معلومة

هل البلازميدات الخاصة بي منفردة؟


مرحبًا ، في صورة هلام agarose (70 فولت ، 3.5uL Gel Red في 30 مل من TBE ، 1٪ Agarose ، 1 ساعة تشغيل) ، قمت بفحص هضم بلازميد كبير (15 كيلو بايت ، موقع قطع واحد). تقول النظرية أن البلازميد المهضوم (الخطي) يجب أن يهاجر بشكل أبطأ من الشكل الفائق الالتفاف للواحد غير المقطوع (النطاق الأكبر من البلازميد غير المهضوم). في حالتي ، يكون البلازميد المهضوم أسرع من غير المهضوم. لقد اكتشفت أن البلازميد المهضوم لدي يمكن أن يكون أحادي الجديلة (http://bitesizebio.com/13524/how-to-identify-supercoils-nicks-and-circles-in-plasmid-preps/). هل تعتقد أن هذا يمكن أن يكون هو الحال؟


أنت تفترض أن البلازميد غير المهضوم ملفوف بشكل فائق ، ولكن على الأرجح يكون في شكل دائري مسترخي بسبب شقوق حبلا مفردة. يهاجر هذا النموذج بشكل أبطأ من الحمض النووي الخطي.


أعتقد أن أبسط تفسير لما تراه هو أن البلازميد غير المقطوع هو في شكل ثنائيات مكونة من إعادة التركيب بين دوائر أحادية. سيتم حلها في جزيئات خطية بحجم المونومر في عملية الهضم.

لم أر فكرة الدوائر المنفردة من قبل ، ولكن إذا حدث ذلك ، فأنا لا أعتقد أن هذا النموذج سيكون هو السائد ، وبالطبع لن تتأثر دوائر ssDNA هذه بعملية الهضم.


نواقل استنساخ الجينات: البلازميدات والبكتيريا

في علم الأحياء الجزيئي ، يشير المتجه إلى جزيء DNA الذي ينقل المادة الوراثية إلى خلية أخرى ويتم دمج المادة الوراثية في جينوم الخلية ويتم التعبير عنها. يسمى الحمض النووي الغريب الذي يحمله الناقل DNA المؤتلف. تتميز النواقل عمومًا بثلاثة عوامل مثل أصل النسخ المتماثل وموقع الاستنساخ المتعدد والعلامة الانتقائية. يشيع استخدام البلازميدات والعاثية النواقل الجزيئية التي يتم وصفها على النحو التالي.


ما هو البلازميد؟

في أبسط مستوياتها ، تكون البلازميدات عبارة عن قطع دائرية صغيرة من الحمض النووي تتكاثر بشكل مستقل عن الحمض النووي الصبغي للمضيف. توجد بشكل أساسي في البكتيريا ، ولكنها توجد أيضًا بشكل طبيعي في الكائنات البدائية وحقيقيات النوى مثل الخميرة والنباتات. في الطبيعة ، توفر البلازميدات واحدة أو أكثر من الفوائد الوظيفية للمضيف مثل مقاومة المضادات الحيوية ، والوظائف التحلل ، و / أو الفوعة. تحتوي جميع البلازميدات الطبيعية على أصل النسخ المتماثل (الذي يتحكم في نطاق المضيف وعدد نسخ البلازميد) وعادةً ما يشتمل على جين مفيد للبقاء ، مثل الجين المقاوم للمضادات الحيوية.

في المقابل ، عادة ما تكون البلازميدات المستخدمة في المختبر مصطنعة ومصممة لإدخال DNA غريب في خلية أخرى. الحد الأدنى ، يكون للبلازميدات التي تم إنشاؤها في المختبر أصل النسخ المتماثل وعلامة التحديد وموقع الاستنساخ. إن سهولة تعديل البلازميدات وقدرة البلازميدات على التكاثر الذاتي داخل الخلية تجعلها أدوات جذابة لعالم الحياة أو الهندسة الحيوية.

الشكل 1: خريطة للبلازميد بعناصره الموضحة أدناه.

عنصر ناقل وصف
أصل النسخ المتماثل (ORI) تسلسل الحمض النووي الذي يسمح ببدء النسخ المتماثل داخل البلازميد عن طريق تجنيد بروتينات آلية النسخ المتماثل
جين مقاومة المضادات الحيوية يسمح باختيار البكتيريا المحتوية على البلازميد.
موقع الاستنساخ المتعدد (MCS) قطعة قصيرة من الحمض النووي تحتوي على العديد من مواقع التقييد التي تسمح بإدخال الحمض النووي بسهولة. في التعبير البلازميدات ، غالبًا ما تكون MCS في اتجاه مجرى النهر من المروج.
إدراج يتم استنساخ الجين أو المحفز أو أي جزء آخر من الحمض النووي في MCS لمزيد من الدراسة.
منطقة المروج يدفع نسخ الجين المستهدف. المكون الحيوي لناقلات التعبير: يحدد أنواع الخلايا التي يتم التعبير عن الجين بها وكمية البروتين المؤتلف الذي تم الحصول عليه.
محدد قابل للتحديد يسمح الجين المقاوم للمضادات الحيوية باختيار البكتيريا. ومع ذلك ، فإن العديد من البلازميدات لديها أيضًا علامات مختارة لاستخدامها في أنواع الخلايا الأخرى.
موقع تجليد التمهيدي يستخدم تسلسل DNA قصير أحادي الخيط كنقطة بداية لتضخيم أو تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن استغلال الاشعال للتحقق من تسلسل البلازميدات.


تحضيرات البلازميد DNA الناجحة

على الرغم من أن محضرات DNA البلازميد يمكن أن تعيد أشكالًا متعددة من الحمض النووي ، إلا أن هناك نوعًا واحدًا فقط تريده للاستنساخ الناجح وترنسفكأيشن: supercoiled. تأكد من أنك تعرف كيفية زيادة استعادتك للحمض النووي الفائق الجودة عالي الجودة. هل ساعدك هذا في فهم سبب حصولك على ثلاث نطاقات عند تشغيل DNA البلازميد على مواد هلامية agarose؟ هل لديك أي نصائح أخرى لتحضير البلازميد؟ & # 8217d نحب أن نسمع في التعليقات.

نُشر في الأصل في 8 أكتوبر 2014. تمت المراجعة وإعادة النشر في أبريل 2021.


محتويات

المصطلح بلازميد تم تقديمه في عام 1952 من قبل عالم الأحياء الجزيئي الأمريكي جوشوا ليدربيرج للإشارة إلى "أي محدد وراثي خارج الكروموسومات". [4] اشتمل الاستخدام المبكر للمصطلح على أي مادة وراثية بكتيرية موجودة خارج الصبغية لجزء على الأقل من دورة تكرارها ، ولكن نظرًا لأن هذا الوصف يتضمن فيروسات بكتيرية ، فقد تم تنقيح فكرة البلازميد بمرور الوقت لتشمل العناصر الجينية التي تتكاثر بشكل مستقل. [5] في وقت لاحق في عام 1968 ، تقرر أن مصطلح البلازميد يجب أن يتم اعتماده كمصطلح للعنصر الجيني خارج الصبغيات ، [6] ولتمييزه عن الفيروسات ، تم تضييق التعريف على العناصر الجينية الموجودة حصريًا أو بشكل أساسي خارج الكروموسوم ويمكن أن يتكاثر بشكل مستقل. [5]

لكي تتكاثر البلازميدات بشكل مستقل داخل الخلية ، يجب أن تمتلك امتدادًا من الحمض النووي يمكن أن يكون بمثابة أصل للتكاثر. تسمى وحدة التكاثر الذاتي ، في هذه الحالة ، البلازميد ، بالبرليكون. قد يتكون الرليكون البكتيري النموذجي من عدد من العناصر ، مثل الجين الخاص ببروتين بدء النسخ المتماثل الخاص بالبلازميد (Rep) ، ووحدات متكررة تسمى iterons ، ومربعات DnaA ، ومنطقة غنية بـ AT مجاورة. [5] تستفيد البلازميدات الأصغر من الإنزيمات التكاثرية للمضيف لعمل نسخ من نفسها ، بينما قد تحمل البلازميدات الأكبر جينات مخصصة لتكرار تلك البلازميدات. يمكن أيضًا إدخال أنواع قليلة من البلازميدات في كروموسوم المضيف ، ويشار أحيانًا إلى هذه البلازميدات التكاملية باسم الحلقات في بدائيات النوى. [7]

تحمل البلازميدات دائمًا جينًا واحدًا على الأقل. العديد من الجينات التي يحملها البلازميد مفيدة للخلايا المضيفة ، على سبيل المثال: تمكين الخلية المضيفة من البقاء في بيئة قد تكون قاتلة أو مقيدة للنمو. تقوم بعض هذه الجينات بترميز سمات مقاومة المضادات الحيوية أو مقاومة المعادن الثقيلة ، بينما قد ينتج البعض الآخر عوامل ضراوة تمكن البكتيريا من استعمار مضيف والتغلب على دفاعاته أو أن يكون لها وظائف استقلابية محددة تسمح للبكتيريا باستخدام عنصر غذائي معين ، بما في ذلك: القدرة على تحطيم المركبات العضوية المتمردة أو السامة. [5] يمكن للبلازميدات أيضًا أن تزود البكتيريا بالقدرة على تثبيت النيتروجين. ومع ذلك ، فإن بعض البلازميدات ليس لها تأثير ملحوظ على النمط الظاهري للخلية المضيفة أو لا يمكن تحديد فائدتها للخلايا المضيفة ، وتسمى هذه البلازميدات البلازميدات الخفية. [8]

تختلف البلازميدات التي تتكون بشكل طبيعي اختلافًا كبيرًا في خواصها الفيزيائية. يمكن أن يتراوح حجمها من البلازميدات الصغيرة جدًا التي تقل عن أزواج من 1 كيلوباز (Kbp) إلى الميغابلازميدات الكبيرة جدًا من عدة أزواج ميغا بيس (Mbp). في الطرف العلوي ، يختلف القليل بين الضخم والكروموسوم الصغير. تكون البلازميدات دائرية بشكل عام ، لكن أمثلة البلازميدات الخطية معروفة أيضًا. تتطلب هذه البلازميدات الخطية آليات متخصصة لتكرار نهاياتها. [5]

قد توجد البلازميدات في خلية فردية بأعداد متفاوتة ، تتراوح من واحد إلى عدة مئات. يُطلق على العدد الطبيعي لنسخ البلازميد التي يمكن العثور عليها في خلية واحدة رقم نسخة البلازميد ، ويتم تحديده من خلال كيفية تنظيم بدء النسخ المتماثل وحجم الجزيء. تميل البلازميدات الأكبر حجمًا إلى امتلاك عدد نسخ أقل. [7] البلازميدات ذات عدد النسخ المنخفض التي توجد فقط كنسخة واحدة أو عدة نسخ في كل بكتيريا ، عند انقسام الخلية ، معرضة لخطر الضياع في إحدى البكتيريا المنفصلة. تحتوي هذه البلازميدات أحادية النسخة على أنظمة تحاول توزيع نسخة على كلتا الخلايا الوليدة بشكل فعال. غالبًا ما يشار إلى هذه الأنظمة ، التي تتضمن نظام parABS ونظام parMRC ، على أنها نظام التقسيم أو وظيفة التقسيم للبلازميد.

يمكن تصنيف البلازميدات بعدة طرق. يمكن تصنيف البلازميدات على نطاق واسع إلى بلازميدات مقترنة وبلازميدات غير مقترنة. تحتوي البلازميدات المقترنة على مجموعة من جينات النقل التي تعزز الاقتران الجنسي بين الخلايا المختلفة. [7] في عملية الاقتران المعقدة ، يمكن نقل البلازميدات من بكتيريا إلى أخرى عن طريق الجنس الشعري المشفر بواسطة بعض جينات النقل (انظر الشكل). [9] البلازميدات غير المقترنة غير قادرة على بدء الاقتران ، وبالتالي لا يمكن نقلها إلا بمساعدة البلازميدات المقترنة. فئة وسيطة من البلازميدات قابلة للتعبئة ، وتحمل فقط مجموعة فرعية من الجينات المطلوبة للنقل. يمكنهم تطفل بلازميد اقتران ، وينتقل بتردد عالٍ فقط في وجوده.

يمكن أيضًا تصنيف البلازميدات إلى مجموعات عدم توافق. يمكن للميكروب أن يأوي أنواعًا مختلفة من البلازميدات ، ولكن لا يمكن أن توجد البلازميدات المختلفة إلا في خلية بكتيرية واحدة إذا كانت متوافقة. إذا كان بلازميدان غير متوافقين ، فسيتم فقد أحدهما أو الآخر بسرعة من الخلية. لذلك يمكن تخصيص بلازميدات مختلفة لمجموعات عدم توافق مختلفة اعتمادًا على ما إذا كان بإمكانهم التعايش معًا. عادةً ما تشترك البلازميدات غير المتوافقة (التي تنتمي إلى نفس مجموعة عدم التوافق) في نفس آليات النسخ المتماثل أو التقسيم ، وبالتالي لا يمكن الاحتفاظ بها معًا في خلية واحدة. [10] [11]

هناك طريقة أخرى لتصنيف البلازميدات وهي الوظيفة. هناك خمس فئات رئيسية:

  • الخصوبة F- البلازميدات التي تحتوي على ترا الجينات. فهي قادرة على الاقتران وتؤدي إلى التعبير عن الجنس الشعري.
  • المقاومة (R) البلازميدات ، والتي تحتوي على الجينات التي توفر مقاومة ضد المضادات الحيوية أو السموم. تُعرف تاريخيًا باسم عوامل R ، قبل فهم طبيعة البلازميدات.
  • كولون بلازميدات ، التي تحتوي على جينات ترمز للبكتيريا ، وهي بروتينات يمكنها قتل البكتيريا الأخرى.
  • البلازميدات المتحللة ، والتي تمكن من هضم المواد غير العادية ، على سبيل المثال التولوين وحمض الساليسيليك.
  • ضراوة البلازميدات ، والتي تحول البكتيريا إلى ممرض. على سبيل المثال تي بلازميد في أغروباكتريوم توميفاسيانز

يمكن أن تنتمي البلازميدات إلى أكثر من واحدة من هذه المجموعات الوظيفية.

يمكن استخدام البلازميدات المصطنعة كناقلات في الهندسة الوراثية. تعمل هذه البلازميدات كأدوات مهمة في مختبرات علم الوراثة والتكنولوجيا الحيوية ، حيث يتم استخدامها بشكل شائع لاستنساخ وتضخيم (عمل العديد من النسخ) أو التعبير عن جينات معينة. [12] مجموعة متنوعة من البلازميدات متاحة تجارياً لمثل هذه الاستخدامات. عادةً ما يتم إدخال الجين المراد نسخه في البلازميد الذي يحتوي عادةً على عدد من الميزات لاستخدامها. يتضمن ذلك الجين الذي يمنح مقاومة لمضادات حيوية معينة (يتم استخدام الأمبيسلين بشكل متكرر للسلالات البكتيرية) ، وأصل النسخ المتماثل للسماح للخلايا البكتيرية بتكرار DNA البلازميد ، والموقع المناسب للاستنساخ (يشار إليه باسم موقع الاستنساخ المتعدد ).

يمكن تعريف عدم الاستقرار الهيكلي للحمض النووي على أنه سلسلة من الأحداث العفوية التي تبلغ ذروتها في إعادة ترتيب أو فقدان أو اكتساب مادة وراثية غير متوقعة. غالبًا ما يتم تشغيل مثل هذه الأحداث من خلال تبديل العناصر المتحركة أو عن طريق وجود عناصر غير مستقرة مثل الهياكل غير المتعارف عليها (غير B). قد تشارك مناطق الملحقات المتعلقة بالعمود الفقري البكتيري في مجموعة واسعة من ظواهر عدم الاستقرار الهيكلي. تشمل المحفزات المعروفة لعدم الاستقرار الجيني التكرارات المباشرة والمقلوبة والمترادفة ، والتي من المعروف أنها ظاهرة في عدد كبير من نواقل الاستنساخ والتعبير المتاحة تجاريًا. [13] يمكن أن تؤثر تسلسلات الإدراج بشدة أيضًا على وظيفة البلازميد والإنتاجية ، من خلال التسبب في عمليات الحذف وإعادة الترتيب أو التنشيط أو تقليل التنظيم أو تعطيل التعبير الجيني المجاور. [14] لذلك ، فإن التقليل أو الإزالة الكاملة لتسلسلات العمود الفقري الدخيلة غير المشفرة من شأنه أن يقلل بشكل واضح من الميل لحدوث مثل هذه الأحداث ، وبالتالي ، القدرة الكلية للتكوين المؤتلف للبلازميد. [15] [16]

تحرير الاستنساخ

تعد البلازميدات أكثر نواقل الاستنساخ الجرثومي شيوعًا. [17] تحتوي نواقل الاستنساخ هذه على موقع يسمح بإدخال أجزاء من الحمض النووي ، على سبيل المثال موقع استنساخ متعدد أو رابط متعدد يحتوي على عدة مواقع تقييد شائعة الاستخدام يمكن ربط أجزاء الحمض النووي بها. بعد إدخال الجين المعني ، يتم إدخال البلازميدات في البكتيريا من خلال عملية تسمى التحول. تحتوي هذه البلازميدات على علامة انتقائية ، عادة ما تكون جين مقاومة للمضادات الحيوية ، والتي تمنح البكتيريا القدرة على البقاء والتكاثر في وسط نمو انتقائي يحتوي على مضادات حيوية معينة. تتعرض الخلايا بعد التحول إلى الوسائط الانتقائية ، ويمكن فقط للخلايا التي تحتوي على البلازميد البقاء على قيد الحياة. بهذه الطريقة ، تعمل المضادات الحيوية كمرشح لانتقاء البكتيريا التي تحتوي على DNA البلازميد فقط. قد يحتوي الناقل أيضًا على جينات واصمة أخرى أو جينات مراسلة لتسهيل اختيار البلازميدات ذات الإدخالات المستنسخة. يمكن بعد ذلك زراعة البكتيريا المحتوية على البلازميد بكميات كبيرة ، وحصدها ، ويمكن بعد ذلك عزل البلازميد المعني باستخدام طرق مختلفة لإعداد البلازميد.

عادةً ما يتم استخدام ناقل استنساخ البلازميد لاستنساخ أجزاء من الحمض النووي تصل إلى 15 كيلو بايت في البوصة. [18] لاستنساخ أطوال أطول من الحمض النووي ، يتم استخدام فجوة لامدا مع الجينات اللايسوجينية المحذوفة ، أو الكوسميدات ، أو الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية ، أو الكروموسومات الاصطناعية للخميرة.

تحرير إنتاج البروتين

استخدام رئيسي آخر للبلازميدات هو إنتاج كميات كبيرة من البروتينات. في هذه الحالة ، يقوم الباحثون بزراعة بكتيريا تحتوي على بلازميد يؤوي الجين المعني. مثلما تنتج البكتيريا البروتينات لمنحها مقاومة للمضادات الحيوية ، يمكن أيضًا تحفيزها لإنتاج كميات كبيرة من البروتينات من الجين المُدخل. هذه طريقة رخيصة وسهلة لإنتاج كميات كبيرة من البروتين الذي يرمز إليه الجين ، على سبيل المثال ، الأنسولين.

العلاج الجيني تحرير

يمكن أيضًا استخدام البلازميدات في نقل الجينات كعلاج محتمل في العلاج الجيني بحيث يمكن التعبير عن البروتين الذي تفتقر إليه الخلايا. تتطلب بعض أشكال العلاج الجيني إدخال جينات علاجية في مواقع مستهدفة صبغية محددة مسبقًا داخل الجينوم البشري. نواقل البلازميد هي إحدى الطرق العديدة التي يمكن استخدامها لهذا الغرض. تقدم نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) طريقة للتسبب في كسر خيط مزدوج خاص بالموقع في جينوم الحمض النووي والتسبب في إعادة التركيب المتماثل. يمكن أن تساعد البلازميدات التي ترميز ZFN في توصيل الجين العلاجي إلى موقع معين بحيث يتم تجنب تلف الخلايا أو الطفرات المسببة للسرطان أو الاستجابة المناعية. [19]

نماذج المرض تحرير

تم استخدام البلازميدات تاريخياً في الهندسة الوراثية للخلايا الجذعية الجنينية للجرذان لإنشاء نماذج للأمراض الوراثية للجرذان. حالت الكفاءة المحدودة للتقنيات القائمة على البلازميد دون استخدامها في إنشاء نماذج خلايا بشرية أكثر دقة. ومع ذلك ، فإن التطورات في تقنيات إعادة التركيب الفيروسي المرتبط بالغدة ، ونوكلييز إصبع الزنك ، قد مكنت من إنشاء جيل جديد من نماذج الأمراض البشرية المتجانسة.

المصطلح الخلاصة قدمه فرانسوا جاكوب وإيلي وولمان في عام 1958 للإشارة إلى مادة وراثية كروموسومية إضافية قد تتكاثر بشكل مستقل أو تتكامل في الكروموسوم. [20] [21] منذ أن تم تقديم المصطلح ، تغير استخدامه ، مثل بلازميد أصبح المصطلح المفضل لتكرار الحمض النووي خارج الصبغيات بشكل مستقل. في ندوة عام 1968 في لندن اقترح بعض المشاركين هذا المصطلح الخلاصة يتم التخلي عنها ، على الرغم من استمرار الآخرين في استخدام المصطلح مع تحول في المعنى. [22] [23]

اليوم ، يستخدم بعض المؤلفين الخلاصة في سياق بدائيات النوى للإشارة إلى بلازميد قادر على الاندماج في الكروموسوم. يمكن تكرار البلازميدات التكاملية والحفاظ عليها بشكل ثابت في خلية عبر أجيال متعددة ، ولكن في مرحلة ما ، ستكون موجودة كجزيء بلازميد مستقل. [24] في سياق حقيقيات النوى ، المصطلح الخلاصة يستخدم ليعني جزيء DNA دائري مغلق خارج الصبغيات غير متكامل يمكن تكراره في النواة. [25] [26] الفيروسات هي أكثر الأمثلة شيوعًا على ذلك ، مثل فيروسات الهربس والفيروسات الغدية والفيروسات التورامية ، ولكن بعضها من البلازميدات. تشمل الأمثلة الأخرى شظايا الكروموسومات الشاذة ، مثل الكروموسومات المزدوجة الدقيقة ، التي يمكن أن تنشأ أثناء تضخيم الجينات الاصطناعية أو في العمليات المرضية (على سبيل المثال ، تحول الخلايا السرطانية). تتصرف الحلقات في حقيقيات النوى بشكل مشابه للبلازميدات في بدائيات النوى حيث يتم الحفاظ على الحمض النووي بشكل ثابت وتكراره مع الخلية المضيفة. يمكن أن تحدث النوبات الفيروسية السيتوبلازمية (كما هو الحال في عدوى فيروس الجدري). تتكاثر بعض الحلقات ، مثل فيروسات الهربس ، في آلية دائرة دائرية ، على غرار فيروسات العاثية البكتيرية. يتكاثر الآخرون من خلال آلية النسخ ثنائية الاتجاه (نوع ثيتا البلازميدات). في كلتا الحالتين ، تظل الحلقات منفصلة جسديًا عن كروموسومات الخلية المضيفة. يتم الاحتفاظ بالعديد من فيروسات السرطان ، بما في ذلك فيروس إبشتاين بار وفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوزي ، كحلقات كامنة ومتميزة كروموسوميًا في الخلايا السرطانية ، حيث تعبر الفيروسات عن الجينات الورمية التي تعزز تكاثر الخلايا السرطانية. في السرطانات ، تتكاثر هذه الحلقات بشكل سلبي مع الكروموسومات المضيفة عندما تنقسم الخلية. عندما تبدأ هذه الحلقات الفيروسية في التكاثر التحليلي لتوليد جزيئات فيروسية متعددة ، فإنها تنشط عمومًا آليات دفاع المناعة الخلوية الفطرية التي تقتل الخلية المضيفة.

تشتمل بعض البلازميدات أو المضيفات الميكروبية على نظام إدمان أو نظام قتل ما بعد الفصل (PSK) ، مثل نظام هوك / سوك (قتل المضيف / القاتل للقتل) للبلازميد R1 في الإشريكية القولونية. [27] ينتج هذا النوع سمًا طويل العمر وترياقًا قصير العمر. تم وصف عدة أنواع من أنظمة إدمان البلازميد (التوكسين / مضادات السموم ، الأنظمة القائمة على الأيض ، ORT) في الأدبيات [28] واستخدمت في تطبيقات التقنية الحيوية (التخمير) أو الطب الحيوي (العلاج باللقاح). تعيش خلايا الابنة التي تحتفظ بنسخة من البلازميد على قيد الحياة ، بينما تموت الخلية الوليدة التي تفشل في وراثة البلازميد أو تعاني من انخفاض معدل النمو بسبب السم العالق من الخلية الأم. أخيرًا ، يمكن تحسين الإنتاجية الإجمالية.

على النقيض من ذلك ، فإن البلازميدات المستخدمة في التكنولوجيا الحيوية ، مثل pUC18 و pBR322 والنواقل المشتقة ، نادراً ما تحتوي على أنظمة إدمان مضادات السموم ، وبالتالي تحتاج إلى الاحتفاظ بها تحت ضغط المضادات الحيوية لتجنب فقدان البلازميد.

تحتوي الخمائر بشكل طبيعي على أنواع مختلفة من البلازميدات. من أبرزها 2 ميكرومتر بلازميدات - بلازميدات دائرية صغيرة غالبًا ما تستخدم في الهندسة الوراثية للخميرة - وبلازميدات pGKL الخطية من Kluyveromyces lactis، المسؤولة عن الأنماط الظاهرية القاتلة. [29]

غالبًا ما ترتبط أنواع أخرى من البلازميدات بنواقل استنساخ الخميرة التي تشمل:

  • بلازميد الخميرة التكاملي (YIp)، نواقل الخميرة التي تعتمد على الاندماج في الكروموسوم المضيف للبقاء والتكاثر ، وعادة ما تستخدم عند دراسة وظيفة الجين المنفرد أو عندما يكون الجين سامًا. يرتبط أيضًا بالجين URA3 ، الذي يرمز إلى إنزيم مرتبط بالتخليق الحيوي للنيوكليوتيدات البيريميدين (T ، C)
  • الخميرة البلازميد المكرر (YRp)، التي تنقل سلسلة من الحمض النووي الصبغي يتضمن أصل النسخ المتماثل. هذه البلازميدات أقل استقرارًا ، حيث يمكن أن تفقد أثناء التبرعم.

غالبًا ما تُستخدم البلازميدات لتنقية تسلسل معين ، حيث يمكن تنقيتها بسهولة بعيدًا عن بقية الجينوم. لاستخدامها كناقلات ، وللاستنساخ الجزيئي ، غالبًا ما تحتاج البلازميدات إلى العزل.

هناك عدة طرق لعزل DNA البلازميد من البكتيريا ، تتراوح من miniprep إلى maxiprep أو Bulprep. [12] يمكن استخدام النوع الأول لمعرفة ما إذا كان البلازميد صحيحًا في أي من النسخ البكتيرية العديدة. المحصول عبارة عن كمية صغيرة من DNA البلازميد غير النقي ، وهو ما يكفي للتحليل عن طريق الهضم المقيد وللبعض تقنيات الاستنساخ.

في الأخير ، تزرع كميات أكبر بكثير من المعلق البكتيري الذي يمكن من خلاله إجراء إعداد ماكسي. في الأساس ، هذا هو miniprep موسع يتبعه تنقية إضافية. ينتج عن هذا كميات كبيرة نسبيًا (عدة مئات من الميكروغرام) من DNA البلازميد النقي جدًا.

تم إنشاء العديد من المجموعات التجارية لأداء استخراج البلازميد بمقاييس ونقاء ومستويات مختلفة من الأتمتة.

قد يظهر DNA البلازميد في واحد من خمسة مطابقة ، والتي (لحجم معين) تعمل بسرعات مختلفة في هلام أثناء الرحلان الكهربائي. يتم سرد المطابقات أدناه بترتيب التنقل الكهربي (السرعة لجهد معين مطبق) من الأبطأ إلى الأسرع:

  • مصقول دائري مفتوح يحتوي الحمض النووي على قطع خيط واحد.
  • دائري مريح الحمض النووي سليم تمامًا مع عدم قطع كلا الخيطين ولكنه كان إنزيميًا استرخاء (تمت إزالة الملفات الفائقة). يمكن نمذجة ذلك عن طريق ترك سلك التمديد الملتوي يسترخي ويسترخي ثم توصيله بنفسه.
  • خطي يحتوي الحمض النووي على نهايات حرة ، إما بسبب قطع الخيطين أو لأن الحمض النووي كان خطيًا في الجسم الحي. يمكن نمذجة ذلك باستخدام سلك تمديد كهربائي غير متصل بنفسه.
  • ملفوف (أو التعميم التساهمي مغلق) الحمض النووي سليم تمامًا مع عدم تقطيع كل من الخيوط ، وبتواء متكامل ، مما ينتج عنه شكل مضغوط. يمكن نمذجة ذلك عن طريق لف سلك تمديد ثم توصيله بنفسه.
  • فائق الالتواء تشوه الحمض النووي مثل الحمض النووي فائق الالتواء، ولكن بها مناطق غير متزاوجة تجعلها أقل ضغطًا قليلاً ، وهذا يمكن أن ينتج عن القلوية المفرطة أثناء تحضير البلازميد.

معدل الهجرة للشظايا الخطية الصغيرة يتناسب طرديا مع الجهد المطبق عند الفولتية المنخفضة. عند الفولتية العالية ، تهاجر الأجزاء الأكبر بمعدلات متزايدة باستمرار. وبالتالي ، فإن دقة الهلام تتناقص مع زيادة الجهد.

عند الجهد المنخفض المحدد ، فإن معدل ترحيل أجزاء DNA الخطية الصغيرة هو دالة على طولها. تهاجر الأجزاء الخطية الكبيرة (أكثر من 20 كيلو بايت أو نحو ذلك) بمعدل ثابت معين بغض النظر عن الطول. وذلك لأن الجزيئات "تقاوم" ، حيث يتبع الجزء الأكبر من الجزيء الطرف الأمامي عبر مصفوفة الهلام. كثيرا ما تستخدم هضم التقييد لتحليل البلازميدات المنقاة. تعمل هذه الإنزيمات على تحطيم الحمض النووي على وجه التحديد في تسلسلات قصيرة معينة. تشكل الأجزاء الخطية الناتجة "نطاقات" بعد الرحلان الكهربائي للهلام. من الممكن تنقية شظايا معينة عن طريق قطع العصابات من الهلام وإذابة الهلام لتحرير شظايا الحمض النووي.

نظرًا لتشكيله الضيق ، ينتقل الحمض النووي الفائق الالتفاف عبر مادة هلامية بشكل أسرع من الحمض النووي الخطي أو الدائري المفتوح.

يتم دعم استخدام البلازميدات كتقنية في البيولوجيا الجزيئية بواسطة برنامج المعلوماتية الحيوية. تسجل هذه البرامج تسلسل الحمض النووي لناقلات البلازميد ، وتساعد على التنبؤ بالمواقع المقطوعة لأنزيمات التقييد ، وتخطيط التلاعب. أمثلة على حزم البرامج التي تتعامل مع خرائط البلازميد هي ApE و Clone Manager و GeneConstructionKit و Geneious و Genome Compiler و LabGenius و Lasergene و MacVector و pDraw32 و Serial Cloner و VectorFriends و Vector NTI و WebDSV. تساعد هذه القطع من البرامج في إجراء تجارب كاملة في السيليكو قبل إجراء تجارب رطبة. [30]

تم إنشاء العديد من البلازميدات على مر السنين وقام الباحثون بإعطاء البلازميدات لقواعد بيانات البلازميد مثل المنظمات غير الربحية Addgene و BCCM / LMBP. يمكن للمرء أن يجد ويطلب البلازميدات من قواعد البيانات هذه للبحث. يقوم الباحثون أيضًا في كثير من الأحيان بتحميل متواليات البلازميد إلى قاعدة بيانات NCBI ، والتي يمكن من خلالها استرجاع تسلسلات من البلازميدات المحددة.


لقاحات السرطان العلاجية

تشونكينج قوه و. Xiang-Yang Wang، in Advances in Cancer Research، 2013

5.1 لقاحات الحمض النووي

لقاحات الدنا هي بلازميدات بكتيرية تم إنشاؤها لتعمل كنظام مكوك لتوصيل مستضد الورم والتعبير عنه (ببتيدات كاملة الطول وقصيرة) لتوليد مناعة خلوية وخلطية مستهدفة (ليو ، 2011). عادة ما يتم تحريك الجين المحول بواسطة المروج الفوري المبكر للفيروس المضخم للخلايا وتسلسل intron A المجاور لضمان كفاءة النسخ. يمكن تحقيق التعبير المرتفع للمستضد المشفر عن طريق تحسين استخدام الكودون ، مثل استبدال الكودونات بـ tRNA نادر (ستراتفورد وآخرون ، 2000). يعمل العمود الفقري للحمض النووي البكتيري نفسه باعتباره PAMPs لتحفيز تنشيط الخلايا المناعية من خلال TLRs أو جزيئات التعرف على الأنماط الفطرية (Barber ، 2011 Beutler et al. ، 2006 Spies et al. ، 2003).

القدرة على دمج جينات متعددة في الناقل تخلق فرصًا لتعديل التوجيه داخل الخلايا وتعديل المستضدات وكذلك النتيجة المناعية اللاحقة. أدت إضافة تسلسل قائد يستهدف المستضدات إلى ER إلى استجابة خلطية (Walter & amp Johnson ، 1994) وأيضًا تسهيل توليد استجابات خلايا CD8 + T ، ربما بسبب النقل الرجعي للمستضد من ER إلى العصارة الخلوية والتسليم المباشر للحمض النووي إلى APC في موقع التحصين (Rice، Ottensmeier، & amp Stevenson، 2008). يؤدي دمج السلسلة المفردة Fv من الغلوبولين المناعي الغريب إلى الجزء C المشتق من ذيفان الكزاز في لقاحات الحمض النووي إلى تنشيط الخلايا المساعدة CD4 + T الخاصة بالجزء C ، والتي تسهل الخلايا المضادة لـ Id B لإنتاج مستويات عالية من الأجسام المضادة لـ Id من أجل الحماية المناعية ضد سرطان الغدد الليمفاوية (King et al. ، 1998 Spellerberg et al. ، 1997).

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج لقاحات الدنا بشكل عقلاني مع عوامل أخرى منبهات المناعة ، مثل ناهضات TLR ، لتحسين استجابات الجسم المضاد. لقاح سرطان الحمض النووي الذي يستهدف HER-2 / Neu أو CEA ، عند استخدامه بالاقتران مع IMO ناهض TLR9 جديد (Aurisicchio et al. ، 2009) ، أو ناهض TLR7 SM360320 (Dharmapuri et al. ، 2009) أدى إلى زيادة عيار الأجسام المضادة و نشاط السمية الخلوية المعتمد على الأجسام المضادة ، والذي أدى إلى تحسين السيطرة على سرطان الثدي الإيجابي HER-2 أو سرطان القولون الإيجابي CEA في نماذج الفئران. في بيئة علاجية ، يتآزر التحصين النشط بلقاح HER-2 / Neu DNA مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ HER-2 / Neu لتعزيز تثبيط أورام الثدي الموجودة في الفئران (أورلاندي وآخرون ، 2011).

يظل تحقيق استجابة فعالة ودائمة CTL هو الهدف النهائي للقاحات السرطان. يساعد توليد خلايا CD4 + T عبر مسار يعتمد على MHC من الفئة الثانية وهو أمر مهم لتضخيم استجابات خلايا CD8 + T والحفاظ على الذاكرة أثناء تلقيح الحمض النووي (Maecker و Umetsu و DeKruyff و amp Levy ، 1998). نظرًا لضعف المناعة الذاتية لـ TAAs ، اندماج TAAs مع المستضدات أو الجزيئات غير الذاتية ، مثل بروتين غلاف الفيروس X (Savelyeva ، Munday ، Spellerberg ، Lomonossoff ، & amp Stevenson ، 2001) ، GFP (Wolkers ، Toebes ، Okabe ، Haanen ، & amp Schumacher ، 2002) ، يمكن للجزء المعدل C من ذيفان الكزاز (Rice، Buchan، & amp Stevenson، 2002 Rice et al.، 2006 Rice، Elliott، Buchan، & amp Stevenson، 2001) توفير إشارات T المساعدة إلى CTLs ، مما يؤدي إلى تحسين عرض متقاطع لـ TAAs والمناعة المضادة للأورام ضد العديد من أورام الفئران. لقاحات الحمض النووي التي تم تصميمها لاستهداف مستضدات الورم لجزيئات B7 المخصّصة للتكلفة على ناقلات الخلايا المُقدّمة عن طريق دمج المجال خارج الخلية من CTLA-4 إلى الاستجابات المناعية الخلطية والخلوية المستحثة HER-2 / Neu ، والتي أخرت ظهور HER-2 / الثدي الذي يحركه Neu السرطان (سلوتس وآخرون ، 2008).

تم اختبار لقاحات الحمض النووي أيضًا من أجل الاستهداف المناعي للخلايا البطانية المستقرة والمتكاثرة في الأوعية الدموية للورم. عزز لقاح الحمض النووي مع الكاسيت التعبير عن مستقبل عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) 2 (FLK-1) قتل الخلايا البطانية بوساطة CTL ، مما أدى إلى فعالية علاجية قوية ضد العديد من أورام الفئران (سرطان الجلد وسرطان القولون وسرطان الرئة) والحد من انتشار النقائل الرئوية (نيتهامر وآخرون ، 2002). تناول لقاح الحمض النووي عن طريق الفم والذي يشفر الواسم البطاني للورم البشري 8 قمع بشكل فعال تكوّن الأوعية الورمية وحماية الفئران من التحدي اللاحق بجرعة قاتلة من الخلايا السرطانية (Ruan et al. ، 2009). الفئران المحصنة بلقاح الحمض النووي الذي يشفر فيروس الورم الحليمي البشري من النوع 16 E7 المدمج مع CRT طورت استجابة خلايا CD8 + T قوية خاصة بالورم وأظهرت أيضًا انخفاضًا كبيرًا في كثافة الأوعية الدقيقة في عقيدات ورم الرئة ، مما يشير إلى أن التأثير المضاد للورم المعزز ينطوي على ضعف هجوم بوساطة مناعية لكل من الخلايا السرطانية والخلايا البطانية (Cheng et al. ، 2001). كما أدت طرق لقاح الدنا الأخرى التي تستهدف مستقبل الأنجيوستاتين أنجيوموتين إلى زيادة الحصار المناعي بوساطة تكوين الأوعية وتثبيط الورم. ومن المثير للاهتمام ، أن زيادة نفاذية الأوعية الورمية بعد تلقيح الحمض النووي قد عززت التأثير المضاد للورم لعامل العلاج الكيميائي ، دوكسوروبيسين (Arigoni et al. ، 2012 Holmgren et al. ، 2006).

على الرغم من أن منصات لقاح الحمض النووي قد أظهرت نتائج واعدة في الدراسات قبل السريرية (Xiang، Luo، Niethammer، & amp Reisfeld، 2008) ، إلا أنها تفشل في الترجمة من الفئران والجرذان إلى الرئيسيات والبشر من غير البشر (Liu & amp Ulmer، 2005 Rice et al.، 2008). تواجه لقاحات الحمض النووي عقبة الترجمة إلى العيادة بسبب مشاكل الفعالية وليس السمية. ومع ذلك ، قد تعزز التركيبات وأساليب الإدارة الجديدة فائدتها. بالإضافة إلى الحقن تحت الجلد أو داخل الأدمة ، يمكن حقن لقاحات الحمض النووي مباشرة في العقد الليمفاوية لزيادة امتصاص المستضد من قبل APCs وتعزيز الإشارات الالتهابية المحلية. يتم اختبار هذا حاليًا في تجارب المرحلة الأولى / الثانية للورم الميلاني وأنواع السرطان الأخرى (Ribas et al. ، 2011 Weber et al. ، 2011). تم استخدام مناهج أو طرائق ناقل أخرى ، بما في ذلك مسدس الجينات ، والتثقيب الكهربائي ، والموجات فوق الصوتية ، والليزر ، والجسيمات الشحمية ، والجسيمات الدقيقة ، والجسيمات النانوية ، لتعزيز التعبير عن المستضد وفعالية لقاح الحمض النووي (Bins et al. ، 2005 Buchan et al. ، 2005 Dupuis et al. . ، 2000 Greenland & amp ؛ ليتفين ، 2007).


هل [كدنا] مفردة أو مزدوجة تقطعت بهم السبل؟ - (فبراير / 09/2006)

قرأت في مكان ما شيئًا حيرني بشأن (كدنا). & # 39d أود أن أعرف ما إذا كان [كدنا] مزدوج تقطعت بهم السبل أم واحد تقطعت بهم السبل؟

أعلم أن cDNA هي نسخة من mRNA عن طريق النسخ العكسي ، لذا ، من الناحية النظرية ، سيكون خطأ واحدًا تقطعت به السبل ، صحيح أم أنا & # 39m خطأ؟

لقد نشرت سؤالي في مكان آخر ولكن لم أجد & # 39t إجابة ، وأود & # 39d أن أنشره هنا ، وآسف يبدو هذا السؤال غبيًا ، لأنني & # 39m في حيرة من أمري & # 33

قرأت في مكان ما شيئًا حيرني بشأن (كدنا). & # 39d أود أن أعرف ما إذا كان [كدنا] مزدوج تقطعت بهم السبل أم واحد تقطعت بهم السبل؟

أعلم أن cDNA هي نسخة من mRNA عن طريق النسخ العكسي ، لذا ، من الناحية النظرية ، سيكون خطأ واحدًا تقطعت به السبل ، صحيح أم أنا & # 39m خطأ؟

بالنسبة لمعظم الحالات ، مثل RT-PCR ، أو 3 & # 39 أو 5 & # 39 RACE ، فإننا نستخدم فقط cDNA واحد الذين تقطعت بهم السبل (أول حبلا cDNA) ، بينما في حالة إعداد cDNA لبناء المكتبة ، أو تحليل RDA / SSH الذي قد تحتاج إلى خطوة تركيب حبلا ثانية إضافية لتوليد حبلا مزدوج (كدنا).

أهلا
عليك أن تفرق بين شيئين:

cDNA بشكل عام هو جزيء DNA المقابل تقريبًا لسلسلة mRNA. لذلك فهو جزيء مزدوج تقطعت به السبل متضمن في البلازميد للتعبير في معظم الحالات.

RT PCR: يتم نسخ جزيء mRNA عكسيًا في حبلا أحادي cDNA. بعد هذه النقطة ، يزيل RNase جزيء mRNA وتحصل على جزيء cDNA واحد تقطعت به السبل. نظرًا لأن الخطوة التالية هي PCR الكلاسيكية تمامًا ، فإن الخيط الفردي مناسب لـ exp (والخطوة الأولى ، التي تتوافق مع تكوين الخيط الثاني المتوافق لجزيء DNA ، يعيد جزيء cDNA الحقيقي.

لكي نكون على حق ، cDNA عبارة عن جزيء مزدوج تقطعت به السبل ، ولكن للراحة ، يتم استخدام cDNA أيضًا لتصميم جزيء النسخ العكسي لـ RTPCR. يجب أن يطلق عليه نصف (كدنا) أو حبلا واحد (كدنا).
cDNA هو اسم اختصار.

بينما في معظم الحالات ، يتم تعريف cDNA ، وهو اختصار لـ DNA التكميلي ، على أنه جزيء DNA أحادي السلسلة مع تسلسل نيوكليوتيد مكمل لجزيء RNA ، ويتم تصنيعه في المختبر من mRNA عن طريق النسخ العكسي.

إذاً ، (كدنا) هو واحد تقطعت به السبل حتى يتم تنفيذ تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ حسنًا ، في هذه الحالة ، كيف يولد Taq DNA Polymerase سلسلة تكميلية ثانية من واحدة فقط؟ عندما يصلب البادران على كل جانب من نفس الخصلة ، كيف يمكنهما إنتاج الخيط الثاني (التكميلي الجديد)؟

في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يرتبط أحد المواد الأولية بقطعة واحدة من الحمض النووي (وهذا هو السبب في أن الخطوة الأولى هي دائمًا تسنين عند 94 درجة مئوية (أو نحو ذلك) لفصل أي جزيئات مزدوجة مجدولة إلى خيوط مفردة. تفاعل RT يرتبط فقط بتمهيدي واحد في الجولة الأولى. وهذا يعني أن الجولة الأولى من التضخيم في RT-PCR ليست لوغاريتمية ، يمكنك ببساطة تجميع الخيط الثاني من cDNA. في الجولات اللاحقة (الجولة 2 إلى الجولة n) هناك تضخيم لوغريتمي لأن كلا من البادئات الأمامية والخلفية ترتبط بالقالب المزدوج الذي تقطعت به السبل.

في الجولة الأولى ، أعتقد أن التمهيدي الأمامي هو الذي يرتبط. أعتقد أن هذا بسبب mRNA = حبلا أماميًا في الجينوم وأول حبلا cDNA = مكمل لـ mRNA (أو هو نفس الخيط العكسي في الجينوم)

شخص ما يتحقق من منطقتي هنا ، أنا أربك نفسي. هل هذا صحيح أن الرنا المرسال هو مكمل للخيط العكسي للحمض النووي الجينومي ؟؟
مثال: تسلسل مرنا = حبلا للأمام = 5 & # 39-3 & # 39 تسلسل في جدنا (فقط مع U وليس T).

شكرا للجميع ، الأمر أكثر وضوحا بالنسبة لي الآن.

شخص ما يتحقق من منطقتي هنا ، أنا أربك نفسي. هل هذا صحيح أن الرنا المرسال هو مكمل للخيط العكسي للحمض النووي الجينومي ؟؟
مثال: تسلسل مرنا = حبلا للأمام = 5 & # 39-3 & # 39 تسلسل في جدنا (فقط مع U وليس T).

أعتقد ذلك ، نعم ، حتى يتم العثور على intron ، أليس كذلك؟
يمكننا التحقق من أي من تسلسلات mRNA المعروفة في NCBI ، واستعادة الضربة الجينية ومقارنة التسلسلات لمعرفة ما إذا كانت صحيحة أم لا.

نعم ، هذا صحيح ، عليك & # 39d تخطي الإنترونات

يبدو أن طريقة جيدة للاختبار ستحاول لاحقًا إذا سنحت لي الفرصة وأخبرتك بذلك. كلما فكرت في الأمر أكثر ، تسلسل mRNA = تسلسل حبلا للأمام يجب أن يكون صحيحًا.


البلازميدات في البكتيريا: الخصائص والأنواع والتكاثر

يتم تعريف البلازميدات على أنها عناصر وراثية كروموسومية إضافية ، تحدث بشكل رئيسي في البكتيريا ونادرًا في الكائنات حقيقية النواة. في البكتيريا ، البلازميدات عبارة عن جزيئات DNA دائرية مزدوجة الشريطة تحتوي على جينات تتحكم في مجموعة متنوعة من الوظائف. في الخميرة (Saccharomyces cerevisiae) تم العثور على بلازميد RNA.

البلازميدات هي عناصر ذاتية التكاثر ، ومع ذلك فهي تعتمد إلى حد كبير على الخلية المضيفة لتكاثرها ، لأنها تستخدم آلية تكرار الخلية المضيفة. كان أول بلازميد تم اكتشافه هو عامل الجنس أو البلازميد F (يشير F للخصوبة) للإشريكية القولونية K12. يمنح هذا البلازميد القدرة لخلية الإشريكية القولونية (F +) على الاقتران مع خلية أخرى تفتقر إلى هذا البلازميد (الخلية P). يمكن أن يوجد البلازميد F في حالتين بديلتين ، أي. يمكن أن تظل حرة في الخلية أو يمكن دمجها في كروموسوم الإشريكية القولونية. تُعرف البلازميدات بمثل هذه الخاصية باسم الحلقات.

بشكل عام ، يبلغ حجم البلازميدات البكتيرية 1 إلى 5٪ من الحمض النووي الصبغي. تختلف البلازميدات بشكل كبير في الحجم. البلازميدات الأصغر لها أوزان جزيئية تتراوح بين 4 إلى 5 × 10 6 دالتون ، في حين أن الأكبر منها لها أوزان جزيئية من 25 إلى 95 × 10 6 دالتون.

لا تختلف البلازميدات في الحجم فحسب ، بل تختلف أيضًا في عدد النسخ التي تشير إلى عدد نسخ بلازميد معين في الخلية. عدد النسخ متغير بشكل متقطع ، أي أن بعض البلازميدات عمومًا الأصغر منها - لها عدد نسخ مرتفع ، في حين أن البلازميدات الأكبر لها عدد نسخ منخفض بشكل مميز. تُعرف تلك التي لديها عدد نسخ مرتفع بالبلازميدات المسترخية وتلك التي لديها عدد نسخ منخفض تسمى البلازميدات الصارمة.

مهما كان رقم النسخ ، يتم توزيع البلازميدات بشكل عام بالتساوي في الخلية الوليدة أثناء انقسام الخلية. نادرًا ما تنشأ خلية خالية من البلازميد تلقائيًا بتردد حوالي 1 من 10 4 خلايا. يمكن أيضًا إنتاج الخلايا الخالية من البلازميد بشكل مصطنع باستخدام المطفرات.

تسمى هذه العملية عادة بعلاج البلازميدات. عادةً ما يكون للبلازميدات الكبيرة ذات العدد المنخفض نسخة أو نسختان لكل خلية ويكون علاجها أسهل. في المقابل ، قد تحتوي البلازميدات الأصغر على 10 إلى 100 نسخة لكل خلية.

بقدر ما يتعلق الأمر بالوظائف البيولوجية للبلازميدات ، فهي ليست مكونات لا غنى عنها للبكتيريا. ثبت ذلك من خلال حقيقة أن البكتيريا المعالجة من البلازميدات يمكن أن تنمو بشكل طبيعي دون أي صعوبة. ومع ذلك ، فإن الجينات المحمولة على DNA البلازميد تمنح خصائص خاصة للبكتيريا المضيفة وقد تصبح هذه الخصائص مفيدة في ظل ظروف بيئية خاصة.

على سبيل المثال ، يمكن أن تعيش البكتيريا الحاملة للبلازميدات R (بلازميدات المقاومة) عندما تحتوي البيئة على تركيزات مثبطة لمضاد حيوي واحد أو أكثر. من الواضح أن البكتيريا التي لا تحتوي على بلازميد R يتم تدميرها في ظل هذه الظروف.

مثال آخر يتم تقديمه من خلال بلازميدات بعض أنواع Pseudomonas التي تحمل جينات لإنتاج الإنزيمات التي تحفز تحلل الهيدروكربونات المعقدة. البكتيريا التي تحمل مثل هذه البلازميدات قادرة على استخدام مثل هذه الركائز غير العادية للنمو ، ومن الواضح أنها تتمتع بميزة خاصة على الآخرين الذين يفتقرون إليها.

يمنح البلازميد F القدرة على إجراء نوع من التكاثر الجنسي للبكتيريا مما يجعل من الممكن تبادل المواد الجينية التي تؤدي إلى إعادة التركيب الجيني. مرة أخرى ، تنتج بعض البكتيريا ، مثل E. coli و Pseudomonas و Lactobacillus وما إلى ذلك ، نوعًا خاصًا من البروتينات تسمى بكتريوسينات يتم ترميزها بواسطة جينات البلازميد. هذه البروتينات قادرة على قتل البكتيريا الأخرى وثيقة الصلة ، وبالتالي يمكنها القضاء على المنافسة على الطعام والفضاء.

وبالتالي ، يُرى أنه على الرغم من أن البلازميدات ليست ضرورية تمامًا لحياة البكتيريا في ظل ظروف النمو الطبيعية ، فقد يصبح وجودها ذا قيمة ومفيدة للمضيف في ظل ظروف خاصة ، أو قد يكون أمرًا ضروريًا للبقاء على قيد الحياة كما في حالة R البلازميدات. تنتج البلازميدات R بمساعدة جينات المقاومة بروتينات يمكنها تعطيل أو تدمير مضادات حيوية معينة.

إلى جانب الخصائص المفيدة التي تعزى إلى البلازميدات ، لعبت هذه العناصر الوراثية الإضافية الصبغية دورًا مهمًا في تطوير تقنية الحمض النووي المؤتلف.في هذه التقنية ، تُستخدم البلازميدات كناقلات لنقل الجين المعني من كائن حي إلى كائن حي آخر. مثل هذا النقل للجين ممكن ، ليس فقط من بكتيريا إلى أخرى ، ولكن أيضًا من كائن حقيقي النواة إلى بكتيريا ، أو العكس.

يتم عزل جزء من الحمض النووي يحتوي على الجين المحدد من متبرع مناسب ويتم إدخاله بواسطة تقنية DNA المؤتلف في البلازميد. يتم إدخال البلازميد المؤتلف بعد ذلك في خلية مضيفة مناسبة حيث يتم التعبير عن الجين لإنتاج منتج الجين.

بهذه الطريقة ، تم إدخال العديد من الجينات البشرية المنتجة لبروتينات مهمة علاجياً إلى البكتيريا. أيضًا ، تم نقل بعض الجينات البكتيرية إلى مضيفات حقيقية النواة ، مثل النباتات ، وتم نقل بعض الجينات الفيروسية إلى الخمائر. في معظم عمليات نقل الجينات هذه ، تلعب البلازميدات دورًا رئيسيًا كنواقل أو ناقلات.

أنواع البلازميدات:

(ط) إف بلازميد:

يحدد F-plasmid ، المعروف أيضًا باسم عامل الخصوبة أو عامل الجنس ، جنس بكتيريا E. coli. تم تحديد الخلايا التي تحتوي على هذا البلازميد على أنها F + وتلك التي لا تحتوي عليها كـ F & # 8211. تعتبر بكتيريا F + ذكورًا ، لأنها يمكن أن تعمل كمتبرع ليس فقط للبلازميد ، ولكن أيضًا للجينات الصبغية لخلايا F & # 8211 التي تعمل كمتلقي وبالتالي تعتبر أنثى.

تتم عملية النقل عن طريق اقتران الخلية F + بالخلية F & # 8211. البلازميد F هو بلازميد اقتران.

نحن نعلم أن السمة المميزة للبلازميد F هي أنه يمكن أن يبقى إما ككيان مستقل يتكاثر بشكل منفصل مع الحمض النووي الصبغي ، أو يمكن إدخاله في الكروموسوم كجزء لا يتجزأ منه. عندما يتم دمج البلازميد F في كروموسوم الإشريكية القولونية ، تتغير الخلية البكتيرية من P إلى سلالة Hfr (تردد عالي لإعادة التركيب).

هناك العديد من المواقع على كروموسوم الإشريكية القولونية حيث يمكن دمج البلازميد إف. اعتمادًا على الموقع ، يؤدي كل تكامل إلى ظهور سلالة Hfr مختلفة. في الاقتران F + x F & # 8211 ، ينتقل البلازميد وحده ، ولكن في اقتران Hfr x F & # 8211 ، تنتقل الجينات الصبغية ونادرًا ما تنتقل أيضًا البلازميد F.

البلازميد F هو بلازميد كبير قابل للانتقال ذاتيًا له جزيء DNA دائري مزدوج الشريطة. يبلغ وزنه الجزيئي 63 × 10 6 دالتون ويحتوي على جينات تتحكم في نقل البلازميد من المتبرع إلى المتلقي. تؤدي الطفرة في أي من الجينات الأساسية إلى فقدان قابلية انتقال البلازميد.

تمامًا كما يمكن دمج البلازميد F في كروموسوم الخلية المضيفة ، لذلك يمكن في حالات نادرة ، فصله أو استئصاله من كروموسوم الإشريكية القولونية في الحالة الحرة لتشكيل البلازميد الدائري. لقد لوحظ أن عملية الاستئصال تكون في بعض الأحيان غير كاملة بمعنى أن بعض أجزاء كروموسوم الإشريكية القولونية المجاورة لبلازميد F الذي تم إدخاله خطيًا يتم تضمينها في F-DNA المستأصل وفي نفس الوقت ، أجزاء من DNA البلازميد هي المحتجزة في كروموسوم الإشريكية القولونية.

تم تصنيف البلازميدات F التي تحتوي على أجزاء من الحمض النووي الكروموسومي على أنها بلازميدات F & # 8217. عندما يفقد البلازميد F بعض جيناته الأساسية أثناء عملية الاستئصال ، يصبح البلازميد غير قادر على الوجود المستقل ويتم التخلص منه في النهاية أثناء انقسام الخلية.

عندما ينتقل البلازميد F عن طريق الاقتران إلى مستقبل F ، فإنه يمكن أن ينقل الجينات الصبغية التي يحملها. وبالتالي ، يصبح المتلقي ثنائي الصبغة فيما يتعلق بهذه الجينات المنقولة (لأنه يحتوي الآن على نسخة واحدة خاصة به ونسخة أخرى من نفس الجين تنتقل بواسطة البلازميد F). وبالتالي ، قد يحدث تبادل الجينات الصبغية من خلال البلازميدات F & # 8217. وقد تم وصف هذا بالتمثيل الجنسي.

(2) R- البلازميدات:

تم اكتشاف البلازميدات R التي تمنح المقاومة للعديد من الأدوية بشكل فردي أو مقاومة متعددة للعديد من العوامل المضادة للبكتيريا لأول مرة في اليابان في الخمسينيات من القرن الماضي في التهاب المعدة والأمعاء المسبب للشيغيلة الزحارية. منذ ذلك الحين تم العثور على هذه البلازميدات في الإشريكية القولونية والبكتيريا المعوية الأخرى. أثبتت هذه البلازميدات أنها تشكل تهديدًا كبيرًا للعلوم الطبية.

إن البلازميدات الكبيرة R ذات الأوزان الجزيئية التي تتراوح بين 30 × 10 6 دالتون قابلة للانتقال ذاتيًا عن طريق الاقتران مع البكتيريا الأخرى. وبالتالي ، فهي بلازميدات اقتران ، مثل البلازميد F.

أصغر البلازميدات R ذات الأوزان الجزيئية من حوالي 5 إلى 6 × 10 6 دالتون غير قابلة للانتقال. إن معظم البلازميدات الكبيرة ذاتية النقل مثل R100 من الشيغيلا التي تمنح مقاومة متعددة للأدوية هي عبارة عن تكامل مشترك لقطعتين من الحمض النووي مرتبطة ببعضها البعض عن طريق الارتباط التساهمي لتشكيل جزيء دائري واحد مزدوج الشريطة.

يُطلق على أحد أجزاء الحمض النووي اسم عامل نقل المقاومة (RTF) ، بينما يحتوي الجزء الآخر على جينات مقاومة الأدوية. يشارك RTF بشكل أساسي في وظيفة نقل البلازميد R ويحتوي على عدد من الجينات (جينات النقل) وبعضها الآخر يتحكم في تكرار البلازميد في الخلية المضيفة.

جينات المقاومة الموجودة في الجزء الآخر تضع إنزيمات لتدمير الأدوية المضادة للبكتيريا ، مثل البنسلين ، الستربتومايسين ، الكلورامفينيكول ، التتراسيكلين ، الكاناميسين ، السلفوناميدات ، إلخ (الشكل 9.89).

في بعض البكتيريا المقاومة للأدوية ، مثل Salmonella typhimurium strain 29 ، لا توجد جينات المقاومة في نفس البلازميد ، ولكن في بلازميدات منفصلة ذات أحجام مختلفة. يُعرف هذا أحيانًا باسم تراكم البلازميد.

قد تحمل العناصر القابلة للنقل التي تحتوي على الينقولات المعقدة جينات مقاومة الأدوية. يمكن دمج هذه العناصر في البلازميدات مما يؤدي إلى ظهور بلازميد مقاوم للأدوية. وبالتالي ، يمكن أن تتكون البلازميدات R من مجموعة من الينقولات ، كل منها قد يحمل جينًا واحدًا أو أكثر لمقاومة المضادات الحيوية. على سبيل المثال ، يمكن إدخال Tn 5 الذي يحمل جينًا لمقاومة الكانامايسين في البلازميد R100 من الشيغيلا مما يجعل البلازميد قادرًا على مقاومة المضاد الحيوي.

إلى جانب مقاومة الأدوية ، قد تجعل البلازميدات أيضًا العوائل البكتيرية مقاومة للتأثيرات السامة للمعادن الثقيلة. تم الإبلاغ عن مقاومة مشفرة بالبلازميد للنيكل والكوبالت والزئبق والزرنيخ والكادميوم في أنواع مختلفة تنتمي إلى أجناس Pseudomonas و Escherichia و Salmonella و Staphylococcus.

(ثالثا) كولونيل البلازميدات:

توجد كول-بلازميدات في سلالات مختلفة من الإشريكية القولونية وتحتوي على جينات تتحكم في تخليق فئة من البروتينات تسمى كوليسين. كوليسين قادرة على تثبيط نمو البكتيريا ذات الصلة التي تفتقر إلى Col-plasmid (Cor).

تم اكتشاف عدة أنواع مختلفة من Col-plasmids ، كل منها ينتج كولسين له طريقة مختلفة لتثبيط البكتيريا الحساسة. على سبيل المثال ، يتسبب Col B في حدوث تلف في الغشاء السيتوبلازمي للبكتيريا المستهدفة ويسبب Col E2 و Col E3 تحلل الأحماض النووية.

مثل البلازميدات R ، قد تكون Col-plasmids قابلة للانتقال ذاتيًا أو غير قابلة للانتقال ذاتيًا. إن بلازميدات Col الكبيرة ، مثل Col I و Col V-K94 التي لها أوزان جزيئية 60 × 10 6 دالتون أو أعلى ، قابلة للانتقال ذاتيًا. لديهم رقم نسخة صغير ، عادة من 1 إلى 3 نسخ لكل خلية. البلازميدات الكولونية الصغيرة ، مثل Col-El ، لها وزن جزيئي يزن حوالي 4 إلى 5 × 10 6 دالتون.

لديهم عدد نسخ مرتفع ، عادة من 10 إلى 30 نسخة لكل خلية. إنها غير قابلة للانتقال ذاتيًا ، ولكن يمكن تعبئتها بمساعدة البلازميد F. هذا يعني أنه عندما تحتوي خلية F + أيضًا على Col El plasmid وتترافق مع خلية F ، يمكن نقل Col El plasmid إلى المستلم من خلال جسر التزاوج الذي تم إنشاؤه بواسطة F-plasmid. من الواضح أن خلية F-ColEl + غير قادرة على تعبئة Col-plasmid إلى خلية أخرى ، لأنها غير قادرة على بناء جسر التزاوج.

في المقابل ، فإن كول-بلازميدات كبيرة قابلة للانتقال ذاتيًا ، لأنها تمتلك الجينات لبناء جهاز الاقتران بأنفسها ولا تعتمد على البلازميد F للانتقال إلى الخلايا الأخرى. مثل البلازميدات F و R الكبيرة ، فإن البلازميدات الكبيرة هي أيضًا بلازميدات مقترنة.

تنتمي كوليسين إلى فئة عامة من البروتينات تسمى بكتريوسينات. تم العثور على العديد من البكتيريا لتطوير البكتريوسينات القادرة على قتل البكتيريا الأخرى ذات الصلة أو حتى غير ذات الصلة. يتم ترميز هذه البروتينات بواسطة الجينات الموجودة في البلازميدات المولدة للبكتيريا.

تُعطى أحيانًا أسماء مختلفة للبكتيريا التي تنتجها بكتيريا مختلفة ، مثل البيوسين الذي تنتجه Pseudomonas aeruginosa ، و megasine الذي طورته Bacillus megaterium ، و nisin بواسطة العصيات اللبنية ، وما إلى ذلك. تثبيط إحدى عمليات التمثيل الغذائي الحيوية ، مثل تكرار الأحماض النووية أو النسخ أو تخليق البروتين أو استقلاب الطاقة.

تساعد البكتيريا التي تنتجها البكتيريا المعوية في الحفاظ على توازن بيئي صحي في القولون البشري. ربما تعمل البكتيريا الأخرى التي تنتجها البكتيريا في ظل الظروف البيئية الطبيعية من خلال القضاء على المنافسين. تم استخدام Nisin الذي تنتجه بكتيريا حمض اللاكتيك تجاريًا لحفظ الأطعمة ومنتجات الألبان.

(4) البلازميدات المتحللة:

غالبًا ما يتم التحكم في تحلل أو تفكك المركبات العضوية أثناء التمعدن بواسطة الجينات المنقولة بالبلازميد في العديد من الكائنات الحية الدقيقة. تُعرف هذه البلازميدات التي تحتوي على جينات ترميز للإنزيمات التي تقوّض الجزيئات العضوية المعقدة بالبلازميدات المتحللة أو المتحللة. على سبيل المثال ، في أنواع Pseudomonas ، ينتج كل من جينات الكروموسومات والبلازميد إنزيمات لكسر وإيقاف المركبات المعقدة.

بعض جينات البلازميد ترمز للإنزيمات التي تحلل مثل هذه المركبات غير العادية مثل الكافور والتولوين والنفتالين والساليسيلات والهيدروكربونات المعقدة من البترول الخام. بمساعدة هذه الإنزيمات ، يمكن للبكتيريا استخدام هذه المركبات كمصدر للكربون والطاقة.

نتيجة لذلك ، تتمتع البكتيريا التي تمتلك مثل هذه البلازميدات المتحللة بفرصة أفضل للبقاء على قيد الحياة في ظل ظروف لا تتوفر فيها سوى مثل هذه المركبات غير العادية. البكتيريا العادية التي لا تحتوي على مثل هذه الإنزيمات المشفرة بالبلازميد ستهلك في ظل ظروف مماثلة.

تشير قدرة الكائنات الحية التي تحمل البلازميدات المتدهورة على استقلاب المركبات المعقدة المتنوعة غير العادية إلى إمكانية استخدامها كوسيلة للمعالجة الحيوية للبيئة الملوثة. شجع تطوير تقنيات الهندسة الوراثية العلماء على تطوير سلالات محسنة وراثيًا من البكتيريا التي تحتوي على البلازميدات القادرة على تحلل مجموعة من المركبات المعقدة ، مثل تلك التي تحدث في النفط الخام.

تم تطوير سلالة اصطناعية من Pseudomonas بواسطة Anandamohan Chakraborty من جامعة إلينوي بالولايات المتحدة الأمريكية ، مما يوفر فرصًا للاستخدام العملي في إزالة الانسكابات النفطية في المحيطات ، الناتجة عن تسرب النفط الخام من الناقلات. تشكل الانسكابات النفطية خطرًا كبيرًا على الحياة البحرية ، على كل من النباتات والحيوانات.

(ت) Ti-Plasmid من الأجرعية:

Ti-plasmid هو عبارة عن دنا دائري كبير ذو صبغيات مضاعفة إضافي للكروموسومات موجود في Agrobacterium tumefaciens ، وهي بكتيريا ممرضة للنبات تسبب مرض تاج المرارة في العديد من الأنواع ثنائية الفلقة. تاج المرارة هو ورم ينتج في منطقة طوق النباتات عن طريق البكتيريا الزراعية التي تمتلك Ti-plasmid. البكتيريا التي تفتقر إلى البلازميد غير ضارة.

Ti-plasmid عبارة عن حمض نووي دائري طويل بطول 200 كيلو زوج أساسي. جزء صغير فقط من هذا الجزيء الكبير ، جزء طويل من زوج قاعدي يبلغ 30 كيلوغرامًا ، مسؤول عن تكوين الورم. يُطلق على هذا الجزء اسم T-DNA (يشير T إلى التحول). عندما تصيب الأجرعية نبات مضيف حساس ، يتم إطلاق Ti-plasmid في الخلية المضيفة ويتم دمج نسخة من T-DNA في جينوم النبات المضيف.

ثم يحفز T-DNA المتكامل الضمور الخلوي الذي ينتج عنه في النهاية ورم يسمى مرارة التاج. يعتبر إدخال T-DNA في جينوم المضيف النباتي هو المثال الأول للتبادل الجيني بين الممالك بالوسائل الطبيعية.

من السمات البارزة لـ T-DNA أنه بمجرد دمجها في جينوم المضيف ، لم يعد وجود الكائن الممرض ضروريًا لتحريض الورم. وهكذا ، لوحظ وجود توازي وثيق مع تحريض السرطان في الخلية الحيوانية. يحتوي جزء T-DNA من Ti-plasmid على جينات تتحكم في تخليق الهرمونات النباتية ، مثل حمض الإندول والسيتوكينين ، بالإضافة إلى العديد من المركبات الأخرى التي تسمى الأوبينات. تستخدم الفتحات ، مثل الأوكتوبين والنوبالين كركائز نمو بواسطة البكتيريا الزراعية.

يحتوي باقي Ti-plasmid على عدة جينات تتحكم في الفوعة (جينات فير). تتحكم هذه الجينات في نقل T-DNA إلى المضيف. الجينات الأخرى لوظائف التحكم في البلازميد المتعلقة بالاقتران البكتيري وتكرار الحمض النووي وتقويض الأوبينات التي تم تصنيعها بواسطة المنتجات الجينية لجزء T-DNA.

يعمل T-DNA كوحدة متحركة مثل الينقولات ، لكنه لا يحتوي على جين ، مثل transposase للتوسط في تحريكه. يتم تحريكه بواسطة الجينات الموجودة في Ti-plasmid ، ولكن خارج T-DNA. يحيط T-DNA الذي يبلغ طوله 30 كيلوغرامًا على كلا الجانبين بـ 25 زوجًا أساسيًا من التكرارات المباشرة غير الكاملة لتشكيل حدود T-DNA.

تشارك جينات الـ vir لـ Ti-plasmid في توليد نسخة قابلة للتحويل من T-DNA ونقلها إلى الخلية النباتية من خلال غشاء الخلية والغشاء النووي ، وكذلك من خلال جدران الخلايا البكتيرية والنباتية. يتم نقل T-DNA كنسخة أحادية السلسلة.

يتم فصل النسخة عن مقطع T-DNA ، متوجًا عند الطرف 5 & # 8242 ببروتين مشفر بواسطة جين vir (vir D2) ومغطاة بعدد كبير من جزيئات البروتين المشفرة بواسطة جين vir آخر (vir E2). يتم نقل هذا المركب T إلى الخلية النباتية من خلال مسام غشاء ينتج عن جين فير آخر. يبلغ طول مركب T (بروتينات ss-DNA +) حوالي 3.6 ميكرومتر وأقل من 2 نانومتر.

تم تمثيل التركيب الإجمالي لبلازميد Ti وتوليد مركب T بشكل تخطيطي في الشكل 9.90:

إن قدرة الأجرعية المورمة على نقل بلازميد Ti-plasmid إلى العديد من النباتات ثنائية الفلقة (ولكن ليس النباتات أحادية الفلقة) فتحت إمكانية إدخال جينات أجنبية في العوائل باستخدام Ti-plasmid كوسيلة (ناقل).

تم استخدام هذا عمليًا لإدخال جين مهم في مقطع T-DNA عن طريق تقنية الحمض النووي المؤتلف. تتم إزالة الجينات المسببة للورم وغيرها من الجينات غير الضرورية لـ T-DNA واستبدالها بالجين المختار للإدخال. تم إدخال العديد من الجينات الأجنبية إلى مجموعة متنوعة من العوائل لإنتاج نباتات معدلة وراثيًا.

ومن بين الإنجازات البارزة إنتاج نباتات معدلة وراثيا مقاومة لمبيدات الأعشاب غليوفوسات وتغذية الحشرات. تم عزل الجين المقاوم للجليوفوسات من السالمونيلا والجين المقاوم للحشرات من Bacillus thuringiensis الذي يصنع بروتين مبيد حشري. من الإنجازات الأخرى المثيرة للاهتمام ، وإن لم تكن ذات أهمية عملية ، إنتاج نباتات الطماطم ذات الإضاءة الحيوية عن طريق إدخال الجين الذي يتحكم في التلألؤ الحيوي في ذبابة النار.

(6) البلازميدات حقيقية النواة:

نادرًا ما تحدث البلازميدات في الخلايا حقيقية النواة. تم العثور على بعض البلازميدات في الخميرة (Saccharomyces cerevisiae) وفي العديد من النباتات. تم العثور على بلازميد الحمض النووي الريبي الوحيد الذي تم اكتشافه حتى الآن في الخميرة. إنه RNA مزدوج الشريطة له وزن جزيئي 15 × 10 6 دالتون. يحتوي على 10 جينات بما في ذلك ترميز واحد لبروتين شبيه بالبكتيريا. يمكن للبروتين أن يقتل خلايا الخميرة الأخرى التي تفتقر إلى البلازميد. تم تصنيف بلازميد الخميرة هذا كجسيم قاتل.

تحتوي الخميرة أيضًا على بلازميدات DNA صغيرة مع عدد نسخ مرتفع. توجد في النواة وترتبط مثل الحمض النووي الصبغي بالبروتينات الأساسية - الهيستونات. تمت هندسة بعض بلازميدات دنا الخميرة وراثيًا بطريقة تجعلها قادرة على التكاثر في كل من الإشريكية القولونية والخميرة.

أحد بلازميد الخميرة المصمم هندسيًا هو Yep والذي يمكن أن يعمل كناقل للمكوك. تم استخدام هذا البلازميد في نقل الجينات المفيدة من الكائنات الحية الأخرى إلى خلايا الخميرة عبر الإشريكية القولونية لإنتاج بروتينات ذات قيمة علاجية مهمة. إن التطبيق الناجح لبلازميد Yep هو نقل الجين الذي يرمز إلى بروتين سكري الغلاف لفيروس التهاب الكبد B إلى الخميرة.

يمكن للخميرة المعدلة وراثيا التعبير عن الجين بنجاح من خلال إنتاج البروتين السكري الفيروسي. تم استخدام البروتين السكري لتحضير لقاح التهاب الكبد B للتطبيق البشري. نواقل المكوك مفيدة بشكل خاص في نقل الجينات حقيقية النواة ، لأن مثل هذه الجينات لا يتم التعبير عنها في كثير من الأحيان بنجاح في العوائل البكتيرية.

إلى جانب الخميرة ، تم اكتشاف بلازميدات الحمض النووي في العديد من النباتات ، مثل الذرة والذرة الرفيعة ، وكذلك في العديد من الفطريات. تتكون هذه البلازميدات من جزيئات DNA خطية مزدوجة مجدولة حيث تكون جميع البلازميدات البكتيرية دائرية.

تكرار البلازميدات:

في البلازميدات غير المنقسمة ، يوجد الحمض النووي مزدوج الشريطة كملف حلزوني فائق يمين يحتوي على 400-600 زوج قاعدي لكل لفة من الملف. أثناء التكرار ، يمكن أن تتكاثر البلازميدات بشكل مستقل ، على الرغم من أن التكرار يتطلب إنزيمات الخلية المضيفة. هذا هو السبب في أن البلازميدات يمكن أن تتكاثر فقط داخل الخلايا المضيفة.

كل بلازميد له أصله الخاص في التكرار. تحتوي بعض البلازميدات أيضًا على جينات ترمز للبروتينات الضرورية لتكاثرها. تم إثبات ذلك من خلال حقيقة أن متحولة F-plasmid حساسة لدرجة الحرارة (F + ts) غير قادرة على التكاثر عند 42 درجة مئوية ، على الرغم من أنها يمكن أن تعمل بشكل طبيعي عند 37 درجة مئوية.

نناقش بإيجاز الجوانب المختلفة لتكرار البلازميد أدناه:

(ط) البلازميدات غير المعدية:

يبدأ تكرار DNA البلازميد في موقع المنشأ وقد يستمر إما بشكل ثنائي الاتجاه كما في حالة الكروموسوم البكتيري ، أو قد يستمر بشكل أحادي الاتجاه اعتمادًا على طبيعة البلازميد. في النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه ، ينتهي النسخ المتماثل عندما تلتقي شوكات النسخ المتماثل مع بعضها البعض. في النسخ المتماثل أحادي الاتجاه ، يحدث الإنهاء عندما تصل شوكة النسخ المتماثل إلى موقع الأصل. في كلتا الحالتين ، يتم الحفاظ على دائرية DNA البلازميد طوال العملية.

(2) البلازميدات ذاتية الانتقال:

في حالة البلازميدات المقترنة ، مثل البلازميد F أو البلازميد R ، يحدث النسخ المتماثل بواسطة نموذج الدائرة المتدحرجة. يخضع الحمض النووي الفائق الالتفاف لكسر في أحد الخيط مما يؤدي إلى استرخاء الحالة فائقة الالتفاف لتشكيل دائرة مفتوحة. يظل الإنزيم الذي يحفز النك مرتبطًا بالطرف 5 & # 8242-P للجزيئات المسترخية. يصبح مثل هذا النك المفرد ضروريًا لنقل نسخة من البلازميد أثناء الاقتران إلى شريك التزاوج.

من خلال تكرار الدائرة المتدحرجة ، تحتفظ الخلية المانحة بالبلازميد المزدوج الذي تقطعت به السبل ، بينما يتم نقل نسخة مفردة من خلال جسر التزاوج إلى الخلية المتلقية ، حيث يتم تصنيع خيط مكمل وربطه لتشكيل نسخة مزدوجة تقطعت بهم السبل من البلازميد . يظهر تكرار البلازميد F بشكل تخطيطي في الشكل 9.91.

(3) التحكم في رقم النسخ:

تتميز البلازميدات الكبيرة بانخفاض عدد النسخ (واحد إلى عدد قليل) والبلازميدات الصغيرة بعدد النسخ العالي (من 10 إلى 100). يتم التحكم في عدد النسخ بواسطة مثبط مشفر بواسطة DNA البلازميد نفسه. يحدد تركيز المثبط في الخلية البكتيرية معدل بدء تكاثر البلازميد.

عندما تنقسم خلية تحتوي على اثنين من البلازميدات الكبيرة لإنتاج خليتين ابنتيتين ، كل منهما تحتوي على بلازميد واحد ، يكون تركيز المثبط في هذه الخلايا هو نفسه الموجود في الخلية الأم. الآن ، تنمو الخلايا الوليدة في الحجم للوصول إلى النضج مما يؤدي إلى خفض تركيز المثبط في السيتوبلازم.

نتيجة لذلك ، يبدأ تخليق الحمض النووي في البلازميد مما يؤدي إلى تكاثره بإنتاج نسختين.نظرًا لأن كل نسخة بلازميد تمتلك جينًا مثبطًا ، فإن إنتاج المثبط يتضاعف ويصبح تركيز المثبط مرتفعًا بما يكفي لإيقاف تخليق DNA البلازميد والمزيد من التكرار. وبالتالي ، فإن رقم النسخة يقتصر على اثنين لكل خلية.

يُعتقد أن آلية مماثلة للتحكم في عضو النسخ تعمل في حالة وجود عدد كبير من البلازميدات أيضًا. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يجب أن يصل تركيز المثبط إلى مستوى عتبة أعلى لإيقاف بدء تخليق DNA البلازميد مقارنةً بالبلازميدات ذات عدد النسخ المنخفض.

(4) تضخيم البلازميد:

نقطة أخرى مهمة في تكاثر البلازميد هي أن تخليق الحمض النووي الكروموسومي وتخليق DNA البلازميد مستقلان عن بعضهما البعض ، على الرغم من أنه في كليهما ، يتبع تخليق الحمض النووي عملية النسخ المتماثل. وبالتالي فمن الممكن وقف تخليق الكروموسومات DNA وتضاعفها دون التأثير
تخليق DNA البلازميد وتكرارها.

يمكن إنشاء مثل هذا الموقف عمليًا عن طريق إضافة الكلورامفينيكول إلى مزرعة بكتيرية. هذا المضاد الحيوي يمنع على وجه التحديد تخليق البروتين بدائية النواة. عند إضافته إلى مزرعة بكتيرية متنامية ، يتم تثبيط تخليق الحمض النووي الكروموسومي ، ولكن يستمر تخليق DNA البلازميد وتكرارها على حساب بروتينات النسخ المتماثل المتاحة والتي لا تستخدم في تخليق الحمض النووي الصبغي.

النتيجة النهائية هي أن كل خلية بكتيرية تحتوي على عدد كبير من النسخ البلازميدية. يُعرف هذا باسم تضخيم البلازميد. عندما يتطلب الأمر عزل جين معين تم نقله (مستنسخه) إلى بلازميد ، يصبح تضخيم البلازميد أداة مفيدة ، بسبب ارتفاع تركيز DNA البلازميد في الحمض النووي الخلوي الكلي.

(5) نقل البلازميدات غير ذاتية الانتقال:

هناك بعض البلازميدات التي لا تمتلك جينات للانتقال الذاتي ، ولكن يمكن نقلها إلى خلايا أخرى بمساعدة بلازميد ذاتي الانتقال عندما يحدث كلا البلازميدات في نفس الخلية. تُعرف باسم البلازميدات القابلة للتعبئة.

تمتلك هذه البلازميدات جينات للبروتينات اللازمة لخدش الحمض النووي الخاص بها في موقع منشأ التكاثر ، ولكنها تفتقر إلى الجينات اللازمة لبناء أنبوب الاقتران. عندما يتعايشون مع بلازميد ذاتي الانتقال ، مثل F أو R ، فإن الأخير يمكنه بناء جسر التزاوج الذي يتم من خلاله نقل نسخة من البلازميد القابل للتعبئة الناتج عن تكرار الدائرة المتدحرجة إلى خلية متلقية (الشكل 9.92).

يحدث نوع مختلف من التعبئة عندما تتحد خلية مانحة بها بلازميد قابل للانتقال ذاتيًا مع متلقي لديه بلازميد قابل للتعبئة. في هذا النوع من الاقتران ، يحصل كل من المتبرع والمتلقي على نسخة من كلا النوعين من البلازميدات من خلال عملية النقل الرجعي. أولاً ، يتكاثر البلازميد الذاتي الانتقال عن طريق نموذج الدائرة المتدحرجة ويتم نقل نسخة أحادية الجديلة عبر جسر التزاوج إلى المتلقي ، حيث يشكل حبلاً مكملاً يؤدي إلى تكوين نسخة من البلازميد القابل للانتقال ذاتيًا في بالطريقة المعتادة.

ثم يتكاثر البلازميد القابل للتعبئة في الخلية المتلقية ويتم نقل نسخة أحادية السلسلة إلى الخلية الأخرى التي تعمل الآن كمتلقي للبلازميد القابل للتعبئة. أخيرًا ، تنفصل الخليتان ، ولكل منهما نسخة من البلازميد القابل للانتقال ذاتيًا ونسخة من البلازميد القابل للتعبئة (الشكل 9.93).

عدم توافق البلازميدات:

بشكل عام ، لا يمكن أن يتعايش اثنان من البلازميدات ذات الصلة الوثيقة في خلية بكتيرية. في مجتمع الخلايا النسلية المشتقة من خلية تحتوي على اثنين من هذه البلازميدات ، تزداد نسبة الخلايا التي تحتوي على واحد فقط من البلازميدات مع كل انقسام للخلية. يُعرف هذا باسم عدم توافق البلازميد.

من ناحية أخرى ، هناك نوعان مختلفان من البلازميدات غير المرتبطة ، على سبيل المثال يمكن أن يتواجد F plasmid و ColEl معًا دون أي صعوبة ، لأن هذه البلازميدات تنتمي إلى مجموعتين مختلفتين من عدم التوافق. بينما لا يمكن أن يتعايش اثنان من البلازميدات F في نفس الخلية.

إحدى الآليات التي يمنع بها البلازميد الموجود بالفعل في الخلية دخول بلازميد ثانٍ مماثل إلى نفس الخلية هو الاستبعاد السطحي. على سبيل المثال ، لا يسمح F-plasmid للإشريكية القولونية بدخول بلازميد F آخر عن طريق منعه من مغادرة الخلية حيث توجد بالفعل. يتم توسط التأثير على سطح الخلية حيث لا يمكن للحمض النووي الريبي أن يخرج من الخلية.

تعمل آلية مختلفة عندما يكون للخلية بالفعل نوعان من البلازميدات المتقاربة ارتباطًا وثيقًا ، على سبيل المثال X و Y. نحن نعلم أن عدد نسخ البلازميدات يتم التحكم فيه بواسطة مثبطات محددة مشفرة بواسطة البلازميد نفسه.

نظرًا لأن X و Y هما بلازميدان مرتبطان ارتباطًا وثيقًا ، فمن المتوقع أن تكون مثبطاتهما أيضًا متشابهة إلى حد كبير وأن تكرار كل من البلازميدات سيتم تنظيمه بواسطة المثبط المنتج إما بواسطة X أو Y.

أثناء النسخ المتماثل ، يمكن اختيار X و Y عشوائيًا ، بحيث ، أثناء النسخ المتماثل الأول للبلازميد ، قد تنتج الخلية التي تحتوي في البداية نسخة واحدة من كل بلازميد نسختين من X أو Y ، بحيث يكون للخلية الآن نسختان من إما X أو Y ونسخة واحدة من البلازميد غير المتكرر أي 2X + Y أو X + 2Y. في الجولة الثانية من تكاثر البلازميد ، ستحتوي كل خلية على 4 بلازميدات ، ولكن اعتمادًا على البلازميد الذي يتم نسخه ، قد تكون المجموعة X + 3Y أو 2x + 2Y أو 3X + Y.

الآن تنقسم الخلية لإنتاج خليتين ابنتيتين ، كل منهما تحتوي على 2 بلازميدات وقد تكون مجموعات البلازميد للخلايا الوليدة هي X + X أو X + Y أو Y + Y. وبالتالي فإن احتمال وجود خلايا ذرية بها إما بلازميدان X أو اثنان Y البلازميدات تساوي تلك التي تحتوي على نوعين مختلفين من البلازميدات ، أي X + Y. وبعبارة أخرى ، فإن احتمال القضاء على بلازميد واحد هو 50٪. يزداد هذا الاحتمال مع زيادة أجيال الخلايا.

تظهر الأحداث التي تؤدي إلى التخلص من البلازميد في الشكل 9.94:

مكتبة البلازميد:

مكتبة البلازميد هي مكتبة جينية تحتوي على مجموعة من الثقافات البكتيرية ، كل منها يحتوي على بلازميد ، لكن بلازميد إحدى الثقافات يختلف عن الآخر في وجود جزء منفصل من الحمض النووي لجينوم كائن حي. يتم تجزئة الجينوم الكلي المعزول من الكائن الحي ويتم إدخال الأجزاء (المستنسخة) بشكل منفصل في البلازميدات الفردية.

ثم يتم إدخال هذه البلازميدات المؤتلفة في البكتيريا المضيفة المناسبة. وهكذا تحتوي كل مزرعة بكتيرية على بلازميد مع جزء. من المتوقع أن تحتوي المجموعة الإجمالية للثقافات على الجينوم الكامل للكائن الحي وستشكل مكتبة جينية لكائن حي معين. يتم تمثيل هذا بشكل تخطيطي في الشكل 9.95.


17.1 التكنولوجيا الحيوية

بنهاية هذا القسم ، ستكون قادرًا على القيام بما يلي:

  • وصف الرحلان الكهربائي للهلام
  • اشرح الاستنساخ الجزيئي والتناسلي
  • وصف استخدامات التكنولوجيا الحيوية في الطب والزراعة

التكنولوجيا الحيوية هي استخدام العوامل البيولوجية للتقدم التكنولوجي. تم استخدام التكنولوجيا الحيوية لتربية الماشية والمحاصيل قبل وقت طويل من فهم الناس للأسس العلمية لهذه التقنيات. منذ اكتشاف بنية الحمض النووي في عام 1953 ، نما مجال التكنولوجيا الحيوية بسرعة من خلال البحث الأكاديمي والشركات الخاصة. التطبيقات الأولية لهذه التكنولوجيا في الطب (اللقاحات وإنتاج المضادات الحيوية) والزراعة (التعديل الوراثي للمحاصيل من أجل زيادة الغلة). للتكنولوجيا الحيوية أيضًا العديد من التطبيقات الصناعية ، مثل التخمير ومعالجة الانسكابات النفطية وإنتاج الوقود الحيوي (الشكل 17.2).

التقنيات الأساسية لمعالجة المواد الجينية (DNA و RNA)

لفهم التقنيات الأساسية المستخدمة للعمل مع الأحماض النووية ، تذكر أن الأحماض النووية عبارة عن جزيئات كبيرة مكونة من النيوكليوتيدات (سكر ، فوسفات ، وقاعدة نيتروجينية) مرتبطة بروابط الفوسفات. تحتوي كل مجموعات الفوسفات في هذه الجزيئات على شحنة سالبة صافية. تسمى مجموعة كاملة من جزيئات الحمض النووي في النواة الجينوم. يحتوي الحمض النووي على خيطين متكاملين مرتبطين بروابط هيدروجينية بين القواعد المزدوجة. يمكن أن يؤدي التعرض لدرجات حرارة عالية (تمسخ الحمض النووي) إلى فصل الشريطين والتبريد يمكن أن يعيد إحياءهما. يمكن أن يقوم إنزيم بوليميريز الحمض النووي بتكرار الحمض النووي. على عكس الحمض النووي ، الموجود في نواة الخلايا حقيقية النواة ، تغادر جزيئات الحمض النووي الريبي النواة. أكثر أنواع الحمض النووي الريبي شيوعًا التي يحللها الباحثون هو الرنا المرسال (mRNA) لأنه يمثل جينات ترميز البروتين التي يتم التعبير عنها بنشاط. ومع ذلك ، فإن جزيئات الحمض النووي الريبي تمثل بعض التحديات الأخرى للتحليل ، لأنها غالبًا ما تكون أقل استقرارًا من الحمض النووي.

استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي

لدراسة الأحماض النووية أو معالجتها ، يجب أولاً عزل أو استخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من الخلايا. يستخدم الباحثون تقنيات مختلفة لاستخراج أنواع مختلفة من الحمض النووي (الشكل 17.3). تتضمن معظم تقنيات استخراج الحمض النووي خطوات لفتح الخلية واستخدام التفاعلات الأنزيمية لتدمير جميع الجزيئات الكبيرة غير المرغوبة (مثل تحلل الجزيء غير المرغوب فيه والفصل عن عينة الحمض النووي). يقوم محلول التحلل (محلول غالبًا ما يكون منظفًا) بتكسير الخلايا. لاحظ أن التحلل يعني "الانقسام". تعمل هذه الإنزيمات على تفكيك جزيئات الدهون في أغشية الخلايا والأغشية النووية. إنزيمات مثل البروتياز التي تكسر البروتينات تعطل الجزيئات الكبيرة ، والريبونوكليازات (RNAses) التي تكسر الحمض النووي الريبي (RNA). يؤدي استخدام الكحول إلى ترسيب الحمض النووي. عادة ما يكون الحمض النووي الجيني البشري مرئيًا ككتلة هلامية بيضاء. يمكن تخزين عينات الحمض النووي المجمدة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لعدة سنوات.

يقوم العلماء بتحليل الحمض النووي الريبي لدراسة أنماط التعبير الجيني في الخلايا. من الطبيعي أن يكون الحمض النووي الريبي غير مستقر للغاية لأن الحمض النووي الريبي موجود بشكل شائع في الطبيعة ويصعب جدًا تعطيله. على غرار الحمض النووي ، يتضمن استخراج الحمض النووي الريبي استخدام العديد من المحاليل والإنزيمات لتعطيل الجزيئات الكبيرة والحفاظ على الحمض النووي الريبي.

هلام الكهربائي

لأن الأحماض النووية عبارة عن أيونات سالبة الشحنة عند درجة حموضة محايدة أو قاعدية في بيئة مائية ، يمكن للمجال الكهربائي أن يحركها. الرحلان الكهربائي للهلام هو تقنية يستخدمها العلماء لفصل الجزيئات على أساس الحجم باستخدام هذه الشحنة. يمكن فصل الأحماض النووية ككروموسومات كاملة أو شظايا. يتم تحميل الأحماض النووية في فتحة بالقرب من القطب السالب لمصفوفة الهلام شبه الصلبة المسامية ، ويتم سحبها نحو القطب الموجب عند الطرف المقابل للهلام. تتحرك الجزيئات الأصغر عبر مسام الهلام أسرع من الجزيئات الأكبر. هذا الاختلاف في معدل الترحيل يفصل الأجزاء على أساس الحجم. هناك عينات قياسية للوزن الجزيئي يمكن للباحثين تشغيلها جنبًا إلى جنب مع الجزيئات لتوفير مقارنة الحجم. يمكننا ملاحظة الأحماض النووية في مصفوفة هلامية باستخدام أصباغ فلورية أو ملونة مختلفة. تظهر شظايا الحمض النووي المميزة على شكل نطاقات على مسافات محددة من قمة الجل (نهاية القطب السالب) على أساس حجمها (الشكل 17.4). يظهر مزيج من شظايا الحمض النووي الجينومي بأحجام مختلفة على شكل مسحة طويلة ، في حين أن الحمض النووي الجينومي غير المقطوع عادة ما يكون أكبر من أن يمر عبر الهلام ويشكل نطاقًا كبيرًا واحدًا في الجزء العلوي من الجل.

تضخيم جزء الحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل

على الرغم من أن الحمض النووي الجيني يكون مرئيًا للعين المجردة عند استخراجه بكميات كبيرة ، إلا أن تحليل الحمض النووي غالبًا ما يتطلب التركيز على منطقة أو أكثر من مناطق الجينوم المحددة. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هي تقنية يستخدمها العلماء لتضخيم مناطق معينة من الحمض النووي لمزيد من التحليل (الشكل 17.5). يستخدم الباحثون تفاعل البوليميراز المتسلسل لعدة أغراض في المختبرات ، مثل استنساخ شظايا الجينات لتحليل الأمراض الوراثية ، وتحديد الحمض النووي الغريب الملوث في عينة ، وتضخيم الحمض النووي للتسلسل. المزيد من التطبيقات العملية تشمل تحديد الأبوة والكشف عن الأمراض الوراثية.

يمكن أيضًا تضخيم شظايا الحمض النووي من قالب RNA في عملية تسمى النسخ العكسي PCR (RT-PCR). تتمثل الخطوة الأولى في إعادة إنشاء خيط قالب الحمض النووي الأصلي (يسمى cDNA) عن طريق تطبيق نيوكليوتيدات الحمض النووي على الرنا المرسال. هذه العملية تسمى النسخ العكسي. هذا يتطلب وجود إنزيم يسمى النسخ العكسي. بعد صنع (كدنا) ، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي لتضخيمه.

ارتباط بالتعلم

تعميق فهمك لتفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال مشاهدة هذا الفيديو.

التهجين ، النشاف الجنوبي ، والنشاف الشمالي

يمكن للعلماء فحص عينات الحمض النووي ، مثل الحمض النووي الجينومي المجزأ ومستخلصات الحمض النووي الريبي ، لوجود تسلسلات معينة. يقوم العلماء بتصميم وتسمية أجزاء قصيرة من الحمض النووي ، أو المجسات باستخدام الأصباغ المشعة أو الفلورية للمساعدة في الكشف. يفصل الرحلان الكهربائي الهلامي شظايا الحمض النووي وفقًا لحجمها. يقوم العلماء بعد ذلك بنقل الأجزاء الموجودة في الهلام إلى غشاء من النايلون في إجراء نسميه النشاف (الشكل 17.6). يمكن للعلماء بعد ذلك فحص شظايا الحمض النووي المرتبطة بسطح الغشاء باستخدام تسلسل مسبار محدد إشعاعيًا أو الفلورسنت. عندما ينقل العلماء الحمض النووي إلى غشاء نايلون ، فإنهم يشيرون إلى التقنية على أنها النشاف الجنوبي. عندما ينقلون الحمض النووي الريبي إلى غشاء نايلون ، يسمونه النشاف الشمالي. يستخدم العلماء اللطخات الجنوبية لاكتشاف وجود تسلسلات معينة من الحمض النووي في جينوم معين ، والبقع الشمالية للكشف عن التعبير الجيني.

الاستنساخ الجزيئي

بشكل عام ، تعني كلمة "الاستنساخ" إنشاء نسخة متماثلة مثالية ، ومع ذلك ، في علم الأحياء ، يشار إلى إعادة تكوين كائن كامل باسم "الاستنساخ التناسلي". قبل وقت طويل من محاولات استنساخ كائن حي بأكمله ، تعلم الباحثون كيفية إعادة إنتاج المناطق المرغوبة أو أجزاء من الجينوم ، وهي عملية يشار إليها باسم الاستنساخ الجزيئي.

يسمح استنساخ شظايا الجينوم الصغيرة للباحثين بمعالجة ودراسة جينات معينة (ومنتجاتها البروتينية) ، أو مناطق غير مشفرة في عزلة. البلازميد ، أو الناقل ، هو جزيء DNA دائري صغير يتكاثر بشكل مستقل عن الحمض النووي الصبغي. في الاستنساخ ، يمكن للعلماء استخدام جزيئات البلازميد لتوفير "ملف" يتم فيه إدخال جزء DNA المطلوب. عادة ما يتم إدخال البلازميدات في مضيف بكتيري للتكاثر. في السياق البكتيري ، يطلق العلماء على جزء الحمض النووي من الجينوم البشري (أو جينوم كائن آخر مدروس) الحمض النووي الغريب ، أو الجين المحور ، لتمييزه عن الحمض النووي للبكتيريا ، أو الحمض النووي المضيف.

تحدث البلازميدات بشكل طبيعي في التجمعات البكتيرية (مثل الإشريكية القولونية) ولها جينات يمكن أن تسهم في سمات مواتية للكائن الحي ، مثل مقاومة المضادات الحيوية (القدرة على عدم التأثر بالمضادات الحيوية). أعاد العلماء استخدام وهندسة البلازميدات كنواقل للاستنساخ الجزيئي والإنتاج الواسع النطاق للكواشف المهمة ، مثل الأنسولين وهرمون النمو البشري. من السمات المهمة لناقلات البلازميد السهولة التي يمكن للعلماء من خلالها إدخال جزء دنا أجنبي عبر موقع الاستنساخ المتعدد (MCS). إن MCS عبارة عن تسلسل DNA قصير يحتوي على مواقع متعددة يمكن أن يقطعها نوكليازات تقييدية مختلفة متاحة بشكل شائع. تتعرف نوكليازات التقييد على تسلسلات DNA محددة وتقطعها بطريقة يمكن التنبؤ بها. يتم إنتاجها بشكل طبيعي بواسطة البكتيريا كآلية دفاع ضد الحمض النووي الغريب. تقوم العديد من نوكليازات التقييد بعمل جروح متداخلة في شريطين من الحمض النووي ، بحيث يكون للنهايات المقطوعة 2 أو 4 قاعدة مفردة متدلية. ونظرًا لأن هذه الأجزاء المتدلية قادرة على التلدين باستخدام الأجزاء المتدلية التكميلية ، فإننا نطلق عليها "النهايات اللاصقة". إضافة إنزيم ليجاسى DNA ينضم بشكل دائم إلى شظايا الحمض النووي عبر روابط phosphodiester. بهذه الطريقة ، يمكن للعلماء لصق أي جزء من الحمض النووي الناتج عن انشقاق نوكلياز مقيد بين طرفي DNA البلازميد الذي تم قطعه بنفس نوكلياز التقييد (الشكل 17.7).

جزيئات الحمض النووي المؤتلف

تسمى البلازميدات التي تحتوي على دنا أجنبي داخلها بجزيئات الحمض النووي المؤتلف لأنها تتكون بشكل مصطنع ولا تحدث في الطبيعة. وتسمى أيضًا جزيئات خيمرية لأن أصل الأجزاء الجزيئية المختلفة للجزيئات يمكن إرجاعه إلى أنواع مختلفة من الكائنات الحية أو حتى إلى التوليف الكيميائي. نسمي البروتينات التي يتم التعبير عنها من جزيئات الحمض النووي المؤتلف البروتينات المؤتلفة. ليست كل البلازميدات المؤتلفة قادرة على التعبير عن الجينات. قد يحتاج الحمض النووي المؤتلف إلى الانتقال إلى ناقل (أو مضيف) مختلف مصمم بشكل أفضل للتعبير الجيني. يمكن للعلماء أيضًا هندسة البلازميدات للتعبير عن البروتينات فقط عندما تحفزها عوامل بيئية معينة ، حتى يتمكنوا من التحكم في تعبير البروتينات المؤتلفة.

اتصال مرئي

أنت تعمل في مختبر البيولوجيا الجزيئية ، وبدون علمك ، ترك شريكك في المختبر الحمض النووي الجيني الغريب الذي تخطط لاستنساخه على طاولة المختبر طوال الليل بدلاً من تخزينه في الفريزر. نتيجة لذلك ، تم تحللها بواسطة نوكليازات ، لكنها لا تزال تستخدم في التجربة. من ناحية أخرى ، فإن البلازميد جيد. ما هي النتائج التي تتوقعها من تجربة الاستنساخ الجزيئي؟

  1. لن يكون هناك مستعمرات على الصفيحة البكتيرية.
  2. ستكون هناك مستعمرات زرقاء فقط.
  3. ستكون هناك مستعمرات زرقاء وبيضاء.
  4. ستكون المستعمرات البيضاء فقط.

ارتباط بالتعلم

شاهد رسمًا متحركًا لإعادة التركيب في الاستنساخ من مركز تعليم الحمض النووي.

الاستنساخ الخلوي

الكائنات وحيدة الخلية ، مثل البكتيريا والخميرة ، تنتج بشكل طبيعي مستنسخات من نفسها عندما تتكاثر لاجنسيًا عن طريق الانشطار الثنائي ، وهذا ما يعرف بالاستنساخ الخلوي. يتكاثر الحمض النووي من خلال عملية الانقسام ، مما يخلق نسخة طبق الأصل من المادة الجينية.

الاستنساخ التناسلي

الاستنساخ التناسلي هو طريقة يستخدمها العلماء لاستنساخ أو نسخ متماثل لكائن حي متعدد الخلايا بأكمله. تخضع معظم الكائنات متعددة الخلايا للتكاثر بالوسائل الجنسية ، والتي تتضمن التهجين الجيني لشخصين (الوالدين) ، مما يجعل من المستحيل توليد نسخة متطابقة أو استنساخ لأي من الوالدين. جعلت التطورات الحديثة في التكنولوجيا الحيوية من الممكن تحفيز التكاثر اللاجنسي للثدييات بشكل مصطنع في المختبر.

يحدث التوالد العذري ، أو "الولادة العذراء" ، عندما ينمو الجنين ويتطور دون تلقيح البويضة. هذا شكل من أشكال التكاثر اللاجنسي. مثال على التوالد العذري يحدث في الأنواع التي تضع فيها الأنثى بيضة وإذا تم إخصاب البويضة ، فهي بيضة ثنائية الصبغيات ويتطور الفرد إلى أنثى. إذا لم يتم تخصيب البويضة ، فإنها تظل بويضة أحادية العدد وتتطور إلى ذكر. البويضة غير المخصبة هي بيضة عذراء. تضع بعض الحشرات والزواحف بيضًا مكرّرًا للتكاثر يمكن أن يتطور إلى بالغ.

يتطلب التكاثر الجنسي خليتين. عندما تندمج البويضة أحادية الصيغة الصبغية وخلايا الحيوانات المنوية ، ينتج عن ذلك زيجوت ثنائي الصيغة الصبغية. تحتوي نواة اللاقحة على المعلومات الجينية لإنتاج فرد جديد. ومع ذلك ، فإن التطور الجنيني المبكر يتطلب المادة السيتوبلازمية الموجودة في خلية البويضة. هذه الفكرة تشكل أساس الاستنساخ التناسلي. لذلك ، إذا استبدلنا نواة خلية البويضة أحادية الصيغة الصبغية بنواة ثنائية الصبغيات من خلية أي فرد من نفس النوع (متبرع) ، فسوف تصبح زيجوتًا مطابقًا وراثيًا للمتبرع. نقل نواة الخلية الجسدية هو تقنية نقل نواة ثنائية الصبغيات إلى بويضة منزوعة النواة. يمكن للعلماء استخدامه إما للاستنساخ العلاجي أو الاستنساخ لأغراض التكاثر.

كان أول حيوان مستنسخ هو دوللي ، وهو خروف ولد في عام 1996. وكان معدل نجاح الاستنساخ في ذلك الوقت منخفضًا للغاية. عاشت دوللي لمدة سبع سنوات وتوفيت بسبب مضاعفات في الجهاز التنفسي (الشكل 17.8). هناك تكهنات بأنه نظرًا لأن الحمض النووي للخلية ينتمي إلى فرد أكبر سنًا ، فقد يؤثر عمر الحمض النووي على متوسط ​​العمر المتوقع للفرد المستنسخ.منذ دوللي ، استنسخ العلماء بنجاح العديد من الحيوانات مثل الخيول والثيران والماعز ، على الرغم من أن هذه الحيوانات غالبًا ما تظهر عليها تشوهات في الوجه والأطراف والقلب. كانت هناك محاولات لإنتاج أجنة بشرية مستنسخة كمصادر للخلايا الجذعية الجنينية للأغراض العلاجية. ينتج الاستنساخ العلاجي الخلايا الجذعية في محاولة لعلاج الأمراض أو العيوب الضارة (على عكس الاستنساخ لأغراض التكاثر ، الذي يهدف إلى إعادة إنتاج كائن حي). ومع ذلك ، واجه البعض مقاومة الاستنساخ العلاجي بسبب اعتبارات أخلاقية حيوية.

اتصال مرئي

هل تعتقد أن دوللي كانت من الأغنام الفنلندية دورست أو الأغنام الاسكتلندية ذات الوجه الأسود؟

الهندسة الوراثية

الهندسة الوراثية هي تغيير النمط الجيني للكائن باستخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف لتعديل الحمض النووي للكائن الحي لتحقيق السمات المرغوبة. تعد إضافة الحمض النووي الأجنبي في شكل نواقل الحمض النووي المؤتلف الناتجة عن الاستنساخ الجزيئي الطريقة الأكثر شيوعًا للهندسة الوراثية. الكائن الحي الذي يتلقى الحمض النووي المؤتلف هو كائن معدل وراثيًا (GMO). إذا جاء الحمض النووي الغريب من نوع مختلف ، فإن الكائن الحي المضيف يكون معدلاً وراثيًا. قام العلماء بتعديل البكتيريا والنباتات والحيوانات وراثيًا منذ أوائل السبعينيات للأغراض الأكاديمية والطبية والزراعية والصناعية. في الولايات المتحدة ، تعد الكائنات المعدلة وراثيًا مثل فول الصويا الجاهز للتقرير والذرة المقاومة للحفر جزءًا من العديد من الأطعمة المصنعة الشائعة.

استهداف الجينات

على الرغم من أن الطرق الكلاسيكية لدراسة وظيفة الجين بدأت بنمط ظاهري معين وحددت الأساس الجيني لهذا النمط الظاهري ، فإن التقنيات الحديثة تسمح للباحثين بالبدء على مستوى تسلسل الحمض النووي ويسألون: "ماذا يفعل هذا الجين أو عنصر الحمض النووي؟" أدت هذه التقنية ، علم الوراثة العكسي ، إلى عكس المنهجية الجينية الكلاسيكية. تشبه هذه الطريقة إتلاف جزء من الجسم لتحديد وظيفته. الحشرة التي تفقد جناحها لا تستطيع الطيران ، مما يعني أن وظيفة الجناح هي الطيران. تقارن الطريقة الجينية الكلاسيكية الحشرات التي لا تستطيع الطيران مع الحشرات القادرة على الطيران ، وتلاحظ أن الحشرات غير الطائرة فقدت أجنحة. وبالمثل ، فإن تحور الجينات أو حذفها يوفر للباحثين أدلة حول وظيفة الجينات. نحن نطلق بشكل جماعي على الطرق التي يستخدمونها لتعطيل الاستهداف الجيني لوظيفة الجينات. استهداف الجينات هو استخدام نواقل الحمض النووي المؤتلف لتغيير تعبير جين معين ، إما عن طريق إدخال طفرات في الجين ، أو عن طريق إزالة تعبير جين معين عن طريق حذف جزء أو كل تسلسل الجين من جينوم الكائن الحي.

التكنولوجيا الحيوية في الطب والزراعة

من السهل أن نرى كيف يمكن استخدام التكنولوجيا الحيوية للأغراض الطبية. توفر معرفة التركيب الجيني لجنسنا البشري ، والأساس الجيني للأمراض الوراثية ، واختراع التكنولوجيا لمعالجة الجينات الطافرة وإصلاحها ، طرقًا لعلاج المرض. يمكن للتكنولوجيا الحيوية في الزراعة أن تعزز مقاومة الأمراض والآفات والضغوط البيئية ، وتحسن كل من غلة المحاصيل وجودتها.

التشخيص الجيني والعلاج الجيني

يسمي العلماء عملية اختبار العيوب الجينية المشتبه بها قبل إجراء التشخيص الجيني للعلاج عن طريق الاختبارات الجينية. اعتمادًا على أنماط الوراثة للجين المسبب للمرض ، يُنصح أفراد الأسرة بالخضوع للاختبار الجيني. على سبيل المثال ، ينصح الأطباء عادة النساء المصابات بسرطان الثدي بأخذ خزعة حتى يتمكن الفريق الطبي من تحديد الأساس الجيني لتطور السرطان. يبني الأطباء خطط العلاج على نتائج الاختبارات الجينية التي تحدد نوع السرطان. إذا تسببت الطفرات الجينية الموروثة في الإصابة بالسرطان ، ينصح الأطباء أيضًا الأقارب الإناث بالخضوع للاختبار الجيني والفحص الدوري لسرطان الثدي. يقدم الأطباء أيضًا اختبارًا جينيًا للأجنة (أو الأجنة ذات الإخصاب في المختبر) لتحديد وجود أو عدم وجود الجينات المسببة للأمراض في العائلات المصابة بأمراض موهنة محددة.

العلاج الجيني هو تقنية هندسية وراثية تستخدم لعلاج المرض. في أبسط أشكاله ، يتضمن إدخال جين جيد في مكان عشوائي في الجينوم للمساعدة في علاج مرض ناجم عن جين متحور. عادة ما يتم إدخال الجين الجيد في الخلايا المريضة كجزء من ناقل ينتقل عن طريق فيروس يمكن أن يصيب الخلية المضيفة وينقل الحمض النووي الغريب (الشكل 17.9). تحاول الأشكال الأكثر تقدمًا من العلاج الجيني تصحيح الطفرة في الموقع الأصلي في الجينوم ، كما هو الحال مع علاج نقص المناعة المشترك الشديد (SCID).

إنتاج اللقاحات والمضادات الحيوية والهرمونات

تستخدم استراتيجيات التطعيم التقليدية أشكالًا ضعيفة أو غير نشطة من الكائنات الحية الدقيقة لزيادة الاستجابة المناعية الأولية. تستخدم التقنيات الحديثة جينات الكائنات الحية الدقيقة المستنسخة في نواقل لإنتاج المستضد المطلوب بشكل جماعي. يقوم الأطباء بعد ذلك بإدخال المستضد في الجسم لتحفيز الاستجابة المناعية الأولية وتحفيز الذاكرة المناعية. استخدم المجال الطبي جينات مستنسخة من فيروس الأنفلونزا لمحاربة سلالات هذا الفيروس المتغيرة باستمرار.

المضادات الحيوية هي أحد منتجات التكنولوجيا الحيوية. الكائنات الحية الدقيقة ، مثل الفطريات ، تنتجها بشكل طبيعي لتحقيق ميزة على المجموعات البكتيرية. ينتج عن زراعة الخلايا الفطرية والتلاعب بها مضادات حيوية.

استخدم العلماء تقنية الحمض النووي المؤتلف لإنتاج كميات كبيرة من الأنسولين البشري في بكتريا قولونية في وقت مبكر يعود إلى عام 1978. في السابق ، كان من الممكن علاج مرض السكري بأنسولين الخنازير فقط ، والذي تسبب في ردود فعل تحسسية لدى البشر بسبب الاختلافات في المنتج الجيني. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم الأطباء هرمون النمو البشري (HGH) لعلاج اضطرابات النمو عند الأطفال. استنسخ الباحثون جين HGH من مكتبة (كدنا) وأدخلوه فيها بكتريا قولونية الخلايا عن طريق استنساخها في ناقلات بكتيرية.

الحيوانات المعدلة وراثيا

على الرغم من أن العديد من البروتينات المؤتلفة في الطب يتم إنتاجها بنجاح في البكتيريا ، إلا أن بعض البروتينات تتطلب مضيفًا حيوانيًا حقيقيًا للنواة من أجل المعالجة المناسبة. لهذا السبب ، يتم استنساخ الجينات المرغوبة والتعبير عنها في الحيوانات ، مثل الأغنام والماعز والدجاج والفئران. نحن نسمي الحيوانات التي تم تعديلها للتعبير عن الحيوانات المعدلة وراثيًا في الحمض النووي المؤتلف. يتم التعبير عن العديد من البروتينات البشرية في حليب الأغنام والماعز المعدل وراثيًا ، ويتم التعبير عن بعضها في بيض الدجاج. استخدم العلماء الفئران على نطاق واسع للتعبير عن الجينات المؤتلفة وتأثيرات الطفرات ودراستها.

النباتات المعدلة وراثيا

ساعد التلاعب بالحمض النووي للنباتات (أي إنشاء كائنات معدلة وراثيًا) في خلق سمات مرغوبة ، مثل مقاومة الأمراض ومقاومة مبيدات الأعشاب ومبيدات الآفات وقيمة غذائية أفضل وعمر تخزين أفضل (الشكل 17.10). النباتات هي أهم مصدر للغذاء لسكان البشر. طور المزارعون طرقًا لاختيار أنواع نباتية ذات سمات مرغوبة قبل وقت طويل من تأسيس ممارسات التكنولوجيا الحيوية الحديثة.

نسمي النباتات التي تلقت دنا مؤتلفًا من نباتات معدلة وراثيًا لأنواع أخرى. نظرًا لأنها ليست طبيعية ، تراقب الوكالات الحكومية عن كثب النباتات المعدلة وراثيًا وغيرها من الكائنات المعدلة وراثيًا للتأكد من أنها صالحة للاستهلاك البشري ولا تعرض الحياة النباتية والحيوانية الأخرى للخطر. نظرًا لأن الجينات الأجنبية يمكن أن تنتشر إلى أنواع أخرى في البيئة ، يلزم إجراء اختبارات مكثفة لضمان الاستقرار البيئي. كانت المواد الغذائية الأساسية مثل الذرة والبطاطس والطماطم هي نباتات المحاصيل الأولى التي صممها العلماء وراثيًا.

تحويل النباتات باستخدام أغروباكتريوم توميفاسيانز

يحدث نقل الجينات بشكل طبيعي بين الأنواع في التجمعات الميكروبية. تعمل العديد من الفيروسات التي تسبب الأمراض البشرية ، مثل السرطان ، عن طريق دمج حمضها النووي في الجينوم البشري. في النباتات ، الأورام التي تسببها البكتيريا أغروباكتريوم توميفاسيانز تحدث عن طريق نقل الحمض النووي من البكتيريا إلى النبات. على الرغم من أن الأورام لا تقتل النباتات ، إلا أنها تقزم النباتات وتصبح أكثر عرضة للظروف البيئية القاسية. A. الورم يؤثر على العديد من النباتات مثل الجوز والعنب وأشجار البندق والبنجر. يعد إدخال الحمض النووي بشكل مصطنع في الخلايا النباتية أكثر صعوبة من الخلايا الحيوانية بسبب جدار الخلية النباتية السميك.

استخدم الباحثون النقل الطبيعي للحمض النووي من الأجرعية إلى مضيف نبات لإدخال أجزاء من الحمض النووي من اختيارهم إلى مضيفات النبات. في الطبيعة ، المسببة للأمراض A. الورم تحتوي على مجموعة من البلازميدات ، وهي بلازميدات Ti (بلازميدات محفزة للورم) ، والتي تحتوي على جينات لإنتاج الأورام في النباتات. يتكامل الحمض النووي من بلازميد Ti في جينوم الخلية النباتية المصابة. يتلاعب الباحثون ببلازميدات Ti لإزالة الجينات المسببة للورم وإدخال جزء الحمض النووي المطلوب لنقله إلى جينوم النبات. تحمل بلازميدات Ti جينات مقاومة للمضادات الحيوية للمساعدة في الانتقاء ويمكن للباحثين نشرها فيها بكتريا قولونية الخلايا كذلك.

المبيد الحشري العضوي Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) هي بكتيريا تنتج بلورات بروتينية أثناء التكاثر تكون سامة للعديد من أنواع الحشرات التي تؤثر على النباتات. تحتاج الحشرات إلى تناول سم Bt لتنشيط السم. تتوقف الحشرات التي أكلت سم Bt عن التغذية على النباتات في غضون ساعات قليلة. بعد أن ينشط السم في أمعاء الحشرات ، تموت في غضون يومين. سمحت التكنولوجيا الحيوية الحديثة للنباتات بتشفير سمها البلوري Bt الذي يعمل ضد الحشرات. استنسخ العلماء جينات السم البلورية من Bt وأدخلوها في النباتات. توكسين Bt آمن على البيئة ، وغير سام للإنسان والثدييات الأخرى ، وقد وافق المزارعون العضويون على استخدامه كمبيد حشري طبيعي.

طماطم Flavr Savr

كان أول محصول معدل وراثيًا في السوق هو Flavr Savr Tomato في عام 1994. استخدم العلماء تقنية RNA المضادة للحساسية لإبطاء عملية التليين والتعفن الناتجة عن الالتهابات الفطرية ، مما أدى إلى زيادة العمر الافتراضي للطماطم المعدلة وراثيًا. أدى التعديل الجيني الإضافي إلى تحسين نكهة الطماطم. لم تنجح طماطم Flavr Savr في البقاء في السوق بسبب مشاكل صيانة المحصول وشحنه.


البلازميدات

البلازميد عبارة عن جزيء دنا مستقل ، دائري ، ذاتي التكاثر يحمل عددًا قليلاً من الجينات. يظل عدد البلازميدات في الخلية بشكل عام ثابتًا من جيل إلى جيل. البلازميدات هي جزيئات مستقلة وتوجد في الخلايا كجينومات خارج الصبغية ، على الرغم من أنه يمكن إدخال بعض البلازميدات في كروموسوم بكتيري ، حيث تصبح جزءًا دائمًا من الجينوم البكتيري. هنا يقدمون وظائف رائعة في العلوم الجزيئية.

من السهل التعامل مع البلازميدات وعزلها باستخدام البكتيريا (انظر أيضًا التحلل القلوي) ويمكن دمجها في جينومات الثدييات ، وبالتالي منح خلايا الثدييات أي وظائف وراثية تحملها. وبالتالي ، يمنحك هذا القدرة على إدخال الجينات في كائن حي معين باستخدام البكتيريا لتضخيم الجينات الهجينة التي يتم إنشاؤها في المختبر. هذا الجزيء البلازميدي الصغير ولكن القوي هو أساس تقنية الحمض النووي المؤتلف.

هناك فئتان من البلازميدات. بلازميدات صارمة يتكاثر فقط عندما يتكاثر الكروموسوم. هذا جيد إذا كنت تعمل ببروتين قاتل للخلية. استرخاء البلازميدات تكرار من تلقاء نفسها. يمنحك هذا نسبة أعلى من البلازميدات إلى الكروموسوم.

فكيف نتعامل مع هذه البلازميدات؟

1. التحول باستخدام إنزيمات التقييد ، وإنزيمات الربط ، و PCR. يمكن تحقيق الطفرات بسهولة باستخدام إنزيمات تقييدية لقطع أجزاء من جينوم واحد وإدخالها في البلازميد. يمكن أيضًا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتسهيل حدوث الطفرات. يتم رسم خرائط البلازميدات للإشارة إلى مواقع أصولها في التكاثر ومواقع إنزيم التقييد.

2. حدد باستخدام العلامات الجينية. بعض البكتيريا مقاومة للمضادات الحيوية. في حين أن هذه مشكلة صحية خطيرة ، إلا أنها هبة من السماء لعلماء الجزيئات. يمكن إضافة (ربط) الجين الذي يمنح مقاومة المضادات الحيوية إلى الجين الذي تقوم بإدخاله في البلازميد. لذلك لن يتم قتل كل بلازميد يحتوي على الجين المستهدف بالمضادات الحيوية. بعد أن تقوم بتعقيم الخلايا البكتيرية الخاصة بك بالبلازميد المُعدّل هندسيًا (الذي يحتوي على الجين المستهدف وعلامة مقاومة المضادات الحيوية) ، تقوم باحتضانها في مرق مغذي يحتوي أيضًا على مضاد حيوي (عادةً الأمبيسلين). يتم قتل أي خلايا لم يتم نقلها (وهذا يعني أنها لا تحتوي على الجين المستهدف فيها) بواسطة المضاد الحيوي. تمتلك الجينات التي تحتوي على الجين أيضًا الجين المقاوم للمضادات الحيوية ، وبالتالي تنجو من عملية الانتقاء.

3. عزل لهم (مثل التحلل القلوي).

4. التحويل منهم إلى خلايا حيث يصبحون نواقل لنقل الجينات الأجنبية إلى كائن متلقي.

هناك بعض المتطلبات الدنيا للبلازميدات المفيدة لتقنيات إعادة التركيب:

1. أصل التكرار (ORI). يجب أن يكونوا قادرين على تكرار أنفسهم وإلا فلن يكون لهم أي فائدة عملية كناقل.

2. علامة اختيار. يجب أن يكون لديهم علامة حتى تتمكن من تحديد الخلايا التي تحتوي على البلازميدات الخاصة بك.

3. تقييد مواقع الإنزيم في المناطق غير الأساسية. أنت لا تريد قطع البلازميد الخاص بك في المناطق الضرورية مثل ORI.

بالإضافة إلى هذه المتطلبات الضرورية ، هناك بعض العوامل التي تجعل البلازميدات أكثر فائدة أو أسهل في العمل معها.

1. صغير. إذا كانت صغيرة ، فمن الأسهل عزلها (تحصل على المزيد) ، والتعامل معها (قص أقل) ، وتحويلها.

2. مواقع إنزيم تقييد متعددة. تمنحك المزيد من المواقع مرونة أكبر في الاستنساخ ، وربما تسمح أيضًا بالاستنساخ الاتجاهي.

3. تعدد ORIs. من المهم ملاحظة أن جينين يجب أن يكون لهما ORIs مختلفة إذا كان سيتم إدخالهما في نفس البلازميد.


شاهد الفيديو: دراسة علمية لناشيونال جيوغرافيك اتبتت أن نسبة العرب أقل من 4 في المائة في شمال افريقيا (كانون الثاني 2022).