معلومة

هل الخلايا الساتلة (العضلية) هي نفسها الخلايا الجذعية للعضلات؟


من حيث العضلات: هل المصطلحان "خلية ساتلية" و "خلية جذعية عضلية" قابلان للتبادل؟ أي هل هناك خلايا جذعية عضلية ليست خلايا ساتلية أم العكس؟


بناءً على هذه المراجعة ، يمكن لخلايا الأقمار الصناعية تجديد العضلات المصابة ، ولكن من بين الخلايا الساتلية توجد خلايا جذعية تابعة للحفاظ على تجمع الخلايا الساتلية.


الخلايا الجذعية للعضلات الهيكلية

الخلايا الساتلة هي خلايا جذعية عضلية المنشأ مسؤولة عن نمو وإصلاح وصيانة العضلات الهيكلية بعد الولادة. تركز هذه المراجعة على البيولوجيا الأساسية للخلية الساتلة مع التركيز على دورها في إصلاح العضلات والتوازيات بين تكوين العضل الجنيني وتجديد العضلات. لقد غيرت التطورات الحديثة النظرة طويلة الأمد للخلية الساتلية كخلية جذعية عضلية المنشأ مشتقة مباشرة من الأرومة العضلية للجنين. سيتم إبراز الأساس التجريبي لهذا المنظور المتطور وكذلك العلاقة بين الخلية الساتلية ومجموعات الخلايا الجذعية العضلية الأخرى المكتشفة حديثًا. أخيرًا ، سيتم تناول التطورات والآفاق في العلاجات القائمة على الخلايا لضمور العضلات.


مقدمة

لقد مر الآن أكثر من 45 عامًا منذ أول وصف لخلية القمر الصناعي الكنسي في العضلات الهيكلية البالغة (ماورو ، 1961). تستقر الخلايا الساتلية في مكان يقع تحت الصفيحة القاعدية ولكن خارج الألياف العضلية المرتبطة بها (الشكل 1 أ) (بيشوف ، 1990). يُعتقد منذ فترة طويلة أن الخلايا الساتلية تمثل سلفًا عضليًا ملتزمًا مسؤولاً عن نمو ما بعد الولادة والقدرة على التجدد للعضلات الهيكلية (سيل وآخرون ، 2000). عادة ما تكون الخلايا الساتلية هادئة من الناحية الانقسامية ، يتم تنشيطها استجابة للإجهاد الناجم عن تحمل الوزن أو عن طريق الصدمة ، مثل الإصابة (Charge and Rudnicki ، 2004). تخضع أحفاد الخلايا الساتلية المنشطة ، والتي تسمى الخلايا الأولية العضلية أو الخلايا العضلية الهيكلية ، لجولات متعددة من الانقسام قبل التمايز والانصهار الطرفي لتشكيل ألياف عضلية متعددة النوى.

الحالات المختلفة للخلية العضلية الهيكلية الساتلية. (أ) خلايا ساتلية إيجابية Pax7 (حمراء) على سطح ألياف مفردة معزولة عن العضلة الطويلة الباسطة الأصابع (EDL) لفأر بالغ. النوى ملطخة بـ DAPI (أزرق). (ب) أثناء التطور الجنيني ، تساهم مجموعة Pax7 إيجابية من الأسلاف العضلية في تكوين العضل وتؤدي إلى ظهور الخلايا الساتلية. التجميد من خلال عضلة الماضغة من جنين فأر E14. تتلوث ألياف العضلات المتمايزة بجسم مضاد ضد سلسلة الميوسين الثقيلة (السيتوبلازم ، الأزرق) وجسم مضاد ضد الميوجينين (نوى ، أحمر). تقع الخلايا الإيجابية لـ Pax7 (نوى ، خضراء) بين الألياف المشكلة حديثًا. (ج) التجميد المستعرض لعضلة الظنبوب المزروعة بالفأر ، مما يدل على أن الخلايا الساتلية الإيجابية YFP المزروعة يمكن أن تندمج مع ألياف العضلات المضيفة وتساهم في مكانة الخلايا الجذعية المضيفة. يتم تمييز الخلايا المطعمة بجسم مضاد لـ GFP (أخضر) وجسم مضاد لـ Pax7 (أحمر). يتم تمييز الصفائح القاعدية للألياف العضلية بجسم مضاد لامينين (أبيض) ونواة مع DAPI (أزرق). يُظهر السهم خلية إيجابية Pax7 مطعمة بإيجابية YFP في موضع خلية ساتلية. الصور في A و B مقدمة من Fabien Le Grand صورة في C مقدمة من S. Kuang.

الحالات المختلفة للخلية العضلية الهيكلية الساتلية. (أ) خلايا ساتلية إيجابية Pax7 (حمراء) على سطح ألياف مفردة معزولة عن العضلة الطويلة الباسطة الأصابع (EDL) لفأر بالغ. النوى ملطخة بـ DAPI (أزرق). (ب) أثناء التطور الجنيني ، تساهم مجموعة Pax7 إيجابية من الأسلاف العضلية في تكوين العضل وتؤدي إلى ظهور الخلايا الساتلية. التجميد من خلال عضلة الماضغة من جنين فأر E14. تتلوث ألياف العضلات المتمايزة بجسم مضاد ضد سلسلة الميوسين الثقيلة (السيتوبلازم ، الأزرق) وجسم مضاد ضد الميوجينين (نوى ، أحمر). توجد الخلايا الإيجابية لـ Pax7 (نوى ، خضراء) بين الألياف المشكلة حديثًا. (ج) التجميد المستعرض لعضلة الظنبوب المزروعة بالفأر ، مما يدل على أن الخلايا الساتلية الإيجابية YFP المزروعة يمكن أن تندمج مع ألياف العضلات المضيفة وتساهم في مكانة الخلايا الجذعية المضيفة. يتم تمييز الخلايا المطعمة بجسم مضاد لـ GFP (أخضر) وجسم مضاد لـ Pax7 (أحمر). يتم تمييز الصفائح القاعدية للألياف العضلية بجسم مضاد لامينين (أبيض) ونواة مع DAPI (أزرق). يُظهر السهم خلية إيجابية Pax7 مطعمة بإيجابية YFP في موضع خلية ساتلية. الصور في A و B مقدمة من Fabien Le Grand صورة في C مقدمة من S. Kuang.

خلال العقد الماضي ، قدم العديد من الباحثين أدلة لدعم الفرضية القائلة بوجود مجموعة سكانية فرعية من الخلايا الساتلية التي تمتلك خصائص شبيهة بالخلايا الجذعية (كولينز وآخرون ، 2005). في الواقع ، لقد تم إثبات مؤخرًا أن الخلايا الساتلية تمثل مجموعة غير متجانسة وذات تسلسل هرمي تتكون من عدد صغير من الخلايا الجذعية الساتلية وعدد أكبر من أسلاف المنشأ العضلي الملتزم (Kuang et al. ، 2007). علاوة على ذلك ، تم توضيح فهمنا للخلايا الجذعية العضلية المنشأ غير التقليدية (الخلايا السكانية الجانبية ، والأرومة الوعائية المتوسطة ، والخلايا الجذعية المشتقة من العضلات) من خلال تقدير أنها قد تكون مشتقة من خلية شبيهة بالخلية في الأنسجة العضلية (Peault et al. ، 2007). تمت مناقشة هذه التطورات وغيرها في فهمنا للقمر الصناعي للعضلات الهيكلية وبيولوجيا الخلايا الجذعية في مؤتمر FASEB الأخير ، والذي نراجعه أدناه.


الخلايا الساتلية لعضلات الأطراف: إنشاء الكنسي

تُستخدم العضلات الهيكلية لأطراف القوارض الخلفية بشكل شائع لدراسة الخلايا الساتلية حيث يسهل التعرف على هذه العضلات وتشريحها وجمعها ومعالجتها تجريبيًا. تنشأ العضلات الهيكلية للأطراف والبطن من الأديم المتوسط ​​الجسدي ويشار إليها بالعضلات الهائلة (الشكل & # x200B الشكل 1 1 ). تنشأ من الناحية التنموية من العضل العضلي البطني للأديم المتوسط ​​المجاور للمحور. في الجسم الحي و في المختبر تقدم الدراسات التي تفحص عضلات الأطراف رؤى أساسية حول الآليات والمسارات التنظيمية المرتبطة بتجديد العضلات والهيكل العظمي ونمو العضلات وبيولوجيا الخلايا الساتلية.

مساهمات الأديم المتوسط ​​الجنينية في عضلات الهيكل العظمي للبالغين. (أ) رسم تخطيطي لأصول الأديم المتوسط ​​في جنين فأر بمرحلة جسدية 3 & # x020135. (ب) تنشأ العضلات الهيكلية للجذع والطرف والحجاب واللسان من الأديم المتوسط ​​الجسدي. على النقيض من ذلك ، تنشأ العضلات خارج العين (EOMs) من الأديم المتوسط ​​السابق والأديم المتوسط ​​المحوري للقوس البلعومي الأول ، وهو العضلة الضخمة من الأقواس البلعومية الأولى والثانية من الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور ، والبلعوم من الأقواس البلعومية الثالثة والرابعة من الأديم المتوسط ​​الظليل الظليل. تنشأ عضلات اللسان من كل من الأديم المتوسط ​​الجسدي والقحفي بينما تتطور داخل مكانة اللحمة المتوسطة في الجمجمة ، والتي يتم توفيرها من خلال الأقواس البلعومية الأربعة.

تجديد العضلات هو عملية خلوية قوية ومعقدة تعيد العضلات المصابة إلى حالة تشبه شكليًا ووظيفيًا حالة العضلات غير المصابة (الشكل & # x200B الشكل 2 2 أبماير وبافلات ، 2012). يحدث تجديد العضلات الهيكلية في مرحلتين متميزتين: مرحلة تنكسية ومرحلة تجديد (Rai et al. ، 2014). تشمل الخصائص الرئيسية للمرحلة التنكسية الضرر العضلي الليفي العضلي أو نخر الألياف العضلية ، يليه تدفق الخلايا الالتهابية أحادية النواة وزيادة الخلايا الليفية (ماثيو وآخرون ، 2011 مورفي وآخرون ، 2011 راي وآخرون ، 2014). تبدأ العوامل المنبعثة من الألياف العضلية التالفة استجابة التهابية تجند العدلات والضامة وتنشط الأسلاف الليفية / الشحمية لتسهيل إزالة الحطام الخلوي وتنظيم إصلاح العضلات (McLennan، 1996 Lescaudron et al.، 1999 Joe et al.، 2010 Uezumi et al.، 2010 Pallafacchina et al.، 2013). تظل الصفيحة القاعدية سليمة وتعمل كدعامة للمرحلة التالية ، تجديد العضلات (Schmalbruch ، 1976). يتم إطلاق العديد من الإشارات الجزيئية ، مثل عوامل النمو ، والكيموكينات ، والسيتوكينات ، والتي تنشط الخلايا الساتلية محليًا ونظاميًا خلال أول 24 & # x0201348 ساعة بعد الإصابة (Chang and Rudnicki، 2014 Rodgers et al.، 2014). ثم تتمايز الخلايا العضلية العضلية بشكل نهائي لتصبح خلايا عضلية ما بعد الانقسام الخيطي ، والتي تندمج بعد ذلك مع الخلايا العضلية الأخرى أو الألياف العضلية لتجديد أو إصلاح الألياف العضلية التالفة. وبالتالي ، تتم إضافة نوى عضلية جديدة إلى الألياف العضلية التالفة أو الوليدة (Abmayr and Pavlath ، 2012). تقوم مجموعة فرعية من الخلايا العضلية بإعادة ملء مكان الخلية الساتلية ، وبالتالي الحفاظ على مجموعة الخلايا الساتلية الهادئة وتجديدها لجولات لاحقة من التجديد (كولينز وآخرون ، 2005 شينين وآخرون ، 2006).

هيكل الليف العضلي والتقدم الخلوي لتكوين العضل. الألياف العضلية محاطة بصفيحة قاعدية تقع تحتها خلايا الأقمار الصناعية في موقع قريب من الألياف العضلية. مع الإصابة ، تتكاثر الخلايا الساتلية وتؤدي إلى تكوّن الخلايا العضلية ، والتي تتمايز ، وتهاجر ، وتلتزم ، وتندمج مع بعضها البعض لتشكل عدة أنابيب عضلية داخل سقالة الصفيحة القاعدية. تندمج Myoblasts / myotubes مع جذوع الليف العضلي الباقي والأنابيب العضلية أيضًا تندمج مع بعضها البعض لإصلاح الألياف العضلية المصابة. يمكن التعرف على الألياف العضلية المتجددة من خلال وجود نوى مركزية. يتم توفير المقاطع العرضية للعضلات المصبوغة بالهيموكسيلين والأيوزين من عضلات الفئران المصابة كيميائيًا لكل مرحلة من مراحل تجديد العضلات لتوضيح مورفولوجيا الأنسجة التفاضلية.

كما تمت دراسة دور الخلايا الساتلية في نمو ما بعد الولادة في عضلات الأطراف. في الفئران ، ينتج عن الأسابيع الثلاثة الأولى من نمو حديثي الولادة زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف في كتلة العضلات ، حيث يخضع خلالها عدد الخلايا الساتلية لانخفاض كبير من

30٪ من النوى العضلية لكل ليف عضلي انخفض إلى 5٪ بعد الاندماج مع عضلات حديثي الولادة. تحدث الزيادات الموازية في أعداد النوى العضلية والبروتينات السيتوبلازمية حتى اليوم 21 بعد الولادة (White et al. ، 2010). بعد اليوم 21 بعد الولادة ، تدخل الخلايا الساتلية في حالة خلوية هادئة بموجب تنظيم إشارات الشق (Fukada et al. ، 2011) ، ولكن يستمر حجم الألياف العضلية في الزيادة دون إضافة نوى عضلية جديدة (White et al. ، 2010). أظهرت دراسات استئصال الخلايا الساتلية الحديثة أيضًا أن الإضافة النوى العضلي من الخلايا الساتلية يمكن الاستغناء عنها للنمو الضخامي لعضلات الأطراف عند البالغين (مكارثي وآخرون ، 2011). علاوة على ذلك ، لا يبدو أن الخلايا الساتلية مطلوبة لصيانة معظم عضلات الأطراف البالغة. وجدت دراسة حديثة لاستئصال الخلايا الساتلية أن فقدان & # x0003e90٪ من الخلايا الساتلية للأطراف البالغة فشلت في تغيير حجم العضلات أو نوع الليف العضلي في خمس عضلات أطراف مختلفة مع تقدم العمر (Fry et al. ، 2015). ومع ذلك ، تحدث إضافة النوى العضلية على المستوى القاعدي في عضلات الأطراف غير المصابة بعد الولادة وقد تكون مطلوبة للحفاظ على حجم الباسطة الأصابع الطويلة من الألياف العضلية مع تقدم العمر (Keefe et al. ، 2015). تشير هذه الدراسات معًا إلى أن المرحلة الأولية من نمو العضلات بعد الولادة تحدث مع إضافة نوى عضلية من الخلايا الساتلية ، لكن الحفاظ على حجم عضلات الأطراف البالغة لا يعتمد على الخلايا الساتلة.

كما تم توضيح الجينات التنظيمية المشاركة في بيولوجيا الخلايا الساتلية من دراسات عضلات الأطراف. في العضلات الهيكلية البالغة ، تعبر الخلايا الساتلية الهادئة عن Pax7 ، وهو عامل نسخ يحدد النسب العضلي المنشأ (Seale et al. ، 2000). بمجرد تنشيطها ، تخرج الخلايا الساتلية من الهدوء الخلوي ، وتدخل في دورة الخلية ، وتبدأ في التقدم من خلال النسب العضلي تحت سيطرة العوامل التنظيمية العضلية (MRFs) ، وعوامل النسخ الخاصة بالعضلات لفئة اللولب الحلزوني الأساسي (bHLH) ، بما في ذلك بروتين التمايز العضلي (MyoD) ، والعامل العضلي 5 (Myf5) ، والعامل التنظيمي العضلي 4 (Mrf4) ، والميوجينين (Weintraub et al. ، 1991 Olson and Klein ، 1994 Chang and Rudnicki ، 2014). يتم التعبير عن MyoD و Myf5 خلال مرحلة التكاثر وتنظيم التمايز العضلي (Cooper et al. ، 1999 Valdez et al. ، 2000) ، بينما يتم التعبير عن Mrf4 و myogenin عند التمايز النهائي والخروج من دورة الخلية (Chang and Rudnicki ، 2014) .

تشير الدلائل المتزايدة إلى أن الخلايا الساتلية داخل العضلة غير متجانسة (موتوهاشي وأساكورا ، 2014). تُظهر الخلايا الساتلية التي تحتوي على مستويات عالية من Pax7 معدلات تكاثر أبطأ ، واستقلابًا أقل ، ومقاومة للتمايز ، مما يشير إلى نمط ظاهري أكثر & # x0201cstem & # x0201d مقارنة بالخلايا الساتلية ذات المستويات المنخفضة من Pax7 (Rocheteau et al. ، 2012). اكتشفت مجموعات مختلفة أيضًا مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا الساتلية استنادًا إلى التعبير التفاضلي للبروتينات الأخرى بما في ذلك & # x003b17-Integerin ، & # x003b21-Integerin ، c-met ، CD34 ، مستقبلات الكالسيتونين ، مستقبلات الكيموكين CXC من النوع 4 (CXCR4) ، M-cadherin ، Myf5 ، جزيء التصاق الخلايا العصبية 1 ، syndecans 3 و 4 ، وجزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (Rosen et al. ، 1992 Cornelison and Wold ، 1997 Beauchamp et al. ، 2000 Blanco-Bose et al. ، 2001 Cornelison et al. ، 2001 Tamaki وآخرون ، 2002 Sherwood et al. ، 2004 Fukada et al. ، 2007 Ikemoto et al. ، 2007 Kuang et al. ، 2007 Kafadar et al. ، 2009). بينما لا يزال يتم توضيح الآليات الكامنة وراء عدم تجانس الخلايا الساتلية ، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن بيولوجيا الخلية الساتلية متغيرة أيضًا بطريقة تعتمد على العضلات ، كما هو موضح أدناه.


نتائج

تخضع استنساخ الخلايا الساتلية من كل من العضلات البطيئة والسريعة تلقائيًا لتمايز طرفي عضلي مع توقيت مميز

لتحديد إمكانات التمايز العضلي لكل استنساخ لخلايا عضلية ساتلية مشتقة من عضلة بطيئة وسريعة ، قمنا بعزل الألياف العضلية المفردة من العضلات الباسطة الأصابع الطويلة (العضلات السريعة EDL) والعضلات النعلية (العضلات البطيئة) ، وقمنا بتربيتها في pmGM لمدة تصل إلى 8 أيام . تم تنشيط الخلايا العضلية الساتلية لتتكاثر ، وهاجرت إلى قاع أوعية الاستنبات. نمت الخلايا العضلية المنشأ المشتقة من الخلايا الساتلية بشكل نسلي على طبقة من الكولاجين من النوع الأول المطلي. في غضون 4 أيام من الثقافة ، أظهرت الخلايا العضلية من كل من EDL وعضلات النعل شكلًا مستديرًا ، مما يشير إلى ارتباط ضعيف بالطبقة التحتية (الشكل 1 أ ، ج). تم تعيين هذه الخلايا على أنها "خلايا مستديرة" في الدراسة الحالية. في وقت لاحق ، ظهرت المزيد من الخلايا المسطحة ، المسماة "الخلايا السميكة" ، في المزرعة ، وانخفض عدد الخلايا المستديرة في كل مستعمرة (الشكل 1 ب ، د). تم تمييز الخلايا السميكة بسهولة عن الخلايا الليفية ، والتي بدت أكثر تسطحًا. حدث التمايز العضلي الطرفي في الأنبوب العضلي تلقائيًا بعد ظهور الخلايا السميكة (الشكل 1 ب-د). خضعت الخلايا الساتلية المشتقة من عضلات النعل والعضلات EDL لعمليات الانتشار / التمايز نفسها ، على الرغم من ظهور الخلايا السميكة والأنابيب العضلية في وقت سابق في مزارع الألياف العضلية النعلية مقارنةً بثقافات EDL (الشكل 1C-E). هاجرت الخلايا المستديرة باستمرار ، كما هو مقترح من قبل العديد من أرجل الخيط ، (الشكل 1F) ، وشكلت مستعمرات من النوع "الانفجار" حيث تحافظ الخلايا على مسافة من بعضها البعض (الشكل 1 أ). زاد عدد المستعمرات التي تحتوي على خلايا معبرة عن معقد التوافق النسيجي الكبير مع مرور الوقت في كل من مزارع الألياف العضلية السريعة والبطيئة (الشكل 1E). في اليوم الثامن من الثقافة ، خضعت جميع الحيوانات المستنسخة المشتقة من الخلايا الساتلية لعملية تمايز طرفي عضلي ، بغض النظر عن أصلها. وبالتالي ، فإن جميع الحيوانات المستنسخة المشتقة من الخلايا الساتلية حافظت على إمكانات التمايز العضلي تحت ظروف عزلتنا وثقافتنا.

تظهر مجموعتان فرعيتان متميزتان في النسخ المشتقة من الخلايا الساتلية. (A-D) تم عزل ألياف عضلية مفردة من EDL (A ، B) أو عضلة (C ، D) وتم تربيتها لمدة 4 (A ، C) أو 6 أيام (B ، D). ظهرت مجموعتان فرعيتان متميزتان ، بما في ذلك الخلايا المعينة بخلايا دائرية (رؤوس سهام بيضاء) ذات شكل دائري وخلايا أكثر تسطيحًا مخصصة للخلايا السميكة (رؤوس سهام سوداء) ، ظهرت إما في EDL- أو ثقافة الألياف الوحيدة. تم الحصول على الصور عن طريق الفحص المجهري الطوري. أشرطة النطاق: 50 ميكرومتر. (هـ) القدرة على الخضوع للتمايز العضلي لاستنساخ الخلايا الساتلية المشتقة من EDL (العمود الأبيض) وعضلات النعل (العمود الأسود). تم إصلاح ثقافات الليف العضلي المنفردة في اليوم الرابع أو الثامن ، ثم خضعت للتألق المناعي لـ MHC. تم تحديد التعبير عن MHC في 45-80 مستعمرة. (و) عرض فائق المجهري للخلايا المستديرة. لوحظت الخلايا المستديرة المشتقة من عضلة الساق تحت المجهر الإلكتروني الماسح. يشير السهم إلى فيلوبوديوم. شريط النطاق: 10 ميكرومتر.

تظهر مجموعتان فرعيتان متميزتان في النسخ المشتقة من الخلايا الساتلية. (A-D) تم عزل ألياف عضلية مفردة من EDL (A ، B) أو عضلة (C ، D) وتم تربيتها لمدة 4 (A ، C) أو 6 أيام (B ، D). ظهرت مجموعتان فرعيتان متميزتان ، بما في ذلك الخلايا المعينة بخلايا دائرية (رؤوس سهام بيضاء) ذات شكل دائري وخلايا أكثر تسطيحًا مخصصة للخلايا السميكة (رؤوس سهام سوداء) ، ظهرت إما في EDL- أو ثقافة الألياف الوحيدة. تم الحصول على الصور عن طريق الفحص المجهري الطوري. أشرطة النطاق: 50 ميكرومتر. (هـ) القدرة على الخضوع للتمايز العضلي لاستنساخ الخلايا الساتلية المشتقة من EDL (العمود الأبيض) وعضلات النعل (العمود الأسود). تم إصلاح ثقافات الليف العضلي المنفردة في اليوم الرابع أو الثامن ، ثم خضعت للتألق المناعي لـ MHC. تم تحديد التعبير عن MHC في 45-80 مستعمرة. (و) عرض فائق المجهري للخلايا المستديرة. لوحظت الخلايا المستديرة المشتقة من عضلة الساق تحت المجهر الإلكتروني الماسح. يشير السهم إلى فيلوبوديوم. شريط النطاق: 10 ميكرومتر.

يحدث تحويل الخلايا المستديرة إلى خلايا سميكة قبل التمايز الطرفي العضلي المنشأ

تشير ملاحظة أن عدد الخلايا السميكة زاد بسرعة في المستعمرات في وقت واحد مع انخفاض سريع في عدد الخلايا المستديرة (الشكل 1 أ ، ب) تشير إلى تحويل الخلايا المستديرة إلى خلايا سميكة. للكشف عن تسلسل الأحداث التي تحدث أثناء التمايز الطرفي العضلي في ثقافة الألياف المفردة ، تم فحص سلوك الخلايا المستديرة المشتقة من عضلة الساق بواسطة الفحص المجهري على النقيض من الطور. يُظهر الشكل 2 الصور التي تم التقاطها بين 1 و 108 دقيقة من أفلام الفاصل الزمني في اليوم السابع من الثقافة. هاجرت الخلية المستديرة (رأس السهم) بشكل مستمر أثناء الثقافة (الشكل 2A-C). عندما اتصلت خلية مستديرة بخلية أخرى ، تم تسطيح مورفولوجيتها المستديرة (الشكل 2D-I) وهكذا ، أصبحت النواة مرئية تحت مجهر تباين الطور (الشكل 2H-J). بعد ذلك ، اندمجت الخلية السميكة المشكلة حديثًا مع خلية سميكة أخرى وتم تفاضلها في أنبوب عضلي (الشكل 2 ك ، ل). بالإضافة إلى ذلك ، تم إحداث تعبير عن الميوجينين (Wright et al. ، 1989) ، وهو علامة مبكرة لتكوين العضل ، في جزء صغير من الخلايا السميكة ولكن في أي من الخلايا المستديرة (الشكل 3 أ-د) في المستعمرات التي تحتوي على أنابيب عضلية. تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا المستديرة يتم تحويلها إلى خلايا سميكة بدون انقسام للخلايا ، وأن الخلايا السميكة ، وليس الخلايا المستديرة ، تخضع لتمايز طرفي عضلي المنشأ.

يتم تحويل الخلايا المستديرة إلى خلايا سميكة قبل التمايز الطرفي العضلي. تمت ملاحظة تسلسل الأحداث التي تحدث أثناء التمايز الطرفي العضلي بين أحفاد الخلايا الساتلية عن طريق الفحص المجهري على النقيض من الطور والفاصل الزمني. (A-L) تم التقاط الصور في النقاط الزمنية المحددة. تشير رؤوس الأسهم إلى الموضع بالقرب من نواة الخلية نفسها في A إلى L. شريط المقياس: 10 ميكرومتر.

يتم تحويل الخلايا المستديرة إلى خلايا سميكة قبل التمايز الطرفي العضلي. تمت ملاحظة تسلسل الأحداث التي تحدث أثناء التمايز الطرفي العضلي بين أحفاد الخلايا الساتلية عن طريق الفحص المجهري على النقيض من الطور. (A-L) تم التقاط الصور في النقاط الزمنية المحددة. تشير رؤوس الأسهم إلى الموضع بالقرب من نواة الخلية نفسها في A إلى L. شريط المقياس: 10 ميكرومتر.

تعبر الخلايا السميكة ، ولكن ليست الخلايا المستديرة ، عن الميوجينين. تمت زراعة الألياف العضلية التي تم الحصول عليها من عضلة الساق في pmGM لمدة 7 أيام. بعد ذلك ، تعرضت المستعمرات المشتقة من الخلايا الساتلية للتلوين المناعي بالأجسام المضادة المضادة للميوجينين. (أ ، ب) عبر جزء من الخلايا السميكة (رؤوس الأسهم) حول أنبوب عضلي (علامة النجمة) عن ميوجينين (أخضر في ب). شريط النطاق: 50 ميكرومتر. (C ، D) إحدى الخلايا السميكة (رأس السهم) ، ولكن أيا من الخلايا المستديرة (داخل المربع) ، عبرت عن myogenin (D). شريط النطاق: 20 ميكرومتر. تم تصور النوى باستخدام DAPI (الأزرق في B و D). (أ ، ج) صور مجهرية تباين الطور لنفس الحقول مثل تلك الموضحة في B و D.

تعبر الخلايا السميكة ، ولكن ليست الخلايا المستديرة ، عن الميوجينين. تمت زراعة الألياف العضلية التي تم الحصول عليها من عضلة الساق في pmGM لمدة 7 أيام. بعد ذلك ، تعرضت المستعمرات المشتقة من الخلايا الساتلية للتلوين المناعي بالأجسام المضادة المضادة للميوجينين. (أ ، ب) عبر جزء من الخلايا السميكة (رؤوس الأسهم) حول أنبوب عضلي (علامة النجمة) عن ميوجينين (أخضر في ب). شريط النطاق: 50 ميكرومتر. (ج ، د) إحدى الخلايا السميكة (رأس السهم) ، ولكن أيا من الخلايا المستديرة (داخل المربع) ، عبرت عن ميوجينين (د). شريط النطاق: 20 ميكرومتر. تم تصور النوى باستخدام DAPI (الأزرق في B و D). (أ ، ج) صور مجهرية تباين الطور لنفس الحقول مثل تلك الموضحة في B و D.

تحتفظ استنساخ الخلايا الساتلية من العضلات البطيئة والسريعة بالقدرة على الاستجابة لـ BMP2

لتحديد ما إذا كان كل استنساخ مشتق من الخلايا الساتلية العضلية يحتفظ بالقدرة على الخضوع للتمايز العظمي أم لا ، قمنا بتعريض ثقافة الألياف المفردة لـ BMP2 لمدة يومين إما خلال فترة مبكرة (أيام 2-4) أو متأخرة (أيام 7-9) فترة في المختبر. كان ALP ، وهو علامة مبكرة للتمايز العظمي ، قابلاً للاكتشاف في 3.6٪ فقط من المستعمرات المشتقة من EDL والتي تعرضت لـ BMP2 في الأيام 2-4 (الشكل 4 أ ، ج). على النقيض من ذلك ، حدث تعبير ALP في 86.4٪ من المستعمرات المشتقة من EDL والتي تعرضت لـ BMP2 في الأيام 7-9 (الشكل 4 ب ، ج). أدى BMP2 إلى تثبيط التمايز الطرفي العضلي بشكل ملحوظ ولكنه لم يؤثر على تحويل الخلايا المستديرة إلى خلايا سميكة.

تستجيب مجموعة سكانية فرعية مميزة لـ BMP2 وتخضع للتمايز العظمي. (أ ، ب) تم تعريض المستعمرات المشتقة من الخلايا الساتلية التي تم الحصول عليها في مزرعة ألياف EDL لـ BMP2 في الأيام 2-4 (A) أو الأيام 7-9 (B). ثم تعرضوا للتلطيخ بسبب ALP. شريط النطاق: 20 ميكرومتر. (C ، D) تحليل القدرة على الاستجابة لـ BMP2 بواسطة أحفاد الخلايا الساتلية المشتقة من مزارع الألياف EDL- (C) أو الوحيد- (D). تم تعريض المستعمرات المشتقة من الخلايا الساتلية لـ BMP2 في الأيام 2-4 (BMP d2-4) أو الأيام 7-9 (BMP d7-9) ، أو تمت تربيتها لنفس الفترات في غياب BMP2. يشير اللون الأزرق الفاتح إلى المستعمرات التي لا تحتوي على خلايا سميكة ولا خلايا إيجابية ALP (ALP– Thick-). يشير اللون الأصفر إلى المستعمرات التي تحتوي على خلايا سميكة ولكن لا توجد خلايا إيجابية ALP (ALP- خلية سميكة +). يشير اللون الأحمر الداكن إلى المستعمرات التي تحتوي على خلايا إيجابية ALP ولكن لا تحتوي على خلايا سميكة (ALP + خلية سميكة). يشير اللون الأزرق الداكن إلى المستعمرات التي تحتوي على خلايا إيجابية ALP وخلايا سميكة (ALP + خلية سميكة +). كان عدد المستعمرات التي تم فحصها 52-109 في مزارع شاهدة دون التعرض لـ BMP2 و107-199 في الثقافات المعرضة لـ BMP2.

تستجيب مجموعة سكانية فرعية مميزة لـ BMP2 وتخضع للتمايز العظمي. (أ ، ب) تم تعريض المستعمرات المشتقة من الخلايا الساتلية التي تم الحصول عليها في مزرعة ألياف EDL لـ BMP2 في الأيام 2-4 (A) أو الأيام 7-9 (B). ثم تعرضوا للتلطيخ بسبب ALP. شريط النطاق: 20 ميكرومتر. (C ، D) تحليل القدرة على الاستجابة لـ BMP2 بواسطة أحفاد الخلايا الساتلية المشتقة من مزارع الألياف EDL- (C) أو النعلية- (D). تم تعريض المستعمرات المشتقة من الخلايا الساتلية لـ BMP2 في الأيام 2-4 (BMP d2-4) أو الأيام 7-9 (BMP d7-9) ، أو تمت تربيتها لنفس الفترات في غياب BMP2. يشير اللون الأزرق الفاتح إلى المستعمرات التي لا تحتوي على خلايا سميكة ولا خلايا إيجابية ALP (ALP– Thick-). يشير اللون الأصفر إلى المستعمرات التي تحتوي على خلايا سميكة ولكن لا توجد خلايا إيجابية ALP (ALP- خلية سميكة +). يشير اللون الأحمر الداكن إلى المستعمرات التي تحتوي على خلايا إيجابية ALP ولكن لا تحتوي على خلايا سميكة (ALP + خلية سميكة). يشير اللون الأزرق الداكن إلى المستعمرات التي تحتوي على خلايا إيجابية ALP وخلايا سميكة (ALP + خلية سميكة +). كان عدد المستعمرات التي تم فحصها 52-109 في مزارع شاهدة دون التعرض لـ BMP2 و107-199 في الثقافات المعرضة لـ BMP2.

تطورت قدرة الحيوانات المستنسخة المشتقة من وحيد القرن على الاستجابة لـ BMP2 بشكل مشابه ، على الرغم من أن حدوث مستعمرات إيجابية ALP في ثقافة ألياف النعل كان أقل من تلك الموجودة في ثقافة ألياف EDL بعد التعرض BMP2 في 7-9 أيام في المختبر (الشكل 4 د) ). بالنظر إلى أن قدرة الخلايا العضلية المنشأ على الاستجابة لـ BMP2 تُفقد عندما تخضع لتمايز طرفي عضلي المنشأ (Wada et al. ، 2002) ، فقد يكون معدل حدوث التمايز العظمي المنخفض نسبيًا (62.3٪ مقابل 86.4٪ من المستعمرات) في ثقافة الألياف العضلية الوحيدة. بسبب التطور السريع لتكوين العضل (الشكل 1E). في الواقع ، أدى التعرض المستمر لـ BMP2 من اليوم 0 إلى اليوم 9 في المختبر إلى منع التمايز العضلي وزيادة حدوث التمايز العظمي للمستعمرات المشتقة من النوى حتى 86.2٪ من 87 مستعمرة مستقلة.

أشار التحليل الكيميائي النسيجي إلى أن تعبير ALP تم تحريضه حصريًا في الخلايا السميكة ولكن ليس في الخلايا المستديرة (الشكل 4 أ ، ب). يوازي التغيير الزمني لاستجابة BMP2 لأحفاد الخلايا الساتلية في ثقافة الليف العضلي المسار الزمني للخلية المستديرة لتحويل الخلية السميكة (الشكل 4C ، D). حدث التحويل في وقت سابق في ثقافة الألياف المفردة للعضلة النعلية (الشكل 1 ب). في الواقع ، حتى عند التعرض لـ BMP2 في الأيام 2-4 ، تم إحداث ALP في مستعمرات نعلية معينة تحتوي على خلايا سميكة (13.3٪ شكل 4 د).

تشير النتائج الحالية إلى أن الخلايا المستديرة تمثل خلايا ساتلية نشطة ، في حين أن الخلايا السميكة تمثل خلايا سلفية متعددة القدرات (بانيات متعددة) (Wada et al. ، 2002). مجتمعة ، تشير النتائج إلى أن الخلايا المستديرة يتم تحويلها إلى خلايا سميكة قبل التمايز الطرفي العضلي المنشأ والعظمي.

يقوم FGF الأساسي و LIF بقمع تآزري كلاً من الخلية المستديرة إلى تحويل الخلايا السميكة والتمايز الطرفي العضلي المنشأ

تدعم الاختلافات في الاستجابة لإشارات التمايز بين الخلايا المستديرة والخلايا السميكة فكرة أن كفاءة مساهماتها في تجديد العضلات في الجسم الحي عند الزرع تختلف في نوعي الخلايا المتحدرة من الخلايا الساتلية. ومع ذلك ، لم نتمكن من الحصول على عدد كافٍ من الخلايا المستديرة لاختبار ذلك لأن الخلايا المستديرة يتم تحويلها تلقائيًا إلى خلايا سميكة أثناء الزراعة. لتحقيق التوسع النسيلي المستمر للخلايا المستديرة دون التحويل إلى خلايا سميكة ، قمنا بتربية ألياف عضلية معزولة من عضلات عضلات فئران بالغة في pmGM مكملة بعوامل نمو مختلفة. مثبط FGF الأساسي (bFGF) أو LIF بشكل ملحوظ التعبير عن MHC (الشكل 5A-C). عند الجمع بين bFGF و LIF تآزرًا يمنع التمايز العضلي (الشكل 5 د ، هـ). بالإضافة إلى ذلك ، عزز bFGF ، ولكن ليس LIF ، بشكل ملحوظ تكاثر الخلايا المستديرة (الشكل 5E).

يقوم FGF الأساسي و LIF بقمع بشكل تآزري التعبير عن معقد التوافق النسيجي الكبير. (A-D) تمت زراعة الألياف العضلية المنفردة المعزولة من عضلة المعدة في pmGM (A) ، أو في pmGM المكملة بـ bFGF وحده (B) ، LIF وحده (C) ، أو bFGF plus LIF (D) ، لمدة 6 أيام. ثم تعرضت الخلايا للتأثير المناعي لـ MHC (أحمر). تم تصور النوى بواسطة DAPI. أشرطة النطاق: 100 ميكرومتر. (هـ) التحليل الكمي لتثبيط تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير بواسطة عوامل النمو. تم حساب النسب المئوية للنواة في الخلايا التي تعبر عن معقد التوافق النسيجي الكبير إلى إجمالي النوى (القضبان) وإجمالي عدد النوى في كل حقل (0.55 مم 2) (الدوائر المفتوحة) في أربع عينات مستقلة. يتم عرض المتوسطات والأخطاء القياسية.

يقوم FGF الأساسي و LIF بقمع بشكل تآزري التعبير عن معقد التوافق النسيجي الكبير. (A-D) تمت زراعة الألياف العضلية المنفردة المعزولة من عضلة المعدة في pmGM (A) ، أو في pmGM المكملة بـ bFGF وحده (B) ، LIF وحده (C) ، أو bFGF plus LIF (D) ، لمدة 6 أيام. ثم تعرضت الخلايا للتأثير المناعي لـ MHC (أحمر). تم تصور النوى بواسطة DAPI. أشرطة النطاق: 100 ميكرومتر. (هـ) التحليل الكمي لتثبيط تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير بواسطة عوامل النمو. تم حساب النسب المئوية للنواة في الخلايا التي تعبر عن معقد التوافق النسيجي الكبير إلى إجمالي النوى (القضبان) وإجمالي عدد النوى في كل حقل (0.55 مم 2) (الدوائر المفتوحة) في أربع عينات مستقلة. يتم عرض المتوسطات والأخطاء القياسية.

في حالة عدم وجود bFGF و LIF إضافيين ، تم تحويل الخلايا المستديرة تلقائيًا إلى خلايا سميكة ثم تمايزت إلى أنابيب عضلية ، مما أدى إلى مستعمرات صغيرة (الشكل 6 ب ، ج). على النقيض من ذلك ، استمرت الخلايا المستديرة في التكاثر لمدة 7 أيام على الأقل دون التحول إلى خلايا سميكة في وسط يحتوي على كل من bFGF و LIF (الشكل 6 أ ، ب يقارن حجم المستعمرة في أ مع ذلك في ب بنفس التكبير). أدى تثبيط الخلية المستديرة إلى تحويل الخلايا السميكة عن طريق الجمع بين bFGF و LIF إلى نمو مكثف للخلايا المستديرة. لقد حصلنا بشكل روتيني على ما لا يقل عن 10000 خلية دائرية مطهرة عندما تمت زراعة 120-160 من الألياف العضلية من زوج من عضلات الساق في ظل هذه الظروف. ومع ذلك ، لا يمكن لظروف الثقافة الحالية أن تمنع التحول خلال فترة الثقافة الطويلة.

يعزز FGF الأساسي و LIF بشكل تآزر النمو النسيلي للخلايا المستديرة. تم استزراع استنساخ الخلايا العضلية المنشأ المستمدة من الخلايا الساتلية في عضلة المعدة في pmGM وحدها (B ، C) ، أو في pmGM المكملة بـ bFGF plus LIF (A ، D) ، لمدة 7 أيام. تم الحصول على الصور عن طريق الفحص المجهري الطوري. أشرطة المقياس: 1 مم في A ، B ، 100 ميكرومتر في C ، D.

يعزز FGF الأساسي و LIF بشكل تآزر النمو النسيلي للخلايا المستديرة. تم استزراع استنساخ الخلايا العضلية المنشأ المستمدة من الخلايا الساتلية في عضلة المعدة في pmGM وحدها (B ، C) ، أو في pmGM المكملة بـ bFGF plus LIF (A ، D) ، لمدة 7 أيام. تم الحصول على الصور عن طريق الفحص المجهري الطوري. أشرطة المقياس: 1 مم في A ، B ، 100 ميكرومتر في C ، D.

تساهم الخلايا المستديرة في إعادة بناء الألياف العضلية بشكل أكثر كفاءة من الخلايا السميكة

بعد تطوير نظام الاستزراع الذي يتيح التوسع النسيلي للخلايا المستديرة ، قمنا بنقل الخلايا المستديرة لتجديد عضلات الساق لتحديد مساهمتها المحتملة في إعادة بناء العضلات في الجسم الحي. لقد حصلنا بشكل روتيني على 10000 خلية مستديرة في مزرعة ليف عضلي مستمدة من زوج من عضلات بطنية الفأر ، والتي تجنبت الضرر الفسيولوجي عن طريق تقليل الوقت الذي يقضيه في تحضير الخلية. تم حقن خمسة آلاف خلية مستديرة تم الحصول عليها من ثقافة أحادية الألياف من الفئران المعدلة وراثيا GFP في عضلات المعدة في الفئران C57Bl / 6 التي تلقت حقنة عضلية من CTX في اليوم السابق للزرع. شكلت كل من الخلايا المستديرة والخلايا السميكة عددًا قليلاً من الألياف العضلية الإيجابية لـ GFP في 14 يومًا بعد الزرع للعضلات المضيفة (الجدول 1). بعد 28 يومًا ، تم العثور على المزيد من الألياف العضلية الإيجابية لـ GFP في التجميد لعضلات المضيف المحقونة بـ 5000 خلية مستديرة (الشكل 7 أ ، الجدول 1). النوى الموجودة محيطيًا في العديد من الألياف العضلية الإيجابية لـ GFP تشير إلى الانتهاء من إعادة بناء ليف عضلي (الشكل 7 ب). على النقيض من ذلك ، تم العثور على عدد قليل جدًا من الألياف العضلية إيجابية GFP ، إن وجدت ، في 28 يومًا بعد الزرع في عضلات المضيف المحقونة بـ 5000 خلية سميكة (الشكل 7C). ومع ذلك ، عندما تم نقل 1000000 خلية سميكة ، كانت قادرة على المساهمة بشكل كبير في تكوين الليف العضلي (الشكل 7 د ، الجدول 1). لذلك ، لا تزال الخلايا السميكة تحتفظ بالقدرة على إعادة تكوين الألياف العضلية في الجسم الحي ، على الرغم من أن كفاءتها في تكوين الألياف العضلية أقل نسبيًا من الخلايا المستديرة (حوالي 2-5 ٪). لا يمكننا استبعاد احتمال أن تحتوي مزرعة الخلايا السميكة على عدد صغير من الخلايا أو الخلايا المستديرة المشابهة للخلايا المستديرة. However, round cells will be easily lost from the thick cell culture through successive passages because these cells divide slowly.

In vivo myofiber formation by myogenic cells at different stages of maturation/differentiation

. . . Number of GFP(+) fibers . Required cell number .
Cell type . Number of transplanted cells . Days after transplantation . Gastrocnemius . GFP(+) fiber .
Round cell 5000 14 4.8±7.5 * (5) † , ‡ 1041 §
5000 28 15±5 (4) 333
Thick cell 5000 14 2.7±4.3(6) ‡ 1851
5000 28 0.3±0.5 (6) 16667
10 6 28 138±46 (4) 7246
. . . Number of GFP(+) fibers . Required cell number .
Cell type . Number of transplanted cells . Days after transplantation . Gastrocnemius . GFP(+) fiber .
Round cell 5000 14 4.8±7.5 * (5) † , ‡ 1041 §
5000 28 15±5 (4) 333
Thick cell 5000 14 2.7±4.3(6) ‡ 1851
5000 28 0.3±0.5 (6) 16667
10 6 28 138±46 (4) 7246

Average and standard deviation

Number of samples examined

Expression level of GFP in GFP-positive myofibers after 14 days was relatively low compared with that apparent in GFP-positive myofibers after 28 days

Estimated values based on [number of transplanted cells]/[number of GFP-positive fibers]

Round cells enhance muscle regeneration more efficiently than thick cells. Five thousand round cells (A,B) or thick cells (C), or 1,000,000 thick cells(D) derived from gastrocnemius muscles of GFP-transgenic mice were transplanted into gastrocnemius muscles of congenic C57Bl/6 mice pre-treated with CTX. The muscles were removed and cryosectioned 28 days after transplantation. Images in A-D were obtained by epifluorescence microscopy with a GFP filter. Scale bars: 100 μm in A,C,D 50 μm in B.

Round cells enhance muscle regeneration more efficiently than thick cells. Five thousand round cells (A,B) or thick cells (C), or 1,000,000 thick cells(D) derived from gastrocnemius muscles of GFP-transgenic mice were transplanted into gastrocnemius muscles of congenic C57Bl/6 mice pre-treated with CTX. The muscles were removed and cryosectioned 28 days after transplantation. Images in A-D were obtained by epifluorescence microscopy with a GFP filter. Scale bars: 100 μm in A,C,D 50 μm in B.

To compare the ability of quiescent satellite cells to form new myofibers with that of their cultured descendant cells, we transplanted ten or thirty single myofibers isolated from gastrocnemius muscles of GFP-transgenic mice into host gastrocnemius muscles that were pre-treated with CTX. The fact that GFP-positive myofibers were not observed 24 hours after transplantation implies that the transplanted single myofibers were physically damaged during the process of transplantation. Transplanted quiescent satellite cells located on single myofibers formed GFP-positive myofibers within two weeks: the average number of GFP-positive myofibers from three independent experiments was 0.52±0.16/transplanted myofiber. Single myofibers of mouse gastrocnemius muscle were associated with 3.3±1.3 satellite cells (T.M. and N.H., unpublished). Thus, only seven quiescent satellite cells are sufficient for the formation of a single new myofiber by intramuscular transplantation. These results suggest that quiescent satellite cells have an extremely high ability to reconstitute myofibers in vivo. The efficiency of muscle regeneration by cells belonging to the satellite cell lineage might be altered as a result of isolation and/or tissue culture(Smythe et al., 2001).

Round cells have the ability to restore dystrophin in myofibers of mdx mice

To determine whether round cells have the capacity to restore dystrophin in the muscle of mdx nude mice, which lack functional dystrophin due to a genetic mutation (Sicinski et al.,1989), 5000 round cells derived from GFP-transgenic mice were injected into gastrocnemius muscles of mdx nude mice that had received an intramuscular injection of CTX on the day before transplantation. We did not find any revertant fibers in the gastrocnemius muscles in this series of experiments (Fig. 8A). After 28 days, GFP-positive myofibers (approximately 10-30/gastrocnemius muscle) were identified in cryosections of host muscles(Fig. 8B). Immunofluorescence analysis shows that dystrophin was restored in approximately 10% of GFP-positive myofibers (Fig. 8C). Thus, round cells representing immediate descendants of quiescent satellite cells have the capacity to restore dystrophin in the muscle of mdx nude mice.

Round cells retain the capacity to restore dystrophin in myofibers of mdx nude mice. Five thousand round cells derived from GFP-transgenic mice were transplanted into gastrocnemius muscles of mdx nude mice pre-treated with CTX. The muscles were removed 28 days after transplantation and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to GFP (B) and dystrophin (C). Immunofluorescence analysis with antibodies to dystrophin revealed the absence of revertant myofibers in muscles that were treated with CTX alone (A). Scale bars: 20 μm.

Round cells retain the capacity to restore dystrophin in myofibers of mdx nude mice. Five thousand round cells derived from GFP-transgenic mice were transplanted into gastrocnemius muscles of mdx nude mice pre-treated with CTX. The muscles were removed 28 days after transplantation and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to GFP (B) and dystrophin (C). Immunofluorescence analysis with antibodies to dystrophin revealed the absence of revertant myofibers in muscles that were treated with CTX alone (A). Scale bars: 20 μm.

Round cells retain stem cell-like properties and express Pax7 at high levels

The high ability of round cells to form new myofibers after transplantation suggests that these cells correspond to a stem-like subpopulation in myoblast culture (Beauchamp et al.,1999). Time-lapse recording revealed that round cells grew more slowly than thick cells (Fig. 9A). The maximum growth rate of round cells, which is estimated from the slope of their growth curve, was significantly lower than that of thick cells (9.3±0.7 versus 16.7±1.5 cells/hour). A serial recording also showed a single round cell generating two round-shaped daughter cells that migrated away soon after cell division(Fig. 9B). These results indicate that round cells retain stem cell-like characteristics: slow division, self-renewal for new stem-like cells, and generation of a progeny committed to terminal differentiation.

Round cells divide slowly and generate new round cells. (A) The behavior of round cells on day 6, 7 or 8 of myofiber cultures (black symbols), and thick cells at early passages (white symbols), was recorded by time-lapse microscopy. Cell numbers in the same fields were counted every 6 hours. Three independent cultures of round cells or thick cells were analyzed. (B) A round cell on day 6 of the fiber culture (arrowhead) generated two daughter cells(asterisks) displaying a rounded shape. The images were taken at the indicated time points. Scale bar: 10 μm.

Round cells divide slowly and generate new round cells. (A) The behavior of round cells on day 6, 7 or 8 of myofiber cultures (black symbols), and thick cells at early passages (white symbols), was recorded by time-lapse microscopy. Cell numbers in the same fields were counted every 6 hours. Three independent cultures of round cells or thick cells were analyzed. (B) A round cell on day 6 of the fiber culture (arrowhead) generated two daughter cells(asterisks) displaying a rounded shape. The images were taken at the indicated time points. Scale bar: 10 μm.

To clarify the nature and diversity of round and thick cells, the expression of satellite cell lineage markers and stem cell markers were determined by immunofluorescence analysis. Both round cells and thick cells expressed MyoD, M-cadherin, desmin and nestin, but neither Sca1 nor CD34 (data not shown). Furthermore, all round cells expressed Pax7, an essential transcription factor for satellite cell specification(Seale et al., 2000), at high levels (Fig. 10A,B). Undifferentiated thick cells also expressed Pax7, but at a lower level than that apparent in round cells (Fig. 10C,D), whereas differentiating thick cells expressed myogenin,but not Pax7 (Fig. 10E,F). The high level of Pax7 expression in round cells suggests that Pax7 is a possible molecular marker for identification of stem-like cells in myoblast culture.

Round cells express Pax7 at high levels. Myofibers from EDL muscle were cultured in pmGM for 6 days. (A,B) Round cells expressed Pax7 at high levels.(C,D) Undifferentiated thick cells expressed Pax7 at a reduced level. (E,F)Differentiating thick cells (asterisks) expressed myogenin (green in F) but not Pax7 (red in F). A round cell (arrow) expressed Pax7 but not myogenin.(A,C,E) Phase contrast microscopy images of the same fields as those shown in B, D and F. Scale bars: 20 μm.

Round cells express Pax7 at high levels. Myofibers from EDL muscle were cultured in pmGM for 6 days. (A,B) Round cells expressed Pax7 at high levels.(C,D) Undifferentiated thick cells expressed Pax7 at a reduced level. (E,F)Differentiating thick cells (asterisks) expressed myogenin (green in F) but not Pax7 (red in F). A round cell (arrow) expressed Pax7 but not myogenin.(A,C,E) Phase contrast microscopy images of the same fields as those shown in B, D and F. Scale bars: 20 μm.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


Correcting DNA at the source

The strategy pursued by the Wagers Lab aims to fully correct the genetic template for dystrophin at its source, in the DNA of stem cells (satellite cells) that create and regenerate muscle cells. Combining cutting-edge CRISPR/Cas9 genome editing technologies with a deep knowledge of stem cell science and regenerative biology, this approach if successful might offer a permanent restoration of muscular function.

“In skeletal muscle, muscle fibers are terminally post-mitotic, meaning they cannot divide and they cannot reproduce themselves,” Wagers explains. “If you lose muscle fibers, the only way to produce new muscle is from stem cells, specifically the satellite cells. The satellite cells are self-renewing, self-repairing, and ready to spring into action to create new muscle fibers. So we expect that a satellite cell with the corrected DMD gene would quite quickly and continuously propagate the edited gene throughout the muscle tissue.”

At present, research conducted in mice has shown promising results. In 2019, the Wagers Lab published the results of editing stem cells في الجسم الحي, demonstrating that stem cell genes can be edited in living systems, not only in a dish. In that work, Wagers and her team delivered genome editing molecules to the cells using adeno-associated viruses (AAVs). Her lab has also successfully used gene editing in heart, muscle, and satellite cells to partially restore the function of the DMD gene that encodes dystrophin, by chopping out faulty sequences of code that are disrupting the proper reading frame.


مقدمة

Representing 30–40% of our body mass, skeletal muscle is a highly organized tissue made up of a large number of syncytial cells, known as myofibers, which are formed by the fusion of myogenic progenitor cells. Despite the post-mitotic nature of its myofibers, skeletal muscle has a robust regenerative capacity in response to injury. This relies on resident muscle stem cells (MuSCs), also called “satellite cells” because of their unique anatomical position at the periphery of the myofibers. MuSCs typically exist in a quiescent state but may enter the cell cycle following injury in order to regenerate the skeletal muscle tissue and replenish the stem cell pool for future needs. Several transcription factors have been identified as markers and key regulators of the quiescent state as well as of activation and progression to the myogenic lineage. Among them, the paired homeobox factors PAX3 and PAX7 as well as the so-called Myogenic Regulatory Factors – MRFs (MYF5, MYOD, MYOGENIN, MRF4) stand out for their unique and important roles in muscle formation, specification, homeostasis, and repair (for more details the reader may refer to ref. 1,2 ). PAX7 is commonly used as a marker of MuSCs, and a subset of them co-expresses PAX3 in adult muscle 3,4 . The MRFs regulate the progression of MuSCs towards myogenic determination, differentiation, and fusion to form multinucleated myofibers 2 .

The renewal of the MuSC cellular compartment requires a tightly regulated balance between quiescence and activation that is associated with many transcriptional changes in MuSCs. Activation is accompanied by metabolic reprogramming, reinforcing the evidence of a strict interplay between MuSC function and metabolic status. Moreover, recent studies show that MuSCs are a heterogeneous stem cell population, with different abilities to support tissue regeneration. The dynamic changes in MuSC behavior are regulated by the microenvironment and by distinct tissue resident cells of the niche that provide molecular cues to regulate MuSC fate. Here, we review novel findings that have challenged our knowledge of MuSC biology, discussing the molecular mechanisms regulating MuSC quiescence and activation states and heterogeneity. Moreover, we describe the latest advances that enhance our understanding of how MuSC metabolism adapts to quiescence and differentiation, and the role of the microenvironmental niche in regulating MuSC behavior and function. Finally, we present new insights into the pathological conditions associated with MuSC dysfunction, such as muscular dystrophies and aging, showing how the deregulation of MuSCs can lead to an exacerbation of pathology.


Non-satellite cell types with myogenic potential

A variety of cells different from satellite cells possess myogenic potential (Table 1). Some of these atypical myogenic cell types are considered as potential therapeutics for muscular dystrophy. Most promising amongst these are mesoangioblast-like cells/pericytes. These cells are perivascular mesenchymal-like progenitors that can differentiate into various cell types of mesodermal origin, including skeletal muscle fibers and cardiac muscle 77 , 78 . Such cells have been isolated from embryonic and postnatal aorta, bone marrow, cardiac, and skeletal muscle, as well as other tissues 79 . The ease of transduction with viral vectors and the ability of these cells to cross the endothelial wall in the presence of inflammation, as in the case of muscular dystrophy, makes them very interesting therapeutic candidates for systemic delivery 80 . Recent reports revealed that human pericytes as well as genetically corrected dystrophin deficient murine pericytes can not only fuse to muscle fibers but generate cells in the satellite cell position 81 , 82 . Taken together, this atypical myogenic cell type holds outstanding therapeutic promise and translational potential for the treatment of muscular dystrophy.

Several other cell types with varying myogenic potential that could be of therapeutic relevance have been described. (i) A rare population of cells expressing CD133 or Prominin-1 that is present in human skeletal muscle and circulating in adult blood has myogenic potential 83-85 . In co-culture with myogenic cells, CD133 positive progenitors differentiate into myotubes. Upon intramuscular application or injection into the bloodstream these cells are able to home to the satellite cell niche and to generate fibers expressing human dystrophin in immunocompromised mdx mice more efficiently than human myoblasts 85 . Interestingly, local injection of this cell type seems to promote muscle regeneration through increased vasculogenesis 86 . These studies suggest that the systemic delivery of CD133 positive cells from immunologically matched healthy donors or genetically corrected cells from patient blood could be a feasible strategy for the treatment of muscular dystrophy. (ii) In human muscles a population of myoendothelial cells that co-express myogenic and endothelial cell markers (CD56, CD34, CD144) have been described to extensively contribute to regeneration upon transplantation into cardiotoxin injured skeletal muscle of SCID mice 87 . Interestingly, this cell type can be cultured clonally for long periods while retaining its myogenic properties. (iii) Another population of muscle resident cells has been shown to express aldehyde dehydrogenase (ALDH) but not CD34 88 . These cells can participate in muscle formation and populate the satellite cell compartment upon injection into injured muscle of immunocompromised mice. ALDH positive and CD34 negative cells appear to have an outstanding capacity for proliferation upon transplantation. (iv) The Sassoon laboratory has discovered muscle resident PW1+ interstitial cells (PICs) which possess Pax7 dependent myogenic activity during postnatal muscle growth, contribute to skeletal muscle regeneration and are able to generate satellite cells 89 . (v) Asakura et al. have described a fraction of Sca-1 positive SP cells found in muscle which undergo myogenic specification after co-culture with myoblasts 90 . If injected into regenerating muscle of SCID mice, SP cells give rise to both myocytes and satellite cells. (vi) Several groups have shown that bone marrow-derived cells, such as hematopoietic and mesenchymal stem cells, can participate in the regeneration of muscle, albeit with a very low efficiency 91-95 . (vii) Last but not least, embryonic (ES) and induced pluripotent (iPS) stem cells are currently explored as potential candidates for cell therapy of muscular diseases. Barberi et al. were able to derive engraftable myoblasts from human ES cells 96 . Gene therapies with patient derived corrected iPS cells offer an advantage over ES cells by providing a genetic match and thereby decreasing the likelihood of immunorejection. Darabi et al. reported the generation of functional skeletal muscle from mouse ES and iPS cells by ectopic expression of Pax3/7 and the engraftment of these cells into the satellite cell niche in dystrophic mice 97 , 98 . Because of the possible development of teratomas, the use of ES and iPS cells will have to be carefully monitored in a clinical setting 99 .


مراجع

Ham R, Veomett M. . Mechanisms of Development. CV Mosby: St Louis 1980, pp 5–107

Osawa M, Hanada K, Hamada H, Nakauchi H . Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell علم 1996 273: 242–245

Rasko J وآخرون. The flt3/flk-2 ligand: receptor distribution and action on murine haemopoietic cell survival and proliferation سرطان الدم 1995 9: 2058–2066

Okada S وآخرون. في الجسم الحي و في المختبر stem cell function of c-kit- and Sca-1-positive murine hematopoietic cells دم 1992 12: 3044–3050

Mauro A . Satellite cells of skeletal muscle fibers J Biochem Biophys Cytol 1961 9: 493–498

Lipton BH, Schultz E . Developmental fate of skeletal muscle satellite cells علم 1979 205: 1292–1294

Cossu G وآخرون. في المختبر differentiation of satellite cells isolated from normal and dystrophic mammalian muscles. A comparison with embryonic myogenic cells Cell Differ 1980 9: 357–368

Bischoff R . The satellite cell and muscle regeneration Engel AG, Franszini-Armstrong C (eds) Myogenesis McGraw-Hill 1994 pp 97–118

Yablonka-Reuveni Z, Rivera AJ . Temporal expression of regulatory and structural muscle proteins during myogenesis of satellite cells on isolated adult rat fibers Dev Biol 1994 164: 588–603

Cornelison D, Wold B . Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells Dev Biol 1997 191: 270–283

Beauchamp J وآخرون. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells J Cell Biol 2000 151: 1221–1233

Yoshida N وآخرون. Cell heterogeneity upon myogenic differentiation: down-regulation of MyoD and Myf5 generates ‘reserve cells’ J Cell Sci 1998 111: 769–779

Miller J, Schafer L, Dominov J . Seeking muscle stem cells Curr Topic Dev Biol 1999 43: 191–214

Seale P, Rudnicki M . A new look at the origin, function, and ‘stem-cell’ status of muscle satellite cells Dev Biol 2000 218: 115–124

Pate DW وآخرون. Isolation and differentiation of mesenchymal stem cells from rabbit muscle Clin Res 1993 41: 374A

Young HE وآخرون. Pluripotent mesenchymal stem cells reside within avian connective tissue matrices In Vitro Cell Dev Biol Anim 1993 29A: 723–736

Rogers JJ وآخرون. Differentiation factors induce expression of muscle, fat, cartilage, and bone in a clone of mouse pluripotent mesenchymal stem cells Am Surg 1995 61: 231–236

Williams JT وآخرون. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes Am Surg 1999 65: 22–26

Young HE وآخرون. Human pluripotent and progenitor cells display cell surface cluster differentiation markers CD10, CD13, CD56 and MHC class-I Proc Soc Exp Biol Med 1999 221: 63–71

Pittenger MF وآخرون. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells علم 1999 284: 143–147

Katagiri T وآخرون. Bone morphogenic protein-2 converts differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage J Cell Biol 1994 127: 1755–1766

Lee J وآخرون. Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing J Cell Biol 2000 150: 1085–1099

Bosch P وآخرون. Osteoprogenitor cells within skeletal muscle J Orth Res 2000 18: 933–944

Musgrave DS وآخرون. Ex vivo gene therapy to produce bone using different cell types Clin Orth 2000 378: 290–305

Musgrave DS وآخرون. Ex vivo gene therapy to produce bone using different cell types Adachi N وآخرون. Muscle-derived cell-based خارج الجسم الحي gene therapy for the treatment of full-thickness articular cartilage defects. J Rheumatol (in press)

Gussoni E وآخرون. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation طبيعة سجية 1999 401: 390–394

Jackson KA, Mi T, Goodell MA . Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية 1999 96: 14482–14486

Seale P وآخرون. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells زنزانة 2000 102: 777–786

Partridge TA, Beauchamp JR, Morgan JE . Conversion of mdx myofibers from dystrophin-negative to positive by injection of normal myoblasts طبيعة سجية 1989 337: 176–179

Beauchamp JR, Morgan JE, Pagel CN, Partridge TA . Quantitative studies of efficacy of myoblast transplantation Muscle Nerve 1994 18: (Suppl) 261

Huard J وآخرون. Gene transfer into skeletal muscles by isogenic myoblasts Hum Gene Ther 1994 5: 949–958

Fan Y, Maley M, Beilharz M, Grounds M . Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer therapy Muscle Nerve 1996 19: 853–860

Beauchamp JR, Morgan JE, Pagel CN, Partridge TA . Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source J Cell Biol 1999 144: 1113–1122

Guerette B وآخرون. Control of inflammatory damage by anti-LFA-1: increased success of myoblast transplantation Cell Transplant 1997 6: 101–107

Qu Z وآخرون. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy J Cell Biol 1998 142: 1257–1267

Cossu G, Mavilio F . Myogenic stem cells for the therapy of primary myopathies: wishful thinking or therapeutic perspective? J Clin Invest 2000 105: 1669–1674

Smythe GM, Hodgetts S, Grounds M . Problems and solutions in myoblast transfer therapy J Cell Mol Med 2001 5: 33–47

Hodgetts S, Beilharz M, Scalzo T, Grounds M . Why do cultured transplanted myoblasts die في الجسم الحي؟ DNA quantification shows enhanced survival of donor myoblasts in host mice depleted of CD4 + /CD8 + or NK1.1 + cells Cell Transplant 2000 9: 489–502

Torrente Y وآخرون. Intraarterial injection of muscle-derived CD34+Sca-1+ stem cells restores dystrophin in mdx mice J Cell Biol 2001 152: 335–348

Jankowski R, Haluszczak C, Trucco M, Huard J . Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells Hum Gene Ther 2001 12: 619–628

DeAngelis L وآخرون. Skeletal myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta co-express endothelial and myogenic markers and contribute to post-natal muscle growth and regeneration J Cell Biol 1999 147: 869–878

DeAngelis L وآخرون. Skeletal myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta co-express endothelial and myogenic markers and contribute to post-natal muscle growth and regeneration Qu-Peterson Z وآخرون. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol (in press)


شاهد الفيديو: زراعة الشعر بالخلايا الجذعية الحلم المنتظر (كانون الثاني 2022).