؤية المحاذاة الفعلية بين التسلسلات. تم إدخال الشرطات إلى أي من S. cerevisiae أو ن. كراسا تسلسل حيث تقطع الفجوات المحاذاة. يلخص الصف الأوسط التماثل بين متواليات البروتين. إذا تم حفظ حمض أميني بين النوعين ، فسيتم عرض رمزه المكون من حرف واحد. تشير علامات الجمع إلى البدائل المتحفظة ، أي الاستبدالات بقيم BLOSUM 1 أو أكثر.
    • سجل رقم XP الخاص بك: XP_______________ (XP_ هو أحد أقدم x المستخدمة لتحديد التسلسلات "المنمذجة" ، في هذه الحالة تسلسل بروتين محدد بتحليل التسلسل ولكن ليس بالضرورة تأكيد وظيفي. هذا صحيح بالنسبة لأي جين أو mRNA أو بروتين ببادئة X ).
    • انقر فوق الارتباط المؤدي إلى سجل XP_ لملف ن. كراسا تقويم العظام. عند التمرير لأسفل ، يجب أن تجد تسمية "CDS" توفر لك معلومات حول الجين الذي يشفر البروتين الخاص بك.
    • ابحث عن رقم NCU ، هذا هو ن. كراسا تعيين قاعدة بيانات للجين الذي يشفر البروتين الخاص بك. سجل رقم NCU (ستحتاجه لاحقًا اليوم) ______________
    • لاحظ أيضًا ما إذا كان الجين الخاص بك له اسم جيني ، على سبيل المثال N.crassaMET2 يُعرف homolog باسم MET5. لم يتم تسمية جميع الجينات (أرض أكثر خصوبة بالنسبة لنا لتمييزها!) هل يمتلك جينك اسمًا ، إذا كان الأمر كذلك سجل هنا: ___________________
التمرين 4 & # 8211 محاذاة تسلسلية متعددة

يوفر BLASTP محاذاة زوجية للتسلسلات التي تكون مفيدة جدًا لتحديد المتماثلات. تقارن محاذاة التسلسل المتعددة عددًا أكبر من التسلسلات في وقت واحد. من خلال مقارنة عدد أكبر من التسلسلات على مدى تطوري أوسع ، تسمح محاذاة التسلسل المتعددة للباحثين بتحديد مناطق البروتين الأكثر حفظًا ، وبالتالي ، من المرجح أن تكون مهمة لوظيفة البروتين. في هذا التمرين ، سوف ندرس الحفاظ على تسلسل البروتين في عدد من الكائنات الحية النموذجية التي تستخدم على نطاق واسع في الدراسات الجينية. تم ترتيب جينومات الكائنات الحية النموذجية ، وتم تطوير تقنيات التحليل الجيني بشكل جيد. بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر قاعدة البيانات والموارد المستنسخة لدعم البحث مع الكائنات الحية النموذجية. تم اختيار الكائنات الحية أدناه لأنها تمثل فروعًا مهمة للتطور ولأنها مرشحة محتملة للبحث في المستقبل في هذه الدورة.

بكتيريا & # 8211 يمثلان قسمين رئيسيين من البكتيريا

  • الإشريكية القولونية سلالة K-12 (جرام سالب K-12 هو سلالة المختبر القياسية)
  • العصوية الرقيقة سلالة 168 (سلالة مرجعية موجبة غرام)

حقيقيات النواة & # 8211 نموذج الكائنات الحية

  • خميرة الخميرة & # 8211 يجب تضمينها في الأشجار والمحاذاة!
  • نيوروسبورا كراسا
  • نبات الأرابيدوبسيس thaliana & # 8211 نموذج كائن حي الرشاد للنباتات المزهرة
  • أنواع معينة انيقة & # 8211 كائن نموذج النيماتودا المستخدم في الدراسات التنموية
  • موس العضلات & # 8211 فأرة المختبر
اجمع التسلسلات وبيانات بلاست

تتمثل الخطوة الأولى في محاذاة التسلسل المتعدد في جمع بيانات التسلسل وتحليل بيانات BLASTP التي تقارن التسلسلات مع S. cerevisiae تسلسل. سنستخدم التسلسلات المرجعية للكائنات الحية ، والتي تبدأ برقم NP___. نظرًا لأنك تعرف بالفعل كيفية العثور على سجلات NP____ واستخدام BLASTP ، فسنأخذ بعض الاختصارات للعثور على الأرقام المتبقية وإحصائيات BLASTP. بالنسبة للتسلسلات حقيقية النواة ، سنستخدم بيانات BLASTP المتوفرة بالفعل في قاعدة بيانات NCBI Homologene في NCBI (Sayers et al. ، 2012). ستكون أرقام الانضمام للأنواع البكتيرية متاحة على Canvas وفي المختبر.

انقر فوق إصدار الإحصائيات لرؤية الأنواع التي تم تضمينها في الباحثين BLASTP. أدخل اسم الجين الخاص بك في مربع البحث. يُظهر هذا مجموعات متجانسة مختلفة لها جين بهذا الاسم. إذا كان البحث ينقلك إلى صفحة بها أكثر من قائمة مجموعة متجانسة واحدة ، فانقر فوق مجموعة Homologene التي تحتوي على جين S. cerevisiae.

سجل رقم المدخل لمجموعة Homologene:

يوفر السطر العلوي من سجل Homologene رقم المدخل ويلخص التوزيع التصنيفي للمتماثلات في حقيقيات النوى ("الجين المحفوظ في _________") يمكن العثور على بروتين محفوظ ضيقًا فقط في Ascomycota ، بينما يمكن العثور على البروتين الموزع على نطاق واسع في حقيقيات النوى.

ما هي الانقسامات الجينية التي لها متماثلات لجينك؟

يحتوي العمود الأيسر من كل سجل Homologene على روابط لملخصات جينية شاملة أعدها القيمون على NCBI. يحتوي العمود الأيمن على روابط لسجلات NP___ ورسم يوضح المجالات المحفوظة في المتجانسات. (تمت ملاحظة منطقة المجالات بألوان مختلفة.)

كم عدد المجالات الموجودة في S. cerevisiae بروتين؟ هل المجالات متساوية في الحفاظ عليها بين الأنواع؟

قم بتسجيل أرقام NP___ أو XP ___ لمثيلاتك S. cerevisiae بروتين Metp in ن. كراسا ، أ. ثاليانا ، سي إيليجانس و M. العضلات. أضف NP__ أو XP ___ أرقام لـ بكتريا قولونية و B. الرقيقة متجانسات من ورقة البيانات المنشورة. (قد تحتوي بعض السجلات البكتيرية على بادئات XP__ أو ZP___ ، لأن البروتينات لم يتم دراستها تجريبيًا.) إذا كان لديك أقل من خمسة إدخالات ، على سبيل المثال يقتصر البروتين بشكل ضيق على Ascomycota ، أضف نوعين إضافيين من مجموعة Homologene التي تحتوي على homolog الخاص بك.

ملحوظة: هل لدى أخصائي تقويم N. crassa الخاص بجين MET اسم مختلف؟ ستحتاج إلى هذه المعلومات لاحقًا في هذا الفصل.

بعد ذلك ، قم بإجراء محاذاة BLASTP الزوجية لكل تسلسل مقابل S. cerevisiae تسلسل. يعد جمع بيانات BLASTP أمرًا سهلاً مع Homologene: استخدم المربع الرمادي على الجانب السفلي من الصفحة لإعداد كل مقارنة BLASTP. سجل النتيجة الإجمالية ، النسبة المئوية للتغطية والقيمة الإلكترونية لكل مباراة.

في الخطوة التالية ، ستقوم بإعداد محاذاة تسلسل متعدد باستخدام معلومات التسلسل في سجلات NP___ أو XP ___. باستخدام بيانات BLASTP ، قد يكون من الممكن استبعاد بعض التسلسلات من مزيد من الدراسة. سيكون لأفضل التطابقات إجمالي درجات عالية وتغطية٪ (جزء من البروتينين المتوافقين) وقيم E منخفضة. بالنسبة لبقية هذه المهمة ، استبعد التسلسلات حيث تكون الدرجة الإجمالية أقل من 100 وتكون قيم E أكبر من 1E-10.

قم بإعداد محاذاة التسلسل المتعدد.

سوف نستخدم مجموعة البرامج المتعلقة بالتسلسل لبناء تسلسل محاذاة متعددة وشجرة نسالة. يصف علم الوراثة نفسه بأنه يوفر "تحليل جيني قوي للتطور لغير المتخصصين." ستعمل مع المواد في موقعين مختلفين ، لذا فأنت بحاجة إلى صفحتين من صفحات المستعرض التشغيليين. يجب أن تظل علامة تبويب المتصفح واحدة في NCBI ، حيث ستسترد السجلات. قم بتوجيه صفحة المتصفح الأخرى إلى www.phylogeny.fr

  1. تحت عنوان علامة التبويب Phylogeny Analysi s ، حدد نقرة واحدة. بعد إدخال البيانات ، سيتم إحضار التسلسلات الخاصة بك تلقائيًا من خلال خوارزميات المحاذاة المتعددة وبناء شجرة النشوء والتطور. يسمح لك الخيار المتقدم في هذه الصفحة بضبط المعلمات المرتبطة بكل برنامج. سوف ندع نسالة النسل تتخذ هذه القرارات نيابة عنا!
  2. أدخل تسلسل البروتين بتنسيق FASTA. للحصول على ملف FASTA ، أدخل NP__number في مربع البحث في قاعدة بيانات NCBI Protein Database. (بدلاً من ذلك ، يمكنك النقر فوق سجل NP_ من صفحة ملخص Homologene.) يجب أن يكون التسلسل الأول في تحليلك هو بروتين S. cerevisiae. انقر فوق ارتباط FASTA في الجانب الأيسر العلوي من سجل NP. انسخ سطر العنوان ، بدءًا من & gt وتسلسل الأحماض الأمينية بالكامل. الصق تسلسل FASTA مباشرة في مربع نص نسالة. كرر هذه الخطوة مع كل التسلسل الذي ترغب في مقارنته.
  3. قم بتحرير سطور عنوان ملفات FASTA لتضمين اسم الأنواع فقط. (سترى السبب لاحقًا!) يجب أن يبدأ كل سطر عنوان FASTA برمز & gt (منقار الطيور) وينتهي بإرجاع صعب. توفر هذه الأحرف علامات الترقيم للكمبيوتر. لا تستخدم محرر نصوص أو معالج عمل لتحرير ملفات FASTA ، حيث إنها تقدم علامات ترقيم مخفية تتداخل مع تحليل النشوء والتطور.
  4. عند الانتهاء ، أدخل عنوان بريدك الإلكتروني (هذا مفيد إذا كنت تريد العودة إلى تحليلك في الأيام القليلة المقبلة) وانقر فوق الزر إرسال. سيتم نشر نتائجك على صفحة الويب.
تصدير وطباعة محاذاة التسلسل المتعدد
  1. انقر فوق علامة التبويب "محاذاة" لعرض محاذاة التسلسل المتعدد.
  2. تحت النواتج ، اطلب المحاذاة بتنسيق ClustalW. تظهر محاذاة Clustal W على صفحة ويب جديدة. لاحظ أن الحد الأدنى لكل مجموعة يشير إلى ما إذا كان الحمض الأميني ثابتًا في الموضع بعلامة النجمة. يشار إلى مواقع الأحماض الأمينية المحفوظة بواسطة النقطتين في المحصلة النهائية.
  3. انقر بزر الماوس الأيمن على الصفحة وقم بتنزيل محاذاة Clustal باسم ملف جديد يناسبك. سيتم تنزيل الصفحة كملف نصي تفتحه في Word أو محرر نصوص.
  4. افتح الملف في معالج النصوص. اضبط حجم الخط وفواصل الصفحات بحيث تتم محاذاة التسلسلات بشكل صحيح وملاءمة جميع أعضاء الكتلة في نفس الصفحة. اختر خطًا غير متناسب مثل Courier بحيث تصطف الأحماض الأمينية بشكل صحيح.
  5. اطبع الملف و تحقق من صحة التنسيق! قم بتحويله مع مهمة نسالة.
بناء شجرة النشوء والتطور.
  1. انقر فوق علامة التبويب عرض الشجرة للوصول إلى شجرة النشوء والتطور.
  2. يمكنك استخدام أدوات التحرير لتغيير مظهر شجرتك. انتبه بشكل خاص للأساطير الموجودة في "أوراق" الشجرة ، والتي يجب أن تحمل أسماء الأنواع.
  3. قم بتنزيل الملف بتنسيق من اختيارك. اطبع الملف وقم بتسليمه باستخدام مهمة نسالة.
يفتش ن. كراسا متماثلون
  • العودة إلى NCBI Homologene. ن. كراسا يجب أن يكون أحد الكائنات الحية المدرجة لاحتوائه على متماثل للجين الذي يهمك. تحت الانضمام الجيني ، لاحظ حجم البروتين المتماثل في الأحماض الأمينية (أأ): _______________________
  • انقر فوق اسم الكائن الحي ، ن. كراسا، ليتم نقلها إلى صفحة NCBI الخاصة بالجينات. تحت عنوان "مناطق الجينوم ، منتجات الترانسكريبس ومنتجات الأمبير" لاحظ موقع الجين الخاص بك على ن. كراسا الكروموسومات. انتبه بشكل خاص لوجود أي إنترونات ، وهي قطع صغيرة من الحمض النووي التي يتم فصلها من الحمض النووي الريبي قبل ترجمتها. في الرسم البياني للجين الخاص بك ، يُشار إلى الإنترون بجزء شاغر من سهم الجين. بالإضافة إلى ذلك ، في القسم المسمى "السياق الجينومي" ، يتم إعطاؤك عدد exon. يشير أحد exon إلى 0 introns ، بينما يشير 2 exons إلى 1 intron وهكذا.
  • هل الجين الخاص بك لديه أي إنترونات؟ إذا كان الأمر كذلك ، فكم عددها؟ ________________ الإنترونات شائعة جدًا في ن. كراسا الجينات ، وكان لابد من أخذها في الاعتبار عند استنساخ تسلسل الجينات ليتم التعبير عنها في S. cerevisiae. حقيقة، S. cerevisiae غير قادر على معالجة الإنترونات من الحمض النووي الأجنبي ، لذلك ، تم استخدام الحمض النووي الريبي المعالَج مسبقًا (يسمى cDNA) كقالب استنساخ للجينات التي تهمنا.
أ نيوروسبورا كراسا قاعدة البيانات

يحب S. cerevisiae، N. crassa هو كائن نموذجي له مجتمعه الكبير من الباحثين. يوجه معهد برود ، الواقع في كامبريدج ، ماساتشوستس ، عمليات البحث الجينومي للعديد من الكائنات الحية ، بما في ذلك ن. كراسا. الوصول إلى قاعدة البيانات هذه هنا.


المسارات عبر الزمن: الجينوميات الوظيفية في المختبر التمهيدي

يشتمل هذا الموقع على مواد دراسية من BIOL2040 (BI204 سابقًا) & # 8211 التحقيقات في بيولوجيا الخلية الجزيئية. يقدم هذا المساق للطلاب علم بيولوجيا الخلايا الجزيئية في سياق مشروع بحثي لمدة فصل دراسي في علم الجينوم الوظيفي. في ال المسارات عبر الزمن مشروع ، يدرس الطلاب الحفظ التطوري للجينات في تخليق الميثيونين. يتضمن كل فصل مادة أساسية نظرية بالإضافة إلى إجراءات تجريبية مفصلة. يمكن استخدام الفصول منفردة أو مجتمعة ، حسب الدورة. تم اختبار جميع التجارب بدقة مع طلاب كلية بوسطن. تعرف على المزيد حول الدورة التدريبية ونتائج الطلاب من ورقتنا البحثية في CBE-Life Science Education أو من عرضنا التقديمي في اجتماع ASMCUE لعام 2015.

نرحب بالطلاب والمعلمين لاستخدام مواد الفصل ، والتي تم تطويرها بدعم سخي من مؤسسة العلوم الوطنية. لقد حاولنا تصميم دورة تدريبية مرنة ، ونود أن نسمع كيف يتم استخدام المواد. يرجى الاتصال بـ Clare O & # 8217Connor أو Doug Warner للحصول على مزيد من المعلومات.

/>
التحقيقات في بيولوجيا الخلية الجزيئية بواسطة Clare M. O & # 8217Connor مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


C. ايليجانس كنموذج لدراسة دور عزر CxCxxC

يظهر تحليلنا ذلك ، على عكس D. melanogaster, C. ايليجانس هو نموذج ممتاز لدراسة دور المجال التنظيمي المنفصل ، لأنه متعامد مع ذلك في البشر. كما هو متوقع ، يتم حفظ المخلفات المتعددة ، الموزعة في جميع أنحاء هذا المجال (ملف إضافي 4) ، بين فصل الديدان الخيطية ، والتي تختلف عن المخلفات المحفوظة بين فواصل الفقاريات. لا توجد أي من هذه المخلفات المحفوظة على اتصال مع chaperone المثبط للفصل ، سيكورين. طبيعة هذا الحفظ لا تزال غير واضحة. لا يبدو أن أيًا من البقايا المحفوظة للغاية تشكل اتصالًا مع بقايا أخرى محفوظة بشكل مشابه ، كما يتضح من قرب كربون بيتا على بنية الفصل (ملف إضافي 5). ومع ذلك ، لم يتم ملاحظة أي تغييرات في هذه البقايا في المتغيرات الأليلية البشرية أو مجموعات السرطان المتسلسلة مما يعني أن الطفرات في هذه الأماكن قد تكون قاتلة (ملف إضافي 6). الأهم من ذلك ، حدوث طفرة في عزر CxCxxC الذي تم تحديده حديثًا (C450Y) من C. ايليجانس منفصل (sep-1 (e2406)) ينتج عنه نمط ظاهري حساس لدرجة الحرارة يؤدي إلى عيوب في إفراز الخلايا [12 ، 33]. حددنا مثبطات متعددة داخل الجين sep-1 (e2406) التي تقدم الطفرات إلى المجال التنظيمي حصريًا [34]. لا يتم حفظ هذه المواقف ، ولا تتصل بـ Securin ويتم توزيعها في جميع أنحاء المجال التنظيمي (ملف إضافي 4). سيتطلب فهم تأثيرات هذه الطفرات مزيدًا من البحث ، لكن اكتشافنا أن المجال التنظيمي للفصل له عناصر محفوظة متميزة يدعم بقوة أهميته الوظيفية. في المستقبل ، سيكون من الأهمية بمكان تحديد الشكل النشط للفصل المنفصل والتحقيق في الدور الوظيفي لهذه الفكرة. يوضح تحليلنا أيضًا فائدة الدراسات في C. ايليجانس في فهم تنظيم الفصل في البشر.


أساليب

مقارنات بين المتصورة المنجلية و P. chabaudiتقويم العظام

أنواع الملاريا القوارض المتصورة تشابودي تم استخدامه كأنواع مقارنة نظرًا لحالتها من حيث إكمال الجينوم. تم الحصول على تسلسل البروتين والحمض النووي (إصدار Plasmodb: 2009.03.24) من Plasmodb.org. تم اختيار أربعين زوجًا من المتواليات المتعامدة ، والتي تفي بالمعايير التالية التي لا يوجد دور معروف أو مفترض في مقاومة الأدوية أو تفاعل المضيف ، والعلاقة التركيبية بين المتصورة المنجلية و P. chabaudi و & GT تغطية 75٪ في P. reichenowi تقويم العظام [18] (يستخدم لقياس الاختلاف داخل طفيليات الملاريا البشرية). منذ أن تم إطلاق جينات المرحلة الجنسية من الانتقاء المطهر في الثقافة اللاجنسية (التي عايشتها العديد من العزلات قيد الدراسة) [43] تم أيضًا استبعاد الجينات التي لا يوجد دليل على التعبير اللاجنسي في المسوحات النسخية [44 ، 45]. من أجل عكس أنواع الجينات المتورطة في مقاومة الأدوية ، وكذلك للحصول على مجموعة من مستويات الحفظ عبر هذه المجموعة المرجعية ، تتكون الجينات المرجعية من ATPases (8) ، ناقلات نشطة ثانوي (12) ، إنزيمات حال للجلوك ( 10) والإنزيمات المشاركة في معالجة DNA و RNA (10) (الجدول 1). تم العثور على نموذج جين Plasmodb لـ PfL0590c (PfATPase4) غير متسق مع البيانات المنشورة بناءً على cDNA ، وقد تم استخدام الأخير كتسلسل ترميز [23].

CLUSTALW محاذاة تسلسل البروتين المتعامد من المتصورة المنجلية و P. chabaudi تم إجراؤها باستخدام الإعدادات الافتراضية لـ BioEdit. ثم تم حساب درجات BLOSUM62 (التي تعكس الحفظ) لكل منها المتصورة المنجلية بقايا. المناطق التي لا يمكن المحاذاة بينها المتصورة المنجلية و P. chabaudi تم تعريف أطباء تقويم العظام على أنهم فجوات في محاذاة BLASTP لـ المتصورة المنجلية و P. chabaudi أخصائيو تقويم العظام (مصفوفة BLOSUM62 ، عقوبات الفجوة: الوجود 9 ، الامتداد 2) تم أيضًا إجراء فحص يدوي لمحاذاة البروتين في BioEdit وفي حالات نادرة حيث تم استبعاد المحاذاة القصيرة بواسطة بحث BLASTP. للمخلفات حيث لم يكن هناك محاذاة P. chabaudi بقايا ، تم تطبيق درجة حفظ من -5. مناطق صغيرة نسبيًا مع عدم وجود P. reichenowi تمت إزالة التغطية أيضًا من التحليل لضمان قواسم قابلة للمقارنة للمقارنة بين الأنواع وداخلها.

شرح تعدد الأشكال والاختلافات الثابتة

قمنا بتحليل تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات (SNPs) المشتقة من Plasmodb ، بناءً على التسلسل المتاح لمختلف المتصورة المنجلية سلالات من جميع أنحاء العالم تم إنشاؤها بواسطة معهد برود [46] ، معهد ويلكوم ترست سانجر [18] والمعاهد الوطنية للصحة [47]. الاختلافات الثابتة بين المتصورة المنجلية سلالة 3D7 و P. reichenowi (سلالة أوسكار) تم الحصول عليها أيضًا من Plasmodb [18]. تم تعريف بدائل الأحماض الأمينية الجذرية على أنها بدائل مصفوفة BLOSUM62 & lt 0.

تم وصف التحدي المتمثل في تحديد تغيرات النوكليوتيدات المفردة ضمن تسلسل يخضع لتعدد الأشكال المتكرر لحذف الإدراج والحذف [48]. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أنه على الرغم من أنه تم استبعاد الأشكال المتعددة المعقدة في المنشورات ، فإن قوائم Plasmodb لـ SNPs داخل المتصورة المنجلية والاختلافات الثابتة بين المتصورة المنجلية سلالة 3D7 و P. reichenowi احتوت أحيانًا على طفرات متكررة ضمن التكرارات الترادفية (أكدتها مصفوفة بروتين Pustell ، MacVector) التي كانت بوضوح جزءًا من الأشكال المتعددة المعقدة للاندل وبالتالي ليست SNPs حقيقية. ساهمت هذه المناطق بنسبة 27.5 ٪ من جميع SNPs بين المتصورة المنجلية العزلات و 9.4٪ من الاختلاف بين الأنواع ، وتم استبعادها من تحليلي تعدد الأشكال والتباعد.

حساب المواقف والانتقالات

تم حساب المواقف المترادفة وغير المترادفة لكل منها المتصورة المنجلية أخصائي تقويم العظام باستخدام مصفوفة استبدال قياسية (بافتراض معدلات طفرة متساوية) مع تصحيح جوكس كانتور [49]. تم تحديد فترات الثقة لـ dS بافتراض التوزيع المستمر. تم تحديد فترات الثقة لـ dN / dS باستخدام طريقة دلتا. تم تحديد التحيز الانتقالي من خلال دراسة الفروق الثابتة المترادفة بين المتصورة المنجلية و P. reichenowi أخصائيو تقويم العظام تحدث في الأحماض الأمينية المشفرة بأربعة كودونات. تمشيا مع القياسات السابقة على مقياس الكروموسومات [50] ، شكلت المواقع المترادفة 20.1٪ من جميع المواقع ضمن الجينات المرجعية (انظر الجدول 4) مع 8.9٪ من المواقع عبارة عن مواقع متدهورة بأربعة أضعاف (مواضع النوكليوتيدات تكون فيها جميع الطفرات مترادفة ). بالنسبة للاختلافات المترادفة في المواقع المتدهورة ذات 4 أضعاف ، والتي نفترض أنها محايدة بشكل انتقائي ، شكلت التحولات 41.4٪ من التغييرات والانتقالات 58.6٪ ، بما يتفق مع التحيز الانتقالي المعتدل الذي من شأنه أن ينتج نسب dN / dS منخفضة بشكل خاطئ [51] (منذ انتقالية ترتبط الطفرات بالتنكس في العديد من المواقع المتدهورة 2 أضعاف). أدى أخذ هذا العامل في الاعتبار إلى مراجعة تصاعدية لنسب dN / dS للاختلاف بين 12 و 16 ٪ وفقًا لمستوى الحفظ ، كان التأثير أكبر للتسلسل غير المحاذاة حيث ارتفعت نسبة dN / dS المعدلة إلى 0.64 (الجدول 1) ).

دراسات المحبة للماء والتعقيد

تم قياس درجات المحبة المائية بواسطة مؤشر Kyte-Doolittle (النافذة = 14). تم تحديد المناطق منخفضة التعقيد باستخدام خوارزمية SEG بمعاييرها الافتراضية [52].

مناطق الكروموسومات المقاومة للأدوية

P. chabaudi تم استخدام أخصائيو تقويم العظام مرة أخرى لإنشاء درجة الحفظ. في حالة وجود جين واحد (MAL8P1.111) لم يكن هناك تقويم لطفيلي ملاريا القوارض كما تم الإبلاغ سابقًا [53] ونتيجة لذلك ، P. النشيطة تم استخدام تقويم العظام للمقارنة. لجين Apicoplast واحد rpl4 الجزئي P. chabaudi تسلسل PC103611.00.0 كان متاحًا لتوليد درجة الحفظ عبر الجنس في مواقع الطفرة. بالنسبة لجميع الدراسات في مناطق مقاومة الأدوية ، تم استخدام درجة الحفاظ على الحي (متوسط ​​درجات الحفظ الفردية عبر نافذة منزلقة ومتداخلة من 9 بقايا). هذا يسمح بإمكانية حدوث طفرات مقاومة للأدوية في المخلفات التي خضعت سابقًا لتغيير محافظ داخل منطقة أوسع للحفظ ، وبالتالي تقليل الفقد العشوائي للحساسية. أدى هذا أيضًا إلى تجنب الحاجة إلى خطوة محددة لتحديد المناطق غير المنحازة في المناطق الجينومية. تمت دراسة SNPs غير المترادفة (nSNPs) بين الطفيليات الحساسة والمقاومة في كل موضع ، وتمتد الجين المقاوم للأدوية في كل حالة وتمتد إلى الخارج بشكل متماثل حتى تم توثيق 10 nSNPs خارج الجين المقاوم للأدوية نفسه في مقارنة زوجية واحدة على الأقل . تم تضمين جميع المخلفات المعروفة بأنها جوهرية للأنماط الفردانية المقاومة ، سواء تم إثبات أن كل بقايا فردية تسبب مقاومة للأدوية بشكل مستقل أم لا. تم إجراء اختبار Chi-squared لاختبار ما إذا كان توزيع متغيرات الأحماض الأمينية من حيث مستوى الحفظ هو نفس توزيع التسلسل الكلي ، باستخدام 13 مستوى حفظ (صناديق من 1) ، وبالتالي 12 درجة من الحرية. تم إجراء الاختبار أولاً للجينات والطفرات المقاومة للأدوية ، ثم للجينات الأخرى والطفرات الموجودة فيها.


محطة البروتين المحفوظة

كنت أتساءل ما الذي يعنيه الحفاظ على البروتين / مجال البروتين / محطة البروتين.

يشير المصطلح & # 039 تم حفظه & # 039 بهذا المعنى إلى تسلسل الأحماض الأمينية لبروتين أو مجال بروتين (جزء من بروتين). إذا تم حفظ التسلسل ، فهذا يعني أنه يمكن العثور عليه في العديد من الأنواع ذات الصلة البعيدة. إذا كان البروتين يحتوي على تسلسل أحماض أمينية محفوظ بدرجة عالية عبر نوعين أو أكثر ، فهذا يعني أنه لم يتغير كثيرًا منذ تباعد الأنواع عن بعضها البعض. على سبيل المثال ، لم يتغير البروتين (أو الجين) المحفوظ بدرجة عالية بين البشر والشمبانزي منذ حوالي 5 ملايين سنة (الوقت التقريبي الذي تباعد فيه البشر والشمبانزي عن سلفهم المشترك). يجب أن يكون للبروتين أو الجين ذي التسلسل المحفوظ بشكل كبير وظيفة مهمة جدًا لأنه لا يتحور كثيرًا.


12862_2008_2755_MOESM1_ESM.PDF

ملف إضافي 1: جدول ص- القيم وملفات المحاذاة لـ 37 بروتينًا إضافيًا من البروتينات المضيفة للمجموعة الأولى أو المجموعة الثانية. تشير الأسهم إلى مواقف intron أو intein. تشير النقاط الزرقاء إلى مواضع intein والمجموعة الأولى من النقاط الخضراء ومواضع intron للمجموعة الثانية من النقاط البرتقالية. (ملف PDF 2 ميجا بايت)

قائمة الإنترونات الموجودة في الوحدة الفرعية Cytochrome C أوكسيديز I

الملف الإضافي 2:. تحتوي القائمة على جميع introns من الأنواع التي يكون واحدًا منها على الأقل cox1 كانت إنترونات الجين عبارة عن إصابات بلاست عندما تكون إنترونات من بودوسبورا أنسيرينا (X55026) و خميرة الخميرة (V00694) cox1 تم استخدام الجينات كتسلسل استعلام. (ملف PDF بحجم 103 كيلوبايت)

12862_2008_2755_MOESM3_ESM.DOC

الملف الإضافي 3: أرقام الدخول للتسلسلات المستخدمة في محاذاة البروتين. قوائم بأرقام المدخلات لكل بروتين مستخدم لكل ملف تعريف للحفظ. (DOC 212 كيلوبايت)

12862_2008_2755_MOESM4_ESM.ZIP

الملف الإضافي 4: نصوص Perl المستخدمة لحساب ملفات تعريف الحفظ. تستخدم نصوص Perl لحساب ملفات تعريف الحفظ. (ZIP 3 كيلوبايت)


نتائج

يحتوي الجدول 1 على الأنواع من الإضافة. من المتوقع أن يحتوي الملف 1 على ملف واحد على الأقل على نطاق واسع المروج المحفوظة في plastome. التنبؤات متطابقة لأقاربهم المقربين مع الجين المتعامد المقابل (غير معروض). داخل النباتات المزهرة ، تتشابه تسلسل المحفز ومحاذاة بشكل جيد ، لذلك نوضح النتائج نبات الأرابيدوبسيس thaliana و Spinacia oleracea فقط. يتم وصف التوقعات الإيجابية الخمسة أدناه. تحليلاتنا تشير إلى ذلك على نطاق واسع المحفزات المحفوظة غائبة في أي مكان آخر في البلاستومات العقدية.

الجين psbA(بروتين D1 للمركز النشط لنظام الضوء الثاني) في البلاستومات. تمت دراسة محفزات هذا الجين البلاستيدات الخضراء تجريبياً في الأنواع المختارة ، بما في ذلك أرابيدوبسيسوالخردل والسبانخ [3 ، 12 ، 13] ، والتي تتوافق توقعاتنا معها جيدًا مع التجربة. توقعت الخوارزمية المحفزات المحفوظة المرشحة في بداية هذا الجين في معظم Streptophyta والتعايش الداخلي الأولي والثانوي ، Bigelowiella natans من Chlorarachniophyceae و Cyanophora paradoxa from the Glaucocystophyceae (ref. to Fig. 1, psbA). The gene alignments are given in Fig. 1, per-site nucleotide frequency distributions are given in Fig. 2 (constructed with the Weblogo program [14]). We suggest that this ancient promoter with the consensus TTGACA-15-TGTwATAmT is ancestral for at least all Streptophyta. The linker between the boxes is usually 18 bases long, but is 17 bases in Cycas taitungensis, Adiantum capillus-veneris, Staurastrum punctulatum, Mesostigma viride و B. natans. Many predictions possess the 5'-extension (TG or TGTG) of the "-10" box, which enhances the promoter efficiency. In the gymnosperm C. taitungensis, the predicted "-35" box essentially differs from the alignment consensus and the bacterial-like promoter. ال psbA promoter was not found in the hornworts Anthoceros formosae, although in other bryophytes it is highly conserved. In the early emerging alga Chlorokybus atmophyticus only the "-35" box was identified, while the complete promoter was found in M. viride. Two dodder species (Cuscuta gronovii, C. obtusiflora) with a largely reduced plastome also lack the psbA promoter, which, however is found in their close relatives (C. exaltata, C. reflexa) and most angiosperm plants. The lack of promoters correlates with the reduction of genomes: Cuscuta gronovii و C. obtusiflora do not photosynthesize and lack most of the photosynthetic genes. على الرغم من أن psbA gene retains an open reading frame, it lacks the PEP-promoter and is probably poorly expressed compared to photosynthetic species.

Predicted promoters upstream of genes psbA , psbB , psbE , rbcL , psaA. In the cells of first column only first occurrences of each taxon name are given. In yellow are the promoter boxes and the 5'-extension of the "-10" box. Numbers are the distance to the start codon its location is given in the last column, prepended with "c" for complement sequences. In violet are the experimentally identified transcription initiation sites in نبات الأرابيدوبسيس thaliana و Spinacia oleracea upstream of psbA, psbB, rbcL, psaA.


شاهد الفيديو: أحياء أولى ثانوى: البروتينات Proteins (كانون الثاني 2022).