معلومة

كيف أجد تسلسل الجين Phage BxB1؟


على وجه التحديد ، أحاول العثور على تسلسل BxB1 ومواقعه. لقد نجحت في العثور على تسلسلات موقع Att ، لكن لدي مشكلة أكبر قليلاً في العثور على تسلسل إعادة التركيب الفعلي. لقد بحثت في Genebank ، لكن لا يمكنني العثور على تسلسل نهائي لـ BxB1 recombinase.

كيف يمكنني البحث عن هذا التسلسل؟

تحرير: هناك شيء آخر يثير قلقي بشأن صحة التسلسلات التي أجدها. على سبيل المثال ، لقد رأيت أن Addgene يحتوي على تسلسل pCAG-NLS-HA-Bxb1 هذا. ومع ذلك ، لست متأكدًا من كيفية التحقق من صحة هذا التسلسل.


http://phagesdb.org/phages/Bxb1/ هنا يمكنك النقر فوق "محلي BLAST هذا الجينوم" سيعطيك التسلسل بتنسيق FASTA ثم يمكنك النقر فوق BLAST إذا كنت تريد معلومات إضافية حول التسلسل والمحاذاة وما إلى ذلك


تنويع التعديلات الجينية المستهدفة في المتصورة المنجلية باستخدام Bxb1 Integrase و intronic أتب

التلاعب الجيني لطفيل الملاريا البشري المتصورة المنجلية هناك حاجة لاستكشاف بيولوجيا مسببات الأمراض وتقييم الأهداف المضادة للملاريا. ومع ذلك ، يتفاقم بسبب انخفاض كفاءة تعداء العدوى ، وندرة الواسمات المختارة والجينوم المتحيز A / T-rich. في حين تم إدخال العديد من التقنيات التمكينية خلال العقدين الماضيين ، فإن التعديل السهل والواسع النطاق للجينات الأساسية لا يزال يمثل تحديًا. لقد ابتكرنا مؤخرًا تطبيقًا جديدًا لاستراتيجية التكامل Bxb1 لتلبية هذه الحاجة من خلال intronic أتب التسلسل ضمن الجين المعني. عل الرغم من هذا أتب صامت وبدون تأثير على تضفير intron أو ترجمة البروتين ووظيفته ، فهو يسمح بتعديل الجينات بكفاءة مع الحد الأدنى من مخاطر حدوث تغييرات غير مرغوب فيها في مواقع الجينوم الأخرى. نحن نصف مجموعة التطبيقات لهذه الطريقة الجديدة بالإضافة إلى الحالات المحددة حيث تكون مفضلة على CRISPR-Cas9 وغيرها من التقنيات. كما تمت مناقشة مزايا وقيود الاستراتيجيات المختلفة لتحرير الجينات الذاتية.


ملخص

Mycobacteriophage Bxb1 عبارة عن فجوة معتدلة من المتفطرة اللطخة ويشكل ليسوجينات مستقرة يتم فيها دمج جينوم Bxb1 في كروموسوم المضيف. يشفر Bxb1 مجموعة متكاملة من عائلة إعادة التركيب السيرين الكبيرة التي تحفز تكامل واستئصال جينوم Bxb1. نوضح هنا أن Bxb1 يندمج في الكروموسومات أتب موقع يقع داخل 3 ′ نهاية groEL1 مثل هذا التكامل يؤدي إلى تغيير بقايا الأحماض الأمينية C-terminal 21. ناقل بلازميد ذو كفاءة تكاملية يحتوي على جين Bxb1 Integrase وتسلسلات DNA المحيطة به يتحول بكفاءة M. smegmatis عبر التكامل في أتب. المواد المؤتلفة المتكاملة Bxb1 مستقرة ومتوافقة تمامًا مع متجهات التكامل L5. يحدث تبادل حبلا ضمن تسلسل أساسي مشترك 8 نقاط أساس موجود في أتب وداخل AttP موقع يقع مباشرة في اتجاه المنبع من جين الملتهمة المتكاملة. إنشاء تعريف في المختبر يُظهر نظام تكامل Bxb1 أن إعادة التركيب تحدث بكفاءة دون الحاجة إلى عوامل مساعدة عالية الطاقة ، أو معادن ثنائية التكافؤ ، أو الالتفاف الفائق للحمض النووي ، أو بروتينات إضافية.


ثلاث نقاط صليب

(ملاحظة: هذه المرة أحد الوالدين لديه كل الطافرة والآخر جميع الأليلات من النوع البري ولا يجب الخلط بينه وبين الأمر!)

مجموعة 1 hmr 435
المجموعة 2 ح + م + ص + 435
المجموعة 3 ح + السيد + 25
المجموعة 4 جلالة الملك + ص 25
المجموعة 5 hmr + 35
المجموعة 6 ح + م + ص 35
المجموعة 7 جلالة الملك + ص + 5
المجموعة 8 ح + السيد 5
المجموع = 1000

يوضح تحليل هذه البيانات كيف أن ملف اثنيننقطة عبور بين م و ص قلل من قيمتها المسافة الحقيقية بينهما.


مقدمة

الجراثيم هي الكيانات البيولوجية الأكثر عددًا في المحيط الحيوي ، مع ما يقدر بـ 10 31 جسيمًا [1]. يتسم سكان العالم بديناميكية عالية مع ما يقدر بـ 10 23 إصابة بالعاثيات في الثانية [2] ، ومن المحتمل أن تتطور منذ ما بين 2 إلى 4 مليارات سنة. ليس من المستغرب أن يؤدي هذا إلى ظهور مجموعة سكانية شديدة التنوع جينيًا [3] ، [4]. لا توسع معظم العاثيات نطاق مضيفها إلى ما بعد جنس بكتيري واحد ، ومن المحتمل أن توفر خصوصية المضيف عائقًا كبيرًا أمام التبادل الحر للمواد الجينية بين العاثيات من مضيفات بكتيرية مختلفة [5]. وبالتالي ، من غير المعتاد العثور على تشابه واسع في تسلسل النوكليوتيدات بين العاثيات من مضيفات مختلفة ، غالبًا ما تشترك هذه العاثيات في عدد قليل من الجينات التي يمكن تحديدها من خلال مقارنات تسلسل الأحماض الأمينية ، إن وجدت.

من اللافت للنظر أن العاثيات القادرة على إصابة نوع بكتيري واحد يمكن أن تكون شديدة التنوع أيضًا ، كما هو الحال على سبيل المثال لاقمات الحمض النووي المتميزة وراثيًا في الإشريكية القولونية، مثل & # x003c6X174 و M13 و lambda و T1 و T4 و T5 و T7 [6]. يتجلى هذا أيضًا في الفطريات الفطرية والفيروسات # x02013 التي تصيب المضيفين المتفطرات & # x02013 منها 62 جينومًا من العاثيات المعروف أنها تصيب المتفطرة اللطخة تم تسلسل mc 2155 [7] ، [8] ، [9]. كل هذه العاثيات الذيل dsDNA ، تقتصر على نمطين مورفوتيب ، Siphoviridae و Myoviridae [10]. عند تجميعها وفقًا لمقارنات تسلسل النيوكليوتيدات الإجمالي ، تظهر تسع مجموعات رئيسية (A & # x02013I) ، مع خمسة جينومات (Giles ، Corndog ، Wildcat ، Omega ، TM4) فردية بدون أقارب [7]. خمسة من المجموعات متنوعة تمامًا ويمكن تقسيمها إلى مجموعات فرعية ، بحيث يوجد ما يقرب من 21 نوعًا مختلفًا من الجينوم [7]. اثنان فقط من هذه (المجموعات الفرعية C1 و C2) يتوافقان مع العاثيات ذات التشكل الفيروسي العضلي (مع ذيول مقلصة) ، مما يوضح الذخيرة الجينية العالية لأولئك الذين لديهم أنماط مورفوتية فيروسية siphoviral (ذيول طويلة غير مقلصة).

كما هو الحال مع المجموعات الأخرى من العاثيات بما في ذلك تلك المعدية بوركولديريا [11], الزائفة [12], السالمونيلا [13] ، أو المكورات العنقودية [14] & # x02013 نسبة عالية (& # x0223c80 & # x00025) من جينات ترميز البروتين المتفطّرة المتوقعة جديدة من حيث عدم وجود متماثلات يمكن اكتشافها في قواعد البيانات العامة [7]. تحتوي الجينومات أيضًا على معماريات فسيفساء مميزة ، بحيث يمكن اعتبار كل جينوم فردي مكونًا من سلسلة من الوحدات الفردية ، يمكن مشاركة كل منها بواسطة الجينومات التي قد لا تكون مرتبطة ارتباطًا وثيقًا [15] ، [16]. في الفطريات الفطرية ، من الشائع أن تتوافق هذه الوحدات الفردية مع الجينات المفردة ، ويمكن تقديم هذه الفسيفساء من خلال تصنيف الجينات ذات الصلة (من خلال متواليات الأحماض الأمينية المشتركة) في الفاميات (phams) ، والتي تمثل سلالات هذه الفاميات باستخدام الدوائر phamily [7] ، [16].

يمكن إنشاء فسيفساء جينوم البكتيريا كما كشفتها التحليلات المقارنة من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. على سبيل المثال ، ليس من غير المألوف العثور على البلداء ، أجزاء من الحمض النووي موجودة في جينوم واحد ولكنها غائبة عن الجينوم ذي الصلة ، والذي يحتوي عادةً على إطار قراءة مفتوح محاط بمحفز ونهائي [3] ، [17]. يمكن أن تنشأ عمليات الإدخال وإعادة الترتيب أيضًا بفعل الينقولات [8] وعمل العناصر المتحركة الأخرى مثل الإنترونات [18] والإنتينات [19] وتلك التي تكويد نوكليازات داخلية موجبة [20] ، والتي يتم ملاحظتها جميعًا. تقوم العديد من العاثيات بتشفير أنظمة إعادة التركيب المحافظة الخاصة بالموقع مثل الجمل المدمجة وانفرتازات الحمض النووي ، والتي تتوسط أيضًا في إعادة ترتيب الحمض النووي. يمكن إنشاء الوصلات بين وحدات الفسيفساء عن طريق إعادة التركيب المتماثل في تسلسلات حدية محفوظة قصيرة [21] ، [22] ، ولكن نظرًا لأنه لا يمكن تحديد مثل هذه التسلسلات في معظم حدود الفسيفساء ، فإن أحداث إعادة التركيب غير المشروعة المستقلة عن التناظر التسلسلي الشامل تمثل آلية جذابة لتوليد الفسيفساء. [23] ، [24]. قد تسهل إعادة التركيب المشفر بالعاثية مثل هذه الأحداث [25].

نحن هنا نصف تحديد التسلسل لثمانية عشر جينومًا جديدًا لبكتيريا المتفطرة المعزولة من مواقع متفرقة جغرافيًا عبر الولايات المتحدة. تم عزل وتسلسل وتعليق غالبية هذه العاثيات من قبل الطلاب الجدد في برنامج تعليمي وبحث منظم ومتكامل يدعمه معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) تحالف تعليم العلوم (SEA). تكشف المقارنة الجينية مع جينومات المتفطرات الموصوفة سابقًا عن العديد من الرؤى الجديدة في تنوع المتفطرة الفطرية ، والتطور ، والوظائف البيولوجية. أولاً ، لا نرى أي ارتباط وثيق بين نوع الجينوم والموقع الجغرافي أو وقت العزلة. ثانيًا ، من الواضح أن مجموعة المتفطرات عمومًا لا تزال أقل من العينات ، لأن العاثيات المفردة الجديدة ذات الجينومات غير المرتبطة تمامًا بالعاقمات المعروفة & # x02013 وكذلك الأقارب الجدد لجينومات المفرد المصنفة سابقًا & # x02013 لا يزال من الممكن عزلها. ثالثًا ، تقدم الجينومات المتسلسلة حديثًا نظرة ثاقبة لآليات تباين الجينوم بما في ذلك العناصر المتنقلة للبكتيريا المتفطرة (MPME) والنوكليازات الداخلية الموجهة والأنتينات. أخيرًا ، نصف رؤى جديدة حول أساس مناعة العدوى الفائقة بين المتفطرات العنقودية A ، ونحدد مثالًا غير عادي لسرقة المناعة.


معلومات الكاتب

الانتماءات

Département de biochimie، de microbiologie et de bio-informatique، Faculté des sciences et de génie، Université Laval، Québec City، Québec، Canada

مورا بي ديون وفرانك أوشسلن وسيلفان موينو

Groupe de recherche en écologie buccale، Faculté de médecine dentaire، Université Laval، Québec City، Québec، Canada

مورا بي ديون وفرانك أوشسلن وسيلفان موينو

مركز فيليكس ديهيريل المرجعي للفيروسات البكتيرية ، جامعة لافال ، مدينة كيبيك ، كيبيك ، كندا


يجد طلاب صيد العاثيات عاثيات جديدة في تربة ضواحي سانت لويس

تم مؤخرًا نشر ورقة بحثية بعنوان "توسيع تنوع الفطريات الفطرية: رؤى في بنية الجينوم وتطورها" في بلوس واحد، وهي مجلة على الإنترنت تخضع لمراجعة الأقران وتنشرها المكتبة العامة للعلوم.

تضمن المؤلفون 12 طالبًا جامعيًا من جامعة واشنطن شاركوا كطالب جديد في الدورة الافتتاحية لصيادين Phage Hunters في جامعة واشنطن في سانت لويس.

العاثيات هي فيروسات تصيب البكتيريا عن طريق حقن مادة وراثية فيها بمكبس يشبه المحاقن. بل إنها في الواقع تبدو وكأنها محاقن غريبة.

صيد العاثيات

Phage Hunters هي دورة تركز على الطلاب الجدد قدمها قسم الأحياء لأول مرة في عام 2008. تقدم الدورة ، التي يدعمها تحالف تعليم العلوم في معهد هوارد هيوز الطبي ، للطلاب الجدد تجربة بحثية ، وعزل العاثيات الجديدة وتمييزها.

بدءًا من فصل الخريف ، يقوم الطلاب بجمع عينات من التربة ، وعزل العاثيات من التربة. بمجرد عزل الطلاب ، يقوم الطلاب بتنقية العاثية وتمييزها. ما يقرب من جميع العاثيات المعزولة بهذه الطريقة جديدة على العلم.

خلال فصل الشتاء ، يتم تسلسل جينومات الحمض النووي للعديد من العاثيات ، وفي الفصل الدراسي الربيعي يقوم الطلاب بتحليل معلومات التسلسل للحصول على صورة متعمقة لكيفية عمل العاثيات الخاصة بهم وترتبط وراثيًا بالعاقمات الأخرى المميزة سابقًا.

قالت سارة سي إلجين ، دكتوراه ، أستاذة الفنون والعلوم المتميزة فيكتور همبرغر ، التي درست الفصل: "إن جزءًا مهمًا من تعليم العلوم هو مساعدة الطلاب على تعلم" التفكير كعالم ". "تتطلب هذه الدورة من الطلاب القيام بذلك تمامًا ، مما يمنحهم مهارات تحليلية ومنظورًا جديدًا. بالإضافة إلى ذلك ، لديهم الكثير من ملكية المشروع - إنه كذلك هم فج - شيء لم يدرسه أي شخص آخر. الاكتشاف هو إثارة حقيقية! "

المزيد عن Phages

Phage هي أكثر "الكيانات البيولوجية" عددًا في العالم (يجب أن يطلق عليها كيانات لأنه لا يوجد أحد متأكد تمامًا مما إذا كانت على قيد الحياة بأي معنى عملي). يُعتقد أن هناك 10 31 جسيمًا فيروسيًا تطفو حولها ، و 10 23 عدوى بالعاثية في الثانية.

معظمهم يتخصصون في إصابة نوع معين من البكتيريا. بالنسبة للفئة كانت البكتيريا المضيفة المتفطرة اللطخة، وهي البكتيريا المسببة للجذام والسل ، ولكنها لا تسبب المرض في حد ذاتها.

لأنه مزارع سريع ، M. smegmatis أصبح عاملا في المختبر.

تم وصف حوالي 70 من العاثيات التي تتغذى على المتفطرات سابقًا. مؤلفو بلوس واحد أفاد الورق ، الذي كان وقتها طلابًا جددًا في 12 كلية وجامعة ، بعزل 18 جزءًا جديدًا وتسلسلها والتعليق عليها (وسم أجزاء الجينوم التي تُعرف وظيفتها).

انجليكا والعم هوي

تضمنت الفطريات الفطرية الجديدة نوعين وجدهما طلاب WUSTL. تم عزل أحدهما ، واسمه أنجليكا ، من التربة في كلايتون بولاية ميزوري. والآخر ، يُدعى العم هاوي ، تم عزله عن التربة في المدينة الجامعية بولاية ميسوري ، وكلاهما كلايتون والمدينة الجامعية من ضواحي سانت لويس.

(يمتلك الطلاب "حقوق تسمية" للعاثية التي يعزلونها. وبالتالي ، فإن العاثيات الأخرى لها أيضًا أسماء مسلية ، بما في ذلك Corndog و Fruitloop و Tweety و Predator و Gumball).

كان لدى معظم العاثيات الجديدة ، بما في ذلك اثنتان من سانت لويس ، ما يسمى التشكلات السيفية - ذيول طويلة مرنة غير مقلصة ، ورؤوس متساوية القياس عشرونية الوجوه.

بمجرد أن قام الطلاب بتسلسل العاثيات ، شرعوا في مقارنة جينوماتهم مع تلك الخاصة بالعاقمات الأخرى. جينومات البكتيريا هي فسيفساء أو مجموعات من الوحدات ، كل منها يتوافق مع جين أو مجموعة من الجينات.

نظرًا لأنه يُعتقد أن العاثيات قد تطورت من خلال تبادل هذه الوحدات ، فإن مقارنة العاثيات يمكن أن توفر أدلة على تاريخها التطوري.

يبدو أن الفطريات الفطرية تنقسم إلى تسع مجموعات رئيسية ، مع عدد قليل من بقايا الطعام ، أو مفردة ، مع عدم وجود أقارب مقربين. انجليكا ، فج كلايتون ، سقطت في العنقود K و العم هاوي ، فجوة المدينة الجامعية في المجموعة ب.

كانت هناك تكهنات كبيرة حول الآليات التي أدت إلى ظهور جينومات الفسيفساء وقدم العمل أيضًا بعض الأفكار حول هذه المشكلة. تشير مجموعات العاثيات إلى النقل الجانبي للجينات أو شظايا الحمض النووي من عاثية إلى أخرى ، وكذلك الميراث بالنسب.

المؤلفون من طلاب WUSTL هم: Samantha T. Alford ، Alexander G. Anderson ، William D. Barshop ، Lisa Deng ، Vincent J. Huang ، Peter M. Hynes ، Patrick C. ، إميلي ج.فايسر ، وبو تشانغ.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن طالب الدراسات العليا المساعد ، أنتوني تابس ، والمدربون إلجين ، كاثي هافر ، كريس شافر هم مؤلفون مشاركون في الورقة.

يقول هافر ، دكتوراه ، كبير المحاضرين في علم الأحياء: "إنه لمن المجدي جدًا أن نرى الطلاب يشاركون في العمل الذي نقوم به في دورة Phage Hunters". "يزدهر الكثيرون حقًا عندما يكتسبون الثقة في معرفتهم البيولوجية وقدرتهم البحثية. ويؤكد النشر عضويتهم في مجتمع العلوم."


الملخص

يمكن أن تحفز العبارات المتكاملة المشتقة من العاثيات التكامل غير القابل للانعكاس والمخصص للموقع للحمولات المعدلة وراثيًا في موضع الكروموسومات ، مما يؤدي إلى خلايا الثدييات التي تعبر بشكل ثابت عن الجينات المحورة أو الدوائر ذات الأهمية. أظهرت الدراسات السابقة تكاملًا عالي الكفاءة بواسطة Bxb1 Integrase في خلايا الثدييات. هنا ، نوضح أن طفرة النقطة (Bxb1-GA) في المواقع المستهدفة Bxb1 تزيد بشكل كبير من كفاءة التكامل بوساطة Bxb1 في روزا 26 الموضعية في خلايا مبيض الهامستر الصيني ، مما أدى إلى أعلى كفاءة تكامل تم الإبلاغ عنها مع تكامل خاص بالموقع في خلايا الثدييات. لا تتفاعل مواقع متحولة النقطة Bxb1-GA مع مواقع من النوع البري Bxb1 ، مما يتيح استخدامها في التطبيقات التي تتطلب أزواجًا متعامدة من المواقع المستهدفة. في المقارنة ، قمنا باختبار كفاءة وتعامل الجمل المتكاملة ϕC31 و Wβ ، ونوضح أن Wβ لديها كفاءة تكامل بين تلك الخاصة بـ Bxb1-GA والنوع البري Bxb1. تقدم بياناتنا مجموعة أدوات من العبارات المتكاملة لإدخال الحمولات مثل دوائر الجينات أو الجينات المحورة العلاجية في خطوط خلايا الثدييات.


المواد والأساليب

البلازميدات والحمض النووي

البلازميدات في المختبر تحليل نشاط Integrase ، الذي يحتوي على اثنين Att المواقع ، تم إنشاؤها عن طريق إدخال مزدوج تقطعت بهم السبل الاصطناعية Att أليغنوكليوتيدات الموقع في pFM122 ، باستخدام الإجراءات الموصوفة (22 ، 23) (الشكل التكميلي S1 والجداول S1 و S2). تتم تسمية البلازميدات هنا وفقًا لنوعها Att مواقع على سبيل المثال ، يحتوي pϕC31LRX على ϕC31 ATL و أتر المواقع (الحرف "X" هو التمييز بين هذه المواقع في المختبر ركائز من في الجسم الحي ركائز موصوفة أدناه). في كل في المختبر الركائز المستخدمة هنا ، Att يتم توجيه المواقع "وجهاً لوجه" ، بحيث ينتج عن إعادة التركيب تحليل بلازميد الركيزة إلى دائرتين صغيرتين (انظر الشكل 3 ب). تمت تنقية DNA البلازميد شديد الالتواء من المتحولة الإشريكية القولونية خلايا DH5 ، باستخدام مجموعة Qiagen HiSpeed ​​Midi وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تقدير تركيزات الحمض النووي عن طريق قياس الامتصاصية عند 260 نانومتر.

في الجسم الحي ركائز الاختبار لاكتشاف ϕC31 Integrase أو Integrase – RDF تم تصنيع نشاط بروتين الاندماج من pFM141 (مشتق من pDB35 (24)) ، والذي يحتوي على أصل pSC101 للنسخ المتماثل ، وجين مقاومة كانامايسين ، و جالك الجين المحاط بمواقع إنزيم تقييد فريدة تسمح بإدخال Att مواقع إعادة التركيب مثل أليغنوكليوتيدات اصطناعية مزدوجة الشريطة (الشكل التكميلي S1 ، الجدول S1). تمت تسمية هذه البلازميدات على النحو الموصوف أعلاه ، حيث تشير "del" و "inv" إلى النتيجة المتوقعة لإعادة التركيب ، والتي تعتمد على الاتجاه النسبي للاثنين Att المواقع (انظر الشكلين 1 أ و 2 أ). على سبيل المثال ، يحتوي pϕC31delLR على ϕC31 ATL و أتر المواقع المرافقة جالك، "وجهاً لوجه" بحيث يؤدي إعادة التركيب إلى حذف جالك المقطع ، في حين أن Att المواقع في pϕC31invLR "وجهاً لوجه" ، لذلك ينتج عن إعادة التركيب انعكاس اتجاه جالك قطعة. تم إجراء ركائز اختبار مماثلة لـ Bxb1 Integrase عن طريق الإدراج Att أليغنوكليوتيدات الموقع في pMS183Δ ، وهو متغير من pFM141 مع مجموعة مختلفة من مواقع الاستنساخ.

إعادة التركيب بواسطة بروتينات الانصهار Integrase – RDF في الجسم الحي. (أ) ال في الجسم الحي فحص. اللوحة اليسرى: إعادة تركيب ركيزة حذف. المنتج جالك-الدائرة المحتوية على الحمض النووي (المميزة بعلامة X) ليس لها أصل للتكاثر ، لذلك يتم فقدها حيث تتكاثر الخلايا مما يؤدي إلى تغيير لون المستعمرة على وسط MacConkey galactose ، والذي يمكن تقييمه عن طريق الفحص البصري (24). اللوحة اليمنى: إعادة تركيب ركيزة معكوسة تقلب اتجاه جالك الجين الذي لا يغير حجم البلازميد (أو جالك النمط الظاهري) ولكنه يغير أحجام منتجات هضم التقييد. (ب) إعادة تركيب AttP × أتب و ATL × أتر ركائز الحذف (pϕC31delPB و pϕC31delLR على التوالي) بواسطة ϕC31 Integrase وبروتين الانصهار المتكامل RDF ϕC31.Int-gp3 في الجسم الحي فحص لون المستعمرة. (جF) تحليل في الجسم الحي منتج إعادة التركيب DNA. احتوت الخلايا على البلازميدات الموضحة أعلى صور الهلام. تمت معالجة Miniprep DNA المستعاد من الخلايا باستخدام ScaI ، حيث تمت معالجة البلازميد (جزيئات) التعبير recombinase ولكن ليس الركيزة أو بلازميدات المنتج ، قبل الترحيل الكهربائي لهلام agarose بنسبة 1.2 ٪. عولجت العينات في D أيضًا باستخدام XhoI و PacI ، للكشف عن منتجات الانعكاس. يتم تسمية العصابات الخطية البلازميدية التعبير Int (Integrase) ، Fus (بروتين الانصهار) ، gp3 (RDF). يتم تسمية النطاقات الأخرى nr (غير المؤتلف ، أي الركيزة) ، و inv (منتج الانعكاس) ، و del (منتج الحذف). يتم إعطاء متوسط ​​مدى إعادة التركيب والانحراف المعياري (٪) من التقدير الكمي للتجارب الثلاثية أسفل كل حارة.

إعادة التركيب بواسطة بروتينات الانصهار Integrase – RDF في الجسم الحي. (أ) ال في الجسم الحي فحص. اللوحة اليسرى: إعادة تركيب ركيزة حذف. المنتج جالك-الدائرة المحتوية على الحمض النووي (المميزة بعلامة X) ليس لها أصل للتكاثر ، لذلك يتم فقدها حيث تتكاثر الخلايا مما يؤدي إلى تغيير لون المستعمرة على وسط MacConkey galactose ، والذي يمكن تقييمه عن طريق الفحص البصري (24). اللوحة اليمنى: إعادة تركيب ركيزة معكوسة تقلب اتجاه جالك الجين الذي لا يغير حجم البلازميد (أو جالك النمط الظاهري) ولكنه يغير أحجام منتجات هضم التقييد. (ب) إعادة تركيب AttP × أتب و ATL × أتر ركائز الحذف (pϕC31delPB و pϕC31delLR على التوالي) بواسطة ϕC31 Integrase وبروتين الانصهار المتكامل RDF ϕC31.Int-gp3 في الجسم الحي فحص لون المستعمرة. (جF) تحليل في الجسم الحي منتج إعادة التركيب DNA. احتوت الخلايا على البلازميدات الموضحة أعلى صور الهلام. تمت معالجة Miniprep DNA المستعاد من الخلايا باستخدام ScaI ، حيث تمت معالجة البلازميد (جزيئات) التعبير recombinase ولكن ليس الركيزة أو بلازميدات المنتج ، قبل الترحيل الكهربائي لهلام agarose بنسبة 1.2 ٪. عولجت العينات في D أيضًا باستخدام XhoI و PacI ، للكشف عن منتجات الانعكاس. يتم تسمية العصابات الخطية البلازميدية التعبير Int (Integrase) ، Fus (بروتين الانصهار) ، gp3 (RDF). يتم تسمية النطاقات الأخرى nr (غير المؤتلف ، أي الركيزة) ، و inv (منتج الانعكاس) ، و del (منتج الحذف). يتم إعطاء متوسط ​​مدى إعادة التركيب والانحراف المعياري (٪) من التقدير الكمي للتجارب الثلاثية أسفل كل حارة.

البلازميدات للتعبير التأسيسي عن الجمل المتكاملة ودمج بروتينات الاندماج RDF في بكتريا قولونية تم إنشاؤها عن طريق إدخال شظايا DNA ترميز البروتين بين مواقع NdeI و Asp718 الفريدة في pMS140 ، وهو ناقل تعبير منخفض المستوى مع أصل pMB1 من النسخ المتماثل (25). تم تصنيع البلازميدات للتعبير التأسيسي لـ RDFs (gp3 لـ ϕC31 Integrase و gp47 لـ Bxb1 Integrase) عن طريق إدخال تسلسلات تشفير مناسبة في pEK76 ، والتي لها أصل p15a (pACYC184) (25). تم اشتقاق تسلسل التكامل ϕC31 (بما في ذلك علامة صاحب الطرف C) من pARM010 (23 ، 26) وتم استنساخ تسلسل gp3 من pEY301 (6). كانت متواليات Codon المحسّنة لـ Bxb1 Integrase و RDF gp47 من GeneArt (Invitrogen).

تم إجراء تسلسل DNA الذي يشفر بروتين الاندماج ϕC31 Integrase - RDF (ϕC31.Int-gp3) من خلال الانضمام إلى تسلسلات الترميز لـ ϕC31 Integrase و gp3 عبر تسلسل رابط 18 نقطة أساس (ACTAGTAGATCTGGTACC) والذي يحتوي على تسلسل التعرف على نوكلياز التقييد SpeI، BglII و Acc65I (بهذا الترتيب) ، ويتم ترجمته إلى ببتيد أحماض أمينية 6 (TSRSGT) بين بقايا الطرف C لـ ϕC31 Integrase وبقايا الأحماض الأمينية الثانية في gp3 (الشكل 1C). تم استخدام نفس الأسلوب لإنشاء تسلسلات تشفير لبروتين الاندماج Bxb1 Integrase – RDF (Bxb1.Int-gp47) وبروتينات الاندماج "الهجينة" ϕC31.Int-gp47 و Bxb1.Int-gp3. توجد التسلسلات الكاملة للبلازميدات التمثيلية في الجدول التكميلي S2.

التعبير وتنقية الجمل الكاملة ، RDFs و Integrase – RDF fusions

تم تصنيع بلازميدات الإفراط في التعبير عن بروتينات الاندماج ϕC31 ، و Integrase – RDF ، و gp47 عن طريق استنساخ تسلسل الترميز كما هو موضح أعلاه في pET-28a (+) (Novagen) ، بين موقعي NdeI و XhoI. تحتوي البروتينات التي يتم التعبير عنها من هذه البلازميدات على علامة هيكساهيستيدين N-terminal (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM متبوعة بحمض أميني متكامل 2) ، للسماح بالتنقية عبر كروماتوجرافيا تقارب النيكل. بالنسبة للتعبير الزائد Bxb1 ، تم استنساخ تسلسل الترميز بعلامة hexahistidine للطرف C (TSHHHHHH) في pSA1101 (24) بين مواقع NdeI و Acc65I. تم استخدام pEY301 (6) للإفراط في التعبير عن gp3. كل هذه البلازميدات تمنح مقاومة الكاناميسين.

تمت تنقية جميع البروتينات المستخدمة في هذا العمل من خلال نفس البروتوكول بشكل أساسي. تم تحويل السلالة BL21 (DE3) pLysS باستخدام بلازميد التعبير الزائد ذي الصلة. تم تلقيح الثقافات البادئة (2 × مرق YT (10 مل) التي تحتوي على كاناميسين (50 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل)) من مستعمرات محولة مفردة ونمت طوال الليل عند 37 درجة مئوية. تم استخدام قسامة من مزرعة البادئ (4 مل) لتلقيح 2 × مرق YT المحتوي على كانامايسين وكلورامفينيكول (400 مل ، في قوارير مخروطية سعة 2 لتر). حضنت الثقافات عند 37 درجة مئوية مع الرج (250 دورة في الدقيقة) حتى تم الوصول إلى كثافة بصرية من 0.5 - 0.6 عند 600 نانومتر. تم بعد ذلك تبريد الثقافات بسرعة إلى 20 درجة مئوية ، وتم إحداث تعبير متكامل عن طريق إضافة isopropyl-β- d -thiogalactopyranoside (IPTG) (التركيز النهائي 0.5 ملي مولار). ثم نمت الثقافات لمدة 16 ساعة عند 20 درجة مئوية ، واهتزت عند 200 دورة في الدقيقة. تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية. تم غسل بيليه الخلية الناتج (∼2 جم) في 100 مل 20 ملي مولار Tris – HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 10 ملي MgCl2، وتم جمع الحبيبات بالطرد المركزي. تم تعليق الحبيبات المغسولة في 25 مل من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20 ملي فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 1 مول كلوريد الصوديوم ، 1 ملي ديثيوثريتول (DTT) ، 50 ملي إيميدازول ، 1.2 ملي مولار فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) و 1 ٪ (ت / ت) ) الإيثانول. تم تبريد المعلق في الجليد ، وتم تكسير الخلايا عن طريق الصوتنة (أداة Vibra-Cell ، Sonics and Materials Inc.) بسعة 40 ٪ رشقات 3 × 20 ثانية). تم الطرد المركزي للمعلق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، 48000 جم. تم جمع المادة الطافية وتمريرها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تم بعد ذلك تنقية المحلول المحتوي على البروتين القابل للذوبان بواسطة كروماتوجرافيا تقارب المعدن باستخدام عمود معبأ مسبقًا HisTrap FF سعة 1 مل (GE Healthcare). تمت معايرة العمود بـ 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت A (20 ملي فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 1 مول كلوريد الصوديوم ، 1 ملي ديثيوثريتول (DTT) و 50 ملي إيميدازول) ، بمعدل تدفق ثابت قدره 1 مل / دقيقة ، قبل تحميل محلول البروتين ، أيضًا في Buffer A. تم تمرير المخزن المؤقت A (25-30 مل) عبر العمود لغسل البروتينات غير المرتبطة والمكونات الخلوية الأخرى. بعد إنشاء خط أساس ثابت (الامتصاصية عند 260 و 280 نانومتر) ، تمت تصفية البروتين المرتبط بالمخزن B (المخزن المؤقت A ، ولكن مع 500 ملي مولار إيميدازول) ، وزيادة في تدرج خطي 0-100٪ على مدى 25 دقيقة. تم تقييم نقاء الكسور بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام SDS-polyacrylamide. تم غسيل الكسور المختارة مقابل 1 لتر من المخزن المؤقت C (25 ملي مولار تريس- حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5) ، 1 ملي مولار DTT ، 1 مولار كلوريد الصوديوم و 50٪ جلسرين) ، لمدة 6 ساعات على الأقل ، ثم في لتر واحد إضافي من المخزن المؤقت C الجديد لمدة 6 ساعات أخرى ، ويتم تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تم تقدير تركيزات البروتين عن طريق قياس الامتصاصية عند 280 نانومتر و / أو المقارنة مع معايير المواد الهلامية SDS-polyacrylamide المتقطعة الملطخة بـ Coomassie Brilliant Blue G-250. تم استخدام البروتينات المنقاة دون إزالة علاماته.

في الجسم الحي تفاعلات إعادة التركيب

فحوصات إعادة التركيب بوساطة Integrase بتنسيق بكتريا قولونية تم تعديله من الطريقة الموصوفة (لإعادة تركيب أصابع الزنك) في Akopian وآخرون. (27). باختصار ، جالك متحولة بكتريا قولونية تم تحويل سلالة DS941 لأول مرة باستخدام ركيزة اختبار مناسبة للبلازميد. تم تحضير الخلايا المختصة من السلالة المحتوية على البلازميد الركيزة ، وتم تحويلها باستخدام بلازميد معبر عن التكامل ، أو تم تحويلها بشكل مشترك باستخدام بلازميدات معبرة عن التكامل والـ RDF. تم اختيار المحولات على لوحات مؤشر MacConkey-galactose (قاعدة أجار MacConkey (ديفكو) المكملة بنسبة 1 ٪ جالاكتوز ، كاناميسين (50 ميكروغرام / مل لاختيار بلازميد الركيزة ومنتج إعادة التركيب الخاص به) ، الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل للاختيار من أجل إنكريتريز التعبير بلازميد) ، والكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل ، لاختيار التعبير عن البلازميد RDF عند الضرورة). Att مواقع إعادة التركيب مرتبة بحيث يتسبب إعادة التركيب في حذف جالك جين شاحب اللون (galK - ) تشير المستعمرات الموجودة على لوحات المؤشر إلى كفاءة إعادة التركيب ، بينما تشير المستعمرات الحمراء (galK + ) تشير المستعمرات إلى نقص إعادة التركيب ، انظر الشكل 2 أ و ب.

لتحديد مدى في الجسم الحي بشكل أكثر دقة ، تم عزل DNA البلازميد. تم استرداد الخلايا الموجودة على لوحات أجار MacConkey-galactose عن طريق تعليقها في مرق L (1 مل لكل لوحة). تم استخدام قسامة من المعلق (1 ميكرولتر) لتلقيح مرق L (10 مل) ، وتم تحضين هذه الثقافة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع اختيار كاناميسين. تم تحضير DNA Plasmid باستخدام مجموعة Qiagen miniprep. تم هضم عينات من DNA البلازميد باستخدام إنزيمات تقييد مناسبة ، ثم تم تحليلها بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز بنسبة 1.2٪. عولجت جميع العينات باستخدام ScaI ، الذي يخطي نواقل التعبير المؤتلف ولكن ليس الركيزة أو البلازميدات المؤتلفة. تمت معالجة المنتجات من الخلايا التي تحتوي على ركائز انقلابية بشكل إضافي باستخدام XhoI و PacI لإنتاج شظايا DNA مميزة من جزيئات غير مؤتلفة ومترابطة. تم وصف كمية العصابات على المواد الهلامية (5). تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ ، بدءًا من ثلاثة تحولات منفصلة للبلازميد الذي يعبر عن التكامل كما هو موضح أعلاه.

في المختبر تفاعلات إعادة التركيب وتحليل المنتج

تم تخفيف كل من التكاملات ، وبروتينات الاندماج ، و RDF ، و gp3 عند 0 درجة مئوية في مخزن مؤقت يحتوي على 25 ملي مولار تريس- حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5) ، 1 ملي مولار DTT ، 1 مولار كلوريد الصوديوم و 50٪ (ت / ت) جلسرين. تم تخزين المخففات عند -20 درجة مئوية. في تفاعل إعادة التركيب النموذجي ، تمت إضافة الإنزيم المخفف (∼4 ميكرومتر ، 4.5 ميكرولتر) إلى محلول (40 ميكرولتر) يحتوي على ركيزة DNA البلازميد (20 ميكروغرام / مل) ، وألبومين المصل البقري (100 ميكروغرام / مل) ، 50 ملي مولار تريس- حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5) ، 5 ملي سبيرميدين ، و 0.1 ملي مول EDTA. وبالتالي كان تركيز التكامل النهائي حوالي 400 نانومتر. تم تحضين العينة عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بالنسبة للتفاعلات في وجود gp3 ، تم خلط كميات متساوية من التكامل (∼8 ميكرومتر) و gp3 (في نفس المخزن المؤقت ∼8 ميكرومتر) جيدًا وحفظها على الجليد لمدة 15 دقيقة ، ثم 4.5 ميكرولتر من هذا الخليط (يحتوي على ∼4 ميكرومتر) من كل بروتين) إلى التفاعلات. تم اتباع بروتوكولات مماثلة في التفاعلات التي تنطوي على مزيج من التكامل والدمج – بروتينات الاندماج RDF انظر النص للحصول على التفاصيل. تم إنهاء التفاعلات بالتسخين عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. للتحليل عن طريق هضم إنزيم التقييد ، تم خلط أجزاء من خليط التفاعل (30 ميكرولتر) مع محلول B103 (90 ملي مولار من Tris - HCl pH 7.5 ، 20 ملي MgCl2 28 ميكرولتر) قبل إضافة NruI (نيو إنجلاند بيولابس 2 ميكرولتر ، 20 وحدة). تم تحضين العينات بعد ذلك عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. تمت إضافة محلول التحميل (25 ملي مولار من تريس - حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.2) ، 20٪ (وزن / حجم) فيكول ، 0.5٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 5 مجم / مل بروتياز K و 0.25 مجم / مل بروموفينول أزرق 7.5 ميكرولتر) إلى كل عينة ، ثم تم فصل المنتجات عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وتصور كما هو موصوف (28 ، 29). تم تسجيل الصور الرقمية للمواد الهلامية الملطخة بالإيثيديوم باستخدام جهاز BioRad GelDoc ، وتم عرضها في تباين عكسي.

في المختبر تحرير الجينات وتحليل المنتج

تم وصف طرق تجارب تبادل الكاسيت (8) (انظر أيضًا الشكل 6). إعادة التركيب بين Cm R / ccdB شظية أتر المواقع في كل نهاية (4 نانومتر) و ATL تمت ترقية المواقع في p (BEIZY) (12 نانومتر) في المختبر بمزيج من ϕC31 Integrase (200 نانومتر) و gp3 (200 أو 400 نانومتر) ، أو بواسطة ϕC31.Int-gp3 بروتين الانصهار (200 نانومتر). كانت ردود الفعل (الشروط كما هو موضح في القسم السابق) لمدة 1 و 2 و 18 ساعة. تم استخدام نواتج التفاعل للتحويل بكتريا قولونية تم اختيار خلايا DB3.1 بواسطة محولات التثقيب الكهربائي باستخدام الأمبيسيلين والكلورامفينيكول على ألواح L-agar. تم حساب عدد المستعمرات المسترجعة واستخدامها كتقييم لكفاءة المحفز المتكامل في المختبر تفاعلات. تم بعد ذلك تجميع المستعمرات من كل علاج ، وتم تحضير DNA miniprep ، وهضم عينات DNA باستخدام PstI ، وتم تحليل الحمض النووي المهضوم بنسبة 1.2 ٪ من الاغاروز الكهربائي للهلام للكشف عن نسبة البلازميدات مع استبدال الكاسيت الصحيح.


ما وراء سميج

تعديلات البروتوكول لعدة مضيفين بديلين متاحة الآن. انقر للحصول على المزيد.

صائدو العاثيات: لا تنسَ تضمين إحداثيات GPS صالحة عند إرسال الملتهمة الخاصة بك حتى تظهر على خريطة GPS الخاصة بنا.


شاهد الفيديو: Bacteriopage Lytic Cycle (كانون الثاني 2022).