معلومة

ما هي الآلية المسؤولة عن "التأخير" في تأخر قنوات البوتاسيوم المعدل؟


لقد كنت أحاول العثور على تفسير شامل بشأن طبيعة "التأخير" في قنوات البوتاسيوم المعدل المتأخر للخلايا العصبية. كما هو مكتوب في مقدمة كتابي في علم الأعصاب ، فإن هذه القنوات هي بوابات ذات جهد كهربائي ويتم تنشيطها عندما يصل الغشاء العصبي النموذجي إلى جهد كهربائي تقريبًا. -40 ميللي فولت. أثناء تنشيط القناة في هذه المرحلة ، يتم فتحها فقط بعد فترة تأخير تبلغ حوالي 1 مللي ثانية.

أحاول في الغالب توضيح أن هذا ليس ارتباكًا في الصياغة وأن المقومات المتأخرة لا يتم تنشيطها فعليًا عندما يصل الغشاء الداخلي إلى شحنة تبلغ حوالي + 40 مللي فولت والتي ستكون مرتبطة (على الأقل في أمثلة الكتب المدرسية) بـ ' تأخير قدره 1 مللي ثانية '، ولكنه ناتج عن الشحنة النموذجية الفعلية التي لوحظت عند حوالي 1 مللي ثانية من التأخير أثناء احتمال الفعل.

شكرا جزيلا. اسمحوا لي أن أعرف إذا كان بإمكاني توضيح شيء ما. أعلم أن هذا لم يكن بالضرورة سؤالًا جيدًا


هذه القنوات بطيئة في الاستجابة. بعد إزالة الاستقطاب ، يتم تنشيطها ، ولكن بعد وقت طويل نسبيًا. كما أن حركتها الختامية بطيئة نسبيًا. يتم إعطاء تعريف هنا.


الصرع والتشوهات السلوكية العصبية في الفئران ذات المتغير الممرض السائد KCNB1 السلبي

الاعتلال الدماغي النمائي والصرع (DEE) هو مجموعة من الصرع الشديد الذي يصاحب عادةً نوبات مستعصية وتأخر في النمو وغالبًا ما يكون لها مخاطر عالية للوفاة المبكرة. تم تحديد العديد من الجينات كسبب أحادي الجين لـ DEE ، بما في ذلك KCNB1. قناة البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي Kالخامس2.1 ، المشفر بواسطة KCNB1 ، مسؤول بشكل أساسي عن تيارات البوتاسيوم المتأخرة التي تعد منظمات مهمة للإثارة في الخلايا القابلة للاستثارة كهربائيًا ، بما في ذلك الخلايا العصبية. بالإضافة إلى دورها الأساسي كموصلية للبوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي ، Kالخامس2.1 يخدم أيضًا وظيفة هيكلية محفوظة للغاية تنظم تقاطعات الغشاء الشبكي والبلازمي المتجمعة في سوما والتشعبات القريبة من الخلايا العصبية. تم التعرف على المتغير الممرض من نوع de novo KCNB1-p.G379R في رضيع مصاب بتشنجات صرع ونوبات ونوبات بؤرية ونوبات صرع ارتجاجية كانت مقاومة للعلاج بالأدوية القياسية المضادة للصرع. أظهر العمل السابق وجود عجز في توصيل البوتاسيوم ، لكنه لم يقم بتقييم الوظائف غير الموصلة. لتحديد ما إذا كان متغير G379R قد أثر على K.الخامس2.1 التكتل عند تقاطعات الغشاء الشبكي والبلازما الإندوبلازمية ، K.الخامستم التعبير عن 2.1-G379R في خلايا HEK293T. كالخامسلم يتسبب التعبير 2.1-G379R في تكوين تقاطعات غشاء بلازما شبكية إندوبلازمية ، والتعبير المشترك عن Kالخامس2.1-G379R مع K.الخامس2.1-wild-type تحريض منخفض لهذه الهياكل بالنسبة لـ K.الخامس2.1-WT وحده ، بما يتفق مع التأثير السلبي السائد. لنمذجة هذا المتغير في الجسم الحي ، قدمنا ​​Kcnb1 G379R في الفئران باستخدام تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. وصفنا التعبير العصبي والأنماط الظاهرية العصبية والسلوكية العصبية للفئران Kcnb1 G379R / + (Kcnb1 R / +) و Kcnb1 G379R / G379R (Kcnb1 R / R). كشفت دراسات الكيمياء المناعية على أدمغة Kcnb1 + / + و Kcnb1 R / + و Kcnb1 R / R عن اختلافات تعتمد على النمط الجيني في مستويات التعبير عن Kالخامس2.1 بروتين ، وكذلك المرتبط Kالخامس2.2 وبروتينات أميجو -1. أظهرت الفئران Kcnb1 R / + و Kcnb1 R / R فرط نشاط عميق وسلوكيات متكررة واندفاع وتقليل القلق. لوحظت نوبات عفوية في الفئران Kcnb1 R / R ، وكذلك النوبات الناجمة عن التعرض لبيئات جديدة و / أو المناولة. كان كل من طفرات Kcnb1 R / + و Kcnb1 R / R أكثر عرضة للنوبات التي يسببها التشنج. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر كل من الفئران Kcnb1 R / + و Kcnb1 R / R نشاطًا غير طبيعي بين النشبات ، بما في ذلك الارتفاع المعزول والموجات البطيئة. بشكل عام ، تلخص الفئران Kcnb1 G379R العديد من الميزات التي لوحظت في الأفراد المصابين بـ DEE بسبب المتغيرات المسببة للأمراض في KCNB1. سيكون نموذج الفأر الجديد من DEE المرتبط بـ KCNB1 ذا قيمة لتحسين فهم الفيزيولوجيا المرضية الأساسية وسيوفر أداة قيمة لتطوير العلاجات لعلاج DEE المقاوم للصيدلة.

الكلمات الدالة: اضطراب طيف التوحد اضطراب النمو اعتلال الدماغ الصرع K (V) 2.1 القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي قنوات البوتاسيوم ذات البوابات الجهدية.

حقوق النشر © 2020 المؤلف (المؤلفون). تم النشر بواسطة Elsevier Inc. جميع الحقوق محفوظة.

بيان تضارب المصالح

إعلان تضارب المصالح

الأرقام

توليد والتوصيف الجزيئي لـ ...

التوليد والتوصيف الجزيئي لـ Kcnb1 G379R الفئران. أ) موقع الجلايسين 379 في ...

طفرة G379R تعطل K. الخامس…

طفرة G379R تعطل K. الخامس 2.1 التعيين بوساطة VAPA لتقاطعات ER-PM في ...

التعبير عن Kcnb1 نسخة و ...

التعبير عن Kcnb1 نسخة و K. الخامس 2.1 بروتين Kcnb1 G379R و…

المناعية من K. الخامس 2 مجمعات القناة في Kcnb1 G379R أقسام الدماغ و ...

تشوهات Ictal EEG في Kcnb1 ...

تشوهات Ictal EEG في Kcnb1 الفئران G379R. أ) ممثل آثار EEG من Kcnb1 ...

تشوهات EEG الداخلية في Kcnb1 ...

تشوهات EEG الداخلية في Kcnb1 الفئران G379R. أ - ج) آثار EEG التمثيلية من WT ، ...

الأنماط الظاهرية العصبية والسلوكية العصبية في ...

الأنماط الظاهرية العصبية والسلوكية العصبية في Kcnb1 G379R و Kcnb1 خ / + الفئران. أ)…


المقدمة

تحتوي قنوات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد على أربع وحدات فرعية ، تحتوي كل منها على مستشعر جهد (MacKinnon 1991). وقد ركز ذلك الانتباه على كيفية اقتران مستشعرات الجهد الأربعة المنفصلة بفتح القناة (راجعه Bezanilla و Stefani 1994 Sigworth 1993). اقترح نموذج Hodgkin and Huxley الأصلي (1952) للمعدل المتأخر توصيل البوتاسيوم لمحور الحبار أن مستشعرات الجهد متطابقة وتعمل بشكل مستقل ، والقناة مفتوحة إذا ، وفقط إذا ، كانت جميع مستشعرات الجهد الأربعة في وضع التنشيط. لا تزال شكليات هودجكين-هكسلي مستخدمة على نطاق واسع لوصف حركية التيارات الأيونية لنماذج النشاط الكهربائي للخلايا العصبية.

ومع ذلك ، فقد قدمت الدراسات التي أجريت على قنوات البوتاسيوم المستنسخة المعبر عنها في أنظمة غير متجانسة أدلة وافرة على سمات البوابات التي لا يمكن وصفها بواسطة نماذج Hodgkin-Huxley (Koren et al. 1990 Sigworth 1993 Stefani et al. 1994 Zagotta and Aldrich 1990 Zagotta et al. 1994a ). على وجه الخصوص ، يبدو أن فتح القناة ينطوي على أكثر من حركة مستشعر الجهد. تتطلب معظم الموديلات الحديثة تنشيط جميع أجهزة استشعار الجهد الأربعة قبل فتح القناة (Sigworth 1993 Stefani et al. 1994 Zagotta et al. 1994a). آلية بديلة ، تعتمد على نموذج Monod-Wyman-Changeux الكلاسيكي (MWC) للبروتينات الخيفية (Monod et al. 1965) ، وهي أن القنوات يمكن أن تفتح مع تنشيط أي عدد من مستشعرات الجهد ، ولكن تنشيط كل مستشعر للجهد يفضل فتح القناة بكمية ثابتة من الطاقة (ماركس وجونز 1992). التفسير المادي هو أن حركة مستشعر الجهد هي تغيير توافقي محلي داخل وحدة فرعية واحدة ، وفتح القناة هو انتقال منسق يتضمن بروتين القناة بالكامل.

من المهم اختبار هذه الأفكار المتعلقة ببوابة القنوات على القنوات المحلية التي يتم التعبير عنها فعليًا في الخلايا العصبية. نورد هنا دراسة عن حركية تنشيط المعدل المتأخر للخلايا العصبية المتعاطفة مع الضفدع. تمت دراسة تيارات البوتاسيوم على نطاق واسع في هذه الخلايا ، وتم وضع إجراءات لعزل المعدل المتأخر (Adams et al. 1982a Goh et al. 1989 ، 1992 Lancaster and Pennefather 1987). تسمح هذه الخلايا المستديرة متساوية الجهد بمشبك جهد خلية كامل عالي الجودة. على وجه الخصوص ، يمكن دراسة حركية المعدل المتأخر بدقة على مدى واسع من الجهد ، حيث أن ثوابت الوقت & gt1 مللي ثانية من -100 إلى +100 مللي فولت. هذا مهم ، لأن سلوك ثوابت المعدل عند الفولتية القصوى يمكن أن يكون حاسمًا لتمييز النماذج (Chen and Hess 1990 Koren et al. 1990).

قارنا أربع فئات من النماذج الحركية: نماذج MWC ونماذج Hodgkin و Huxley (1952) والنماذج القائمة على Zagotta و Aldrich (1990) و Koren et al. (1990) ، ونموذج C-C-C-O مع ثوابت المعدل التعسفي. فضلت المعايير الإحصائية الموضوعية (Horn 1987) ، جنبًا إلى جنب مع بعض الاعتبارات النوعية ، نسخة من نموذج MWC حيث تكون الحالة الوحيدة التي تقوم بالفعل بتوصيل الأيونات هي الحالة "المفتوحة" مع تنشيط جميع مستشعرات الجهد الأربعة (McCormack et al. 1994). البيانات عند الفولتية شديدة الاستقطاب ، وخاصة مراقبة الحد صافتح = 0.8 من تحليل الضوضاء في البقع المتصلة بالخلية ، كانت حاسمة في التمييز بين النماذج. العديد من المعلمات في النموذج المفضل (تسمى هنا MWC-O4) كانت مشابهة لتلك المستخدمة سابقًا لوصف حركية قنوات الكالسيوم (Marks and Jones 1992) ، لكن الانتقال الفوري المغلق كان أبطأ بكثير لقناة البوتاسيوم.


Β1- تؤثر الأجسام المضادة لمستقبلات الأدرينوس على المدة المحتملة للعمل ومعدل تأخر تيارات البوتاسيوم في خنازير غينيا

β1-الأجسام المضادة للمستقبلات الأدرينية (β1-AAs) تؤثر على مدة العمل المحتملة (APD) في خلايا عضلة القلب وترتبط بعدم انتظام ضربات القلب البطيني. تيار البوتاسيوم المتأخر المعدل (أنا ك) يلعب دورًا مهمًا في اضطراب APD ، لكن تأثيرات β1-AAs في أنا ك لم تكن مضاءة بالكامل. يهدف هذا العمل إلى مراقبة آثار β1-AAs في أنا ك و APD واستكشاف آليات β1- عدم انتظام ضربات القلب البطيني بوساطة AA. β1- تم الحصول عليها من مصل مرضى القلب التاجي (CHD) وعدم انتظام دقات القلب البطيني غير المستدام. باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة ، وإمكانات العمل و أنا ك كان مسجلا. أظهرت النتائج 0.1 ميكرولتر / لتر β1-AAs تقصير APD عند 50٪ (APD50) و 90٪ (APD90) من عودة الاستقطاب. ومع ذلك ، عند 0.01 ميكرولتر / لتر ، β1-AAs لم يكن لها أي آثار على أي من APD90 أو APD50 (ص & GT 0.05). عند 0.001 ميكرولتر / لتر ، β1-AAs مطول بشكل ملحوظ APD90 و APD50. علاوة على ذلك ، β1-AAs (0.001 ، 0.01 ، 0.1 ميكرول / لتر) زادت الجرعة اعتمادًا على تيار البوتاسيوم المتأخر التنشيط السريع (أنا كر) ، ولكنه انخفض بالمثل من تيار البوتاسيوم المتأخر التنشيط ببطء (أنا ك) وزيادة تيارات الكالسيوم من النوع L بتركيزات مختلفة. مجتمعة ، فإن أناإن زيادة Kr الناجم عن تركيزات β1-AA العالية مسؤولة عن انخفاض APD بشكل كبير والذي من شأنه أن يساهم في تغييرات عودة الاستقطاب ويؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب الخبيث في مرضى أمراض الشرايين التاجية.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


تعمل قنوات البوتاسيوم على توصيل أيونات البوتاسيوم إلى أسفل تدرجها الكهروكيميائي ، وذلك بسرعة (وصولاً إلى معدل انتشار أيونات K + في المياه السائبة) وانتقائيًا (باستثناء ، على وجه الخصوص ، الصوديوم على الرغم من اختلاف أنجستروم الفرعي في نصف القطر الأيوني). [4] من الناحية البيولوجية ، تعمل هذه القنوات على ضبط أو إعادة ضبط إمكانات الراحة في العديد من الخلايا. في الخلايا القابلة للإثارة ، مثل الخلايا العصبية ، يعمل التدفق المعاكس المتأخر لأيونات البوتاسيوم على تشكيل جهد الفعل.

من خلال المساهمة في تنظيم المدة المحتملة لعمل القلب في عضلة القلب ، قد يتسبب خلل في قنوات البوتاسيوم في حدوث اضطرابات نظم القلب التي تهدد الحياة. قد تشارك قنوات البوتاسيوم أيضًا في الحفاظ على توتر الأوعية الدموية.

كما أنها تنظم العمليات الخلوية مثل إفراز الهرمونات (على سبيل المثال، إفراز الأنسولين من خلايا بيتا في البنكرياس) لذلك يمكن أن يؤدي خللها إلى أمراض (مثل مرض السكري).

بعض السموم ، مثل السموم السموم ، قوية لأنها تمنع قنوات البوتاسيوم. [5]

هناك أربع فئات رئيسية من قنوات البوتاسيوم:

    - يفتح استجابة لوجود أيونات الكالسيوم أو جزيئات التأشير الأخرى. - يمر التيار (شحنة موجبة) بسهولة أكبر في الاتجاه الداخلي (في الخلية). - تكون منفتحة بشكل أساسي أو تمتلك تنشيطًا قاعديًا عاليًا ، مثل "قنوات البوتاسيوم المريحة" أو "قنوات التسرب" التي تحدد إمكانات الغشاء السلبية للخلايا العصبية. - هي قنوات أيونية ذات جهد كهربائي تفتح أو تغلق استجابة للتغيرات في الجهد الغشائي.

يحتوي الجدول التالي على مقارنة بين الفئات الرئيسية لقنوات البوتاسيوم مع أمثلة تمثيلية (للحصول على قائمة كاملة بالقنوات داخل كل فئة ، راجع صفحات الفصل المعنية).

لمزيد من الأمثلة على المُعدِّلات الدوائية لقنوات البوتاسيوم ، راجع مانع قنوات البوتاسيوم وفتاحة قنوات البوتاسيوم.

  • تثبيط استجابة لارتفاع الكالسيوم داخل الخلايا
    , [7][8][9][6][10][11][6]
  • بعض أنواع السم الديندروتوكسين من سم ثعبان مامبا ، [6]
  • BKكاليفورنيا-محدد
      [12][13]
    • 1-EBIO
    • NS309
    • CyPPA
    • BKكاليفورنيا-محدد:
      الأشعة تحت الحمراء1.1)
    • إعادة تدوير وإفراز البوتاسيوم في النيفرون
    • غير انتقائي:
      • Ba 2+، [14]
      • Cs + [15]
        الأشعة تحت الحمراء3.x)
      • التوسط في التأثير المثبط للعديد من GPCRs
        [16][17][18][19][20][6][21][14]
        [22]
        الأشعة تحت الحمراء6.x)
      • يُغلق عندما يكون ATP مرتفعًا لتعزيز إفراز الأنسولين
        [بحاجة لمصدر] [بحاجة لمصدر] [بحاجة لمصدر] [23][6] [بحاجة لمصدر] [بحاجة لمصدر] [24] [بحاجة لمصدر] [بحاجة لمصدر]
      • TWIK (TWIK-1 ، TWIK-2 ، KCNK7) [25] [26]
      • TREK (TREK-1 ، TREK-2 ، TRAAK [27]) [25] [26]
      • المهمة (TASK-1 ، TASK-3 ، TASK-5) [25] [26]
      • TALK (TASK-2 ، [28] TALK-1 ، TALK-2) [25] [26]
      • THIK (THIK-1، THIK-2) [25] [26] [25] [26] [29] [30]
      • المساهمة في الراحة المحتملة
        [31][32][33][34][32][35][36][37][38][39] [بحاجة لمصدر] [40][40]
      • تم تعديله بواسطة منبهات ومناهضات GPCR ، [6]
      • لا توجد حاصرات انتقائية ، [6]
        [32][41][42]
      • التخدير المتطاير ، على سبيل المثال إيزوفلورين [6]
      • تم تعديله بواسطة ناهضات ومناهضات GPCR ، [6]
        الخامس11.1) (K.الخامس7.1)
        عودة الاستقطاب
      • يحد من تواتر إمكانات العمل (الاضطرابات تسبب خلل في ضربات القلب)
        [43][44][6][45][46][47][6]
      • هيرج (KCNH2 ، كالخامس11.1) - محدد:
          [بحاجة لمصدر] [48] [بحاجة لمصدر]
        • [بحاجة لمصدر]
        • KCNQ (K.الخامس7) -محددة:الخامس7) [49]

        تحتوي قنوات البوتاسيوم على هيكل رباعي حيث ترتبط أربع وحدات فرعية متطابقة من البروتين لتشكيل أربعة أضعاف متماثل (C4) مركب مرتب حول مسام موصلة للأيونات المركزية (أي مقياس متماثل). بدلاً من ذلك ، قد ترتبط أربع وحدات فرعية بروتينية مرتبطة ولكن ليست متطابقة لتشكيل مجمعات غير متجانسة مع C الزائف4 تناظر. تحتوي جميع الوحدات الفرعية لقناة البوتاسيوم على بنية حلقة مسامية مميزة تبطن الجزء العلوي من المسام وهي مسؤولة عن نفاذية البوتاسيوم الانتقائية.

        هناك أكثر من 80 جينًا للثدييات تقوم بتشفير الوحدات الفرعية لقناة البوتاسيوم. ومع ذلك ، تعد قنوات البوتاسيوم الموجودة في البكتيريا من بين أكثر القنوات الأيونية دراسة من حيث التركيب الجزيئي. باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية ، [50] [51] تم الحصول على رؤى عميقة حول كيفية مرور أيونات البوتاسيوم عبر هذه القنوات ولماذا لا تمر أيونات الصوديوم (الأصغر). [52] تم منح جائزة نوبل للكيمياء لعام 2003 إلى رود ماكينون لعمله الرائد في هذا المجال. [53]

        تحرير مرشح الانتقائية

        تقوم قنوات أيون البوتاسيوم بإزالة غلاف الترطيب من الأيونات عندما يدخل مرشح الانتقائية. يتكون مرشح الانتقائية من تسلسل خمسة بقايا ، TVGYG ، يسمى تسلسل التوقيع ، داخل كل من الوحدات الفرعية الأربع. يقع تسلسل التوقيع هذا داخل حلقة بين اللولب المسامي و TM2 / 6 ، والتي يطلق عليها تاريخياً الحلقة P. يتم حفظ تسلسل التوقيع هذا بشكل كبير ، باستثناء أن بقايا فالين في قنوات البوتاسيوم بدائية النواة غالبًا ما يتم استبدالها ببقايا إيزوليوسين في قنوات حقيقية النواة. يتبنى هذا التسلسل بنية سلسلة رئيسية فريدة من نوعها ، مماثلة من الناحية الهيكلية لعنصر بنيوي لبروتين العش. يتم محاذاة المجموعات الأربع من ذرات الأكسجين الكربوني الكهربية تجاه مركز مسام المرشح وتشكل مربعًا مضادًا للمنشور يشبه غلافًا مذيبًا للماء حول كل موقع ربط للبوتاسيوم. المسافة بين أكسجين الكربونيل وأيونات البوتاسيوم في مواقع الربط لمرشح الانتقائية هي نفسها بين أكسجين الماء في غلاف الترطيب الأول وأيون البوتاسيوم في محلول الماء ، مما يوفر طريقًا مواتًا بقوة لإذابة الأيونات . ومع ذلك ، فإن أيونات الصوديوم صغيرة جدًا بحيث لا تملأ الفراغ بين ذرات الأكسجين الكربوني. وبالتالي ، فمن المفضل بقوة أن تظل أيونات الصوديوم مرتبطة بجزيئات الماء في الفضاء خارج الخلية ، بدلاً من المرور عبر مسام الأيونات الانتقائية للبوتاسيوم. [55] يبدو أن هذا العرض يتم الحفاظ عليه من خلال الرابطة الهيدروجينية وقوى فان دير فالس داخل ورقة من بقايا الأحماض الأمينية العطرية المحيطة بالمرشح الانتقائي. [50] [56] يفتح المرشح الانتقائي باتجاه المحلول خارج الخلية ، ويعرض أربعة أكسجين كربونيل في بقايا جلايسين (Gly79 في KcsA). البقايا التالية تجاه الجانب خارج الخلية من البروتين هي Asp80 سالبة الشحنة (KcsA). تشكل هذه البقايا مع بقايا المرشح الخمسة المسام الذي يربط التجويف المملوء بالماء في وسط البروتين بالمحلول خارج الخلية. [57]

        آلية الانتقائية تحرير

        لا تزال آلية انتقائية قناة البوتاسيوم قيد المناقشة المستمرة. وأكسجين الكربونيل سالب بشدة للكهرباء وجذاب للكاتيون. يمكن أن يستوعب المرشح أيونات البوتاسيوم في 4 مواقع تحمل عادةً S1 إلى S4 بدءًا من الجانب خارج الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لأيون واحد أن يرتبط في التجويف في موقع يسمى SC أو واحد أو أكثر من الأيونات في الجانب خارج الخلية في مواقع محددة جيدًا أو أكثر تسمى S0 أو Sext. من الممكن حدوث العديد من الوظائف المختلفة لهذه المواقع. نظرًا لأن هياكل الأشعة السينية هي متوسطات على العديد من الجزيئات ، فليس من الممكن ، مع ذلك ، استنتاج الإشغال الفعلي مباشرة من مثل هذا الهيكل. بشكل عام ، هناك بعض العيوب بسبب التنافر الإلكتروستاتيكي حيث تشغل الأيونات موقعين متجاورين. تم تقديم مقترحات لآلية الانتقائية بناءً على محاكاة الديناميكيات الجزيئية ، [58] نماذج لعبة لربط الأيونات ، [59] حسابات الديناميكا الحرارية ، [60] اعتبارات طوبولوجية ، [61] [62] والاختلافات الهيكلية [63] بين الانتقائي والقنوات غير الانتقائية.

        تمت دراسة آلية إزاحة الأيونات في KcsA على نطاق واسع من خلال الحسابات النظرية والمحاكاة. [57] [64] تم تأكيد التنبؤ بآلية التوصيل الأيوني حيث تلعب الحالتان المشغولتان بشكل مزدوج (S1 ، S3) و (S2 ، S4) دورًا أساسيًا من خلال كلا التقنيتين. تقترح محاكاة الديناميكيات الجزيئية (MD) حالتين خارج الخلية ، S.تحويلة و S.0، والأيونات العاكسة التي تدخل وتخرج من المرشح ، هي أيضًا عوامل مهمة في التوصيل الأيوني.

        تحرير منطقة كارهة للماء

        تُستخدم هذه المنطقة لتحييد البيئة المحيطة بأيون البوتاسيوم بحيث لا تنجذب إلى أي شحنات. بدوره ، فإنه يسرع رد الفعل.

        تحرير التجويف المركزي

        يقع المسام المركزي ، بعرض 10 ، بالقرب من مركز قناة الغشاء ، حيث يكون حاجز الطاقة أعلى للأيونات المستعرضة بسبب الكراهية المائية لجدار القناة. يسهل التجويف المملوء بالماء والنهاية القطبية C من حلزونات المسام الحاجز النشط للأيون. يُعتقد أن التنافر الذي يسبق أيونات البوتاسيوم المتعددة يساعد في إنتاج الأيونات. يمكن فهم وجود التجويف بشكل حدسي على أنه إحدى آليات القناة للتغلب على حاجز العزل الكهربائي ، أو التنافر بواسطة الغشاء منخفض العزل ، عن طريق الحفاظ على أيون K + في بيئة مائية عالية العزل.

        يتم تنظيم تدفق الأيونات عبر مسام قناة البوتاسيوم من خلال عمليتين مترابطتين ، تسمى التبويض والتعطيل. البوابة هي فتح أو إغلاق القناة استجابةً للمنبهات ، بينما التعطيل هو التوقف السريع للتيار من قناة البوتاسيوم المفتوحة وقمع قدرة القناة على استئناف التوصيل. بينما تعمل كلتا العمليتين على تنظيم تصرف القناة ، يمكن التوسط في كل عملية من خلال عدد من الآليات.

        بشكل عام ، يُعتقد أن البوابة تتم بوساطة مجالات هيكلية إضافية تستشعر المنبهات وبالتالي تفتح مسام القناة. تتضمن هذه المجالات مجالات RCK لقنوات BK ، [65] [66] [67] ومجالات استشعار الجهد لقنوات K + ذات البوابات. يُعتقد أن هذه المجالات تستجيب للمنبهات عن طريق فتح البوابة داخل الخلايا لمجال المسام ، مما يسمح لأيونات البوتاسيوم باجتياز الغشاء. تحتوي بعض القنوات على مجالات تنظيمية متعددة أو بروتينات ملحقة ، والتي يمكن أن تعمل على تعديل الاستجابة للتحفيز. بينما لا تزال الآليات موضع نقاش ، هناك هياكل معروفة لعدد من هذه المجالات التنظيمية ، بما في ذلك مجالات RCK من بدائيات النواة [68] [69] [70] وحقيقية النواة [65] [66] [67] قنوات ، ومجال بوابات الأس الهيدروجيني من KcsA ، [71] مجالات بوابات النوكليوتيدات الحلقية ، [72] وقنوات البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي. [73] [74]

        عادةً ما يكون تعطيل النوع N هو آلية التعطيل الأسرع ، ويطلق عليه نموذج "الكرة والسلسلة". [75] يتضمن التثبيط من النوع N تفاعل الطرف N للقناة ، أو البروتين المرتبط به ، والذي يتفاعل مع مجال المسام ويغلق مسار التوصيل الأيوني مثل "الكرة". بدلاً من ذلك ، يُعتقد أن تعطيل النوع C يحدث داخل مرشح الانتقائية نفسه ، حيث تجعله التغييرات الهيكلية داخل المرشح غير موصل. هناك عدد من النماذج الهيكلية لمرشحات قناة K + المعطلة من النوع C ، [76] [77] [78] على الرغم من أن الآلية الدقيقة لا تزال غير واضحة.

        تحرير الحاصرات

        تمنع حاصرات قنوات البوتاسيوم تدفق أيونات البوتاسيوم عبر القناة. إما أنها تتنافس مع ربط البوتاسيوم داخل مرشح الانتقائية أو ترتبط خارج المرشح لإغلاق التوصيل الأيوني. أحد الأمثلة على أحد هذه المنافسات هو أيونات الأمونيوم الرباعية ، والتي ترتبط بالوجه خارج الخلية [79] [80] أو التجويف المركزي للقناة. [81] للحظر من التجويف المركزي تُعرف أيونات الأمونيوم الرباعية أيضًا باسم حاصرات القنوات المفتوحة ، حيث يتطلب الربط الكلاسيكي الفتح المسبق للبوابة السيتوبلازمية. [82]

        يمكن أن تحجب أيونات الباريوم أيضًا تيارات قناة البوتاسيوم ، [83] [84] من خلال الارتباط مع التقارب العالي داخل المرشح الانتقائي. [85] [86] [87] [88] يُعتقد أن هذا الارتباط المحكم يكمن وراء سمية الباريوم عن طريق تثبيط نشاط قناة البوتاسيوم في الخلايا القابلة للاستثارة.

        تم فحص حاصرات قنوات البوتاسيوم طبيًا ، مثل 4-أمينوبيريدين و 3،4-ديامينوبيريدين ، لعلاج حالات مثل التصلب المتعدد. [89] يمكن أن تؤدي تأثيرات العقاقير غير المستهدفة إلى متلازمة لونغ كيو تي التي يسببها الدواء ، وهي حالة قد تهدد الحياة. هذا في أغلب الأحيان بسبب التأثير على قناة البوتاسيوم hERG في القلب. وفقًا لذلك ، يتم اختبار جميع الأدوية الجديدة قبل السريرية للتأكد من سلامة القلب.

        المنشطات تحرير

        يتم تنشيط بعض أنواع قنوات البوتاسيوم بواسطة المستقبلات المسكارينية وتسمى هذه قنوات البوتاسيوم المسكارينية (أناكاتش). هذه القنوات عبارة عن مغاير مغاير تتكون من وحدتين GIRK1 واثنين من الوحدات الفرعية GIRK4. [90] [91] ومن الأمثلة على ذلك قنوات البوتاسيوم في القلب ، والتي ، عند تنشيطها عن طريق إشارات السمبتاوي من خلال مستقبلات M2 المسكارينية ، تسبب تيارًا خارجيًا من البوتاسيوم ، مما يؤدي إلى إبطاء معدل ضربات القلب. [92] [93]

        بتكليف من رودريك ماكينون ولادة فكرة، تمثال بطول 5 أقدام (1.5 م) يعتمد على قناة البوتاسيوم KcsA. [94] يحتوي العمل الفني على كائن سلكي يمثل الجزء الداخلي للقناة مع جسم زجاجي منفوخ يمثل التجويف الرئيسي لهيكل القناة.


        المواد والأساليب

        عزل الخلية ، ثقافة الخلية وترنسفكأيشن الخلية مع KCNQ1 / KCNE1 و Kir6.2 / SUR1

        تم الحصول على خلايا مفردة من قلب خنازير غينيا باستخدام طريقة التفكك الأنزيمي كما هو موضح سابقًا (Bar & # x000f3 and Escande ، 1989). تم تعديل تركيز الإنزيم المستخدم ليعطي فعالية 350 & # x000a0U / ml للكولاجيناز (النوع الأول سيجما) و 0.61 & # x000a0U / ml للبروتياز (النوع الرابع عشر سيجما).

        تم الحصول على خط الخلية COS-7 المشتق من الكلى الأفريقي الأخضر من مجموعة American Type Culture Collection (Rockville ، MD) وتم تربيته في وسط Dulbecco & # x02019s المعدل النسر & # x02019s المضاف إليه 10 & # x00025 مصل العجل الجنيني والمضادات الحيوية (100 & # x000a0IU / مل البنسلين و 100 & # x000a0 & # x000b5g / ml الستربتومايسين كلها من جيبكو ، بيزلي ، المملكة المتحدة) عند 37 & # x000b0C في حاضنة مرطبة. تم تربيتهم بشكل منتظم عن طريق العلاج الأنزيمي. تم نقل الخلايا عندما تصل الثقافة إلى 60 & # x0201380 & # x00025 التقاء ، مع البلازميدات (2 & # x000a0 & # x000b5g لكل مل من وسط الثقافة) مع JetPEI (Polyplus-transfection ، ستراسبورغ ، فرنسا) ، وفقًا للبروتوكول القياسي الموصى به من قبل الصانع. تم استنساخ KCNQ1 البشري و KCNE1 cDNAs في ناقل تعبير الثدييات ، pCI و pCR ، على التوالي (Promega ، Madison ، WI) تحت سيطرة محسن / مروج للفيروس المضخم للخلايا. الماوس pCMV-Kir6.2 (Inagaki وآخرون. ، 1995) والهامستر pECE-SUR1 المستنسخة من قبل S Seino و CG Nichols ، على التوالي. تم شراء ترميز البلازميد للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، المستخدم لتحديد الخلايا المنقولة من Clontech. بالنسبة للقياس الحالي KCNQ1 / KCNE1 ، كان تكوين الحمض النووي النسبي 45 & # x00025 KCNQ1 / 45 & # x00025 KCNE1 / 10 & # x00025 GFP. بالنسبة للقياس الحالي لـ Kir6.2 / SUR1 ، كان تكوين الحمض النووي النسبي 30 & # x00025 Kir6.2 / 30 & # x00025 SUR1 / 40 & # x00025 GFP.

        الفيزيولوجيا الكهربية

        أربعة وعشرون إلى 72 & # x000a0h بعد ترنسفكأيشن ، تم تركيب خلايا COS-7 على مرحلة مجهر مقلوب وامتد باستمرار مع محلول Tyrode بمعدل 2 & # x000a0ml / min. سمح نظام الصهر الدقيق بالتطبيق المحلي والتغيير السريع للحلول التجريبية المختلفة. تم الحفاظ على درجة حرارة الحمام عند 22.0 & # x000a0 & # x000b1 1.0 & # x000b0C. تم سحب الماصات الدقيقة (مقاومة الطرف 0.8 & # x020131.5 & # x000a0M & # x003a9) من الزجاج ذي الجدران الرقيقة (Kimble Vineland ، NJ) على ساحب عمودي (P30 Sutter Instruments ، Co. ، Novato ، CA) ، مصقول بالنار ، وكهربائيًا متصل بمضخم صوت التصحيح & # x02013 clamp (RK-300 Biologic Science Intruments ، Claix ، فرنسا). تم إجراء التحفيز وتسجيل البيانات والتحليلات بواسطة Acquis1 ، وهو برنامج تم إنشاؤه بواسطة G & # x000e9rard Sadoc (تم توزيعه بواسطة Biologic Science Intruments) من خلال محول تناظري إلى رقمي (Tecmar TM100 Labmaster Scientific Solution ، سولون ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت دراسة المتهدمة لتيارات KCNQ1 / KCNE1 وكذلك حركيات التنشيط وإلغاء التنشيط باستخدام بروتوكول يتكون من خطوات الجهد غير المستقطب من إمكانية الاحتفاظ (& # x0201380 & # x000a0mV) إلى & # x0002b40 & # x000a0mV (1 & # x000a0s) ثم العودة إلى & # x0201340 & # x000a0mV (500 & # x000a0ms) ، كل 5 & # x000a0s. لتتناسب بشكل أفضل مع تيار التنشيط على شكل S ، استخدمنا نموذج Hodgkin و Huxley لتنشيط قناة البوتاسيوم المعتمدة على الجهد: Iك & # x0003d & # x0005b1 & # x02013 إكسب (& # x02013t / & # x003c4يمثل) & # x0005d 4 & # x000d7 أناالأعلى، مع & # x003c4يمثل ثابت التنشيط ، الوقت وأناالأعلى سعة تيار البوتاسيوم عندما تكون القنوات مفتوحة بالكامل (Hille ، 2001). تم الحصول على حركيات إلغاء التنشيط KCNQ1 / KCNE1 من خلال ملاءمة أحادية التكافؤ. لنصف إمكانات التنشيط (V0.5) ، تم تصعيد إمكانات الغشاء ، بزيادات قدرها 10 مللي فولت ، من إمكانية الاحتفاظ (& # x0201380 & # x000a0mV) إلى الفولتية المختلفة (إمكانات النبض) بين & # x02013100 و & # x0002b60 & # x000a0mV ، ثم تراجع مرة أخرى إلى & # x0201340 & # x000a0mV ، حيث تظهر التيارات الخلفية. تم الحصول على منحنى التنشيط من استقراء تيار الذيل إلى بداية خطوة الجهد لتجنب التلوث بالتيار السعوي وتثبيته على توزيع بولتزمان. تم قياس تيارات Kir6.2 / SUR1 بقدرة غشاء تبلغ & # x0201350 & # x000a0mV (جهد الماصة & # x0003d & # x0002b50 & # x000a0mV). تظهر التيارات الداخلية عند هذا الجهد كإشارات موجبة.

        تم وصف تصحيح الخلية الكاملة & # x02013 تحامل خلايا عضلة القلب مسبقًا (Bar & # x000f3 و Escande ، 1989). تم ترطيب الخلايا العضلية المعزولة باستمرار بمحلول Tyrode الذي تم الحفاظ عليه عند 35 & # x000a0 & # x000b1 1.0 & # x000b0C. تم سحب الماصات الدقيقة بشكل أضيق مما كانت عليه في التجارب الداخلية للحد من تخفيف MgATP داخل الخلايا في الماصة. كانت لديهم مقاومة طرف أعلى (1.5 & # x020134 & # x000a0M & # x003a9) عند ملؤها بالمحلول داخل الخلايا. يتم تقديم تجارب Patch & # x02013clamp كمتوسط ​​& # x000b1 SEM. تم تقييم الدلالة الإحصائية للتأثيرات المرصودة من قبل الطالب & # x02019s ر-اختبار. تم إجراء التحليل خارج الخط باستخدام برامج Acquis1 و Microsoft Excel. تم استخدام Microsoft Solver لاحتواء البيانات بواسطة خوارزمية المربعات الصغرى.

        النموذج الحركي لـ PIP2 تنظيم KCNE1 / KCNQ1

        تم إنشاء محاكاة تيارات KCNQ1 / KCNE1 أثناء المتهدمة من النموذج المقدم في الشكل & # x000a0 5 أ. تستند تيارات KCNQ1 / KCNE1 أثناء خطوة إزالة الاستقطاب إلى افتراض أن جميع مجالات S4 موجودة في & # x02018off & # x02019 التشكل (Cs4 قبالة & # x0003d 1، جs4 في & # x0003d 0 و O & # x0003d 0) في بداية خطوة إزالة الاستقطاب. يتم حساب تيارات الذيل KCNQ1 / KCNE1 أثناء إعادة الاستقطاب من قيمة Po التي تم الحصول عليها في نهاية خطوة إزالة الاستقطاب. فقط كPIP2 هو PIP2 تم اختيار المعتمد وقيمه خلال المتهدمة المحاكاة لتلائم بشكل أفضل الانخفاض في السعة الحالية القصوى عند 40 & # x000a0mV أثناء المتهدمة (راجع أسطورة الشكل & # x000a0 5). تم استخدام Microsoft Excel لإجراء محاكاة التيارات.


        الملخص

        خلفية أظهرت الدراسات التي أجريت على الحيوانات أن الكالسيوم 2+ Cl المنشط - الحالي (أناCl (كاليفورنيا)) وتيار التبادل Na + / Ca 2+ (أنانا / كاليفورنيا) المساهمة في التيار الداخلي العابر (أناتي). أناتي هو المسؤول عن اضطراب النظم المتأخر بعد الاستقطاب (DADs). لقد بحثنا في الآلية الأيونية لـ أناتي و DADs في خلايا القلب البشرية.

        الطرق والنتائج تم عزل الخلايا البطينية البشرية إنزيميًا من القلوب المستأصلة للمرضى الذين يعانون من قصور القلب في المرحلة النهائية ودُرست بمنهجية التصحيح. أناتيتم استنباط s في وجود 1 ميكرو مول / لتر من النوربينفرين بواسطة قطارات إزالة الاستقطاب المتكررة من -80 إلى +50 مللي فولت. تم تحفيز DADs في وجود 1 ميكرولتر / لتر نوربينفرين بتردد تحفيز قدره 1 هرتز. أناتي تم توجيه التيارات داخليًا على مدى الجهد بين −110 و + 50 مللي فولت. لا مانع قناة Cl 4،4′-diisothiocyanatostilbene-2،2′-disulfonic acid ولا تغييرات في [Cl -]أنا متأثر أناتي أو السعة DAD. هذا يستبعد دورا هاما ل أناCl (كاليفورنيا). حصار تبادل Na + / Ca 2+ عن طريق استبدال كل Na + خارج الخلية بواسطة Li + ، على العكس من ذلك ، ممنوع تمامًا أناتي. في الأرنب أناCl (كاليفورنيا) لم تختلف الكثافة في الخلايا البطينية المعزولة عن قلوب التحكم بشكل كبير عن تلك الموجودة في الخلايا البطينية المعزولة من القلوب الفاشلة.

        الاستنتاجات على عكس العديد من أنواع الحيوانات ، أناتي و DADs في خلايا البطين البشرية الناتجة عن فشل القلوب تتكون فقط من أنانا / كاليفورنيا. في الأرانب ، فشل القلب في حد ذاته لا يتغير أناCl (كاليفورنيا) الكثافة ، مما يوحي بذلك أناCl (كاليفورنيا) قد يكون أيضًا غائبًا أثناء DADs في خلايا البطين البشرية غير الفاشلة.

        المرضى الذين يعانون من قصور القلب الاحتقاني لديهم نسبة عالية من عدم انتظام ضربات القلب البطيني. 1 هم في خطر متزايد من الموت المفاجئ الناتج عن تسرع القلب البطيني والرجفان البطيني. 2 وقد ثبت مؤخرًا أن حالات عدم انتظام ضربات القلب هذه التي يحتمل أن تكون مميتة في المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب التوسعي مجهول السبب في نهاية المرحلة تنشأ في تحت الشغاف أو تحت القلبية بواسطة آلية بؤرية nonreentrant. 3 قد يلعب النشاط المحفز الذي ينشأ إما من الاستقطاب المبكر بعد الاستقطاب (EADs) أو المتأخر بعد الاستقطاب (DADs) دورًا محوريًا في بدء اضطرابات النظم هذه. 3

        الاستقطاب اللاحق هو "تذبذبات" في جهد الغشاء. تحدث EADs أثناء جهد الفعل ، بينما تحدث DAD بعد الانتهاء من جهد الفعل. 4 في الخلايا البطينية من قلوب الإنسان الفاشلة في المرحلة النهائية ، تعود المرحلة 2 من EADs إلى إعادة تنشيط تيار L-type Ca 2+. 5 حتى الآن ، تم التحقيق في آلية DADs في نماذج حيوانية فقط. أظهرت هذه الدراسات أن أمراض القلب والأوعية الدموية ناتجة عن ارتفاع معدل ضربات القلب في ظل الظروف التي [Ca 2+]أنا مرتفع. 6 يسمى التيار المسبب لـ DADs التيار الداخلي العابر (أناتي). 7 أناتي يتم تنشيطه عن طريق إطلاق Ca 2+ العفوي من الشبكة الساركوبلازمية (SR). 6 أناتي يثبت أنه تيار غير متجانس. يتدفق مكون واحد عبر قنوات الكاتيون غير الانتقائية. 8 الحالي بوساطة تبادل Na + / Ca 2+ (أنانا / كاليفورنيا) يشكل المكون الثاني. 9 في الآونة الأخيرة ، تم تحديد مكون ثالث. Evidence has accumulated that the Ca 2+ -activated Cl − current (أناCl(Ca)) also contributes to both أناti 10–12 and DADs. 13–15 We recently demonstrated in sheep heart cells that blockade of أناCl(Ca) reduced the DAD amplitude sufficiently to prevent 50% of the DADs from reaching the threshold for triggering action potentials. 14 This observation suggests that أناCl(Ca) blockade may be a promising therapeutic strategy in those instances in which DADs contribute to the genesis of arrhythmias that is, of course, only when أناCl(Ca) also plays a role in أناtis and DADs in human ventricular cells. In this article, we address this issue.

        Here, we report that أناti and DAD in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts are caused by أناNa/Ca فقط. Furthermore, we show that in a rabbit model, heart failure does not lead to disappearance of أناCl(Ca). Our results suggest that failing, and presumably also nonfailing, human ventricular cells do not possess أناCl(Ca) القنوات. Our findings question the rationale behind أناCl(Ca) blockade as a therapeutic approach in arrhythmias caused by triggered activity based on DADs.

        أساليب

        Cell Preparation

        Human Ventricular Cells

        Hearts were obtained from patients with end-stage heart failure caused by either ischemic or dilated cardiomyopathy. Patient characteristics are shown in the Table. All patients were in NYHA functional class IV and received standard therapy for chronic heart failure. Informed consent was obtained before heart transplantation, and the protocol complied with institutional guidelines. Ventricular cells were isolated from the left ventricle by enzymatic dissociation. 16

        Rabbit Ventricular Cells

        Heart failure was induced in New Zealand White rabbits by volume and pressure overload. 17 The heart failure index based on relative heart weight, relative lung weight, left ventricular end-diastolic pressure, third heart sound, and ascites was calculated as described previously. 17 We used only hearts of rabbits in which 4 of the aforementioned 5 parameters were abnormal. Age-matched animals served as control group. Animal care was in accordance with institutional guidelines. Cells from the left ventricle were isolated by enzymatic dissociation. 16 Cells isolated from failing hearts were significantly larger than control cells (301±53 pF [n=9] versus 110±37 pF [n=11]) and showed the well-known action potential prolongation.

        Recording Procedures

        Small aliquots of cell suspension were placed in a recording chamber on the stage of an inverted microscope and superfused with Tyrode’s solution (35°C to 37°C) containing (mmol/L) NaCl 140, KCl 5.4, CaCl2 1.8, MgCl2 1.0, glucose 5.5, and HEPES 5.0 (pH adjusted to 7.4 with NaOH).

        Membrane potentials and currents were recorded in the ruptured-patch whole-cell configuration of the patch-clamp technique. Patch pipettes (3 to 5 MΩ) were pulled from borosilicate glass and filled with solution containing either (mmol/L) potassium gluconate 125, KCl 20, and HEPES 10 (pH adjusted to 7.2 with KOH) or KCl 145 and HEPES 10 (pH adjusted to 7.2 with KOH). Potentials were corrected for the liquid junction potential. Membrane currents and potentials were low-pass filtered online with a cutoff frequency of 1 kHz and digitized at 2 kHz.

        Stimulation Protocols

        DADs and أناtis result from spontaneous SR Ca 2+ release in Ca 2+ -overloaded myocytes. 6 In our experiments, we induced sarcoplasmic Ca 2+ overload by application of 1 μmol/L norepinephrine (Centrafarm). DADs were induced by eliciting action potentials (1 Hz) with current pulses applied through the patch pipette. أناti was elicited by repeated trains of 15 to 20 200-ms voltage-clamp steps from −80 to +50 mV (Figure 1A). Time between the steps was 100 ms. Successive trains were 6 seconds apart.

        شكل 1. A, Voltage-clamp protocol for eliciting أناti. B, Current recording made during this protocol in a human ventricular cell. Arrow, أناti. Inset, Protocol for measuring أناti amplitude. C, Effects of 0.2 mmol/L tetracaine on occurrence of أناti (left) and DAD (right).

        During the first 5 to 6 successive voltage-clamp steps of a train, both the quasi steady-state current during the 200-ms depolarizing step and the inwardly directed “tail” current during the 100-ms repolarizing step increase until they reach a stable value (Figure 1B). Enhanced delayed rectifier current (أناك) و أناNa/Ca may underlie this phenomenon. 18 Both أناك و أناNa/Ca increase during a rise in [Ca 2+ ]أنا, 18,19 as occurs during the train of voltage-clamp steps. 6,20 The latter results from repeated activation of Ca 2+ current and the diminished Ca 2+ extrusion by the Na + -Ca 2+ exchanger. 6,20 Slow inactivation kinetics of أناك presumably also plays a role in the increase of the quasi steady-state current.

        After cessation of a train, all cells develop ≥1 أناti oscillations, typically within 3 seconds (Figure 1B, arrow). Every أناti was accompanied by a visible aftercontraction of the cell. The amplitude of أناti was measured as the difference between the peak of the transient current and mean current amplitude before and after the transient current (Figure 1B, inset). In case of successive أناti oscillations, the first one was taken for analysis.

        The effect of heart failure on أناCl(Ca) was studied in rabbit ventricular cells. أناCl(Ca) was elicited by depolarizing 500-ms voltage-clamp steps from a holding potential of −50 mV. The steps were applied once every 2 seconds and were incremented by 10 mV. أناCl(Ca) was defined as the transient outward current sensitive to the Cl − channel blocker 4,4′diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonic acid (DIDS Sigma Chemical Co). DIDS was prepared as 0.5-mol/L stock solution in DMSO (Merck) and diluted before use in Tyrode’s solution to a final concentration of 0.5 mmol/L. All currents were normalized for cell size as described previously. 14

        إحصائيات

        Action potential characteristics were derived from 10 consecutive action potentials and averaged. Microsoft Excel software was used for statistical analysis of the data. Values are expressed as mean±SEM and considered significantly different at a value of ص<0.05 in ANOVA or Student’s ر اختبار.

        نتائج

        In Human Ventricular Cells, أناti and DADs Are Caused by Spontaneous SR Ca 2+ Release

        We first asked the question whether in human ventricular cells أناti and DADs are activated by spontaneous SR Ca 2+ release. We tested the effects of 0.2 mmol/L tetracaine and 5 mmol/L caffeine, drugs known to inhibit spontaneous SR Ca 2+ release. 6,21 Both tetracaine (Figure 1C, n=3) and caffeine (n=4, data not shown) completely abolished أناti and DAD. From these experiments, we conclude that as in animal cells, in human ventricular cells أناti and DADs also are caused by spontaneous SR Ca 2+ release.

        No Role for a Cl − Current in أناti and DAD in Human Ventricular Cells

        Next, we investigated the currents contributing to أناti and DAD in human ventricular cells. We determined the current-voltage (I-V) relationship of أناti and its sensitivity to intracellular Cl − substitution. We reasoned that if أناCl(Ca) contributes to أناti, then a change in [Cl − ]أنا has to alter the أناti I-V relationship. We applied the aforementioned train protocol, but now directly followed by 17 voltage-clamp steps of 3-second duration and ranging from −110 to +50 mV with 10-mV increments (Figure 2A, inset). Figure 2A shows typical current traces recorded at the membrane potentials indicated. In this and 4 other experiments, the low-Cl − pipette solution was used. The corresponding Cl − reversal potential (ECl) was calculated at −50 mV, which is the physiological ECl value in cardiac cells. 22 For 4 other cells, the high-Cl − pipette solution was used, for which ECl was 0 mV. Figure 2B shows the I-V relationships of أناti measured with low and high [Cl − ]أنا. Irrespective of [Cl − ]أنا, أناti was inwardly directed at all potentials tested and had a maximal amplitude at approximately −70 mV. 2 أناti I-V relationships did not differ significantly. In accordance with this observation, we also found no significant effect of [Cl − ]أنا on DAD amplitude (Figure 2C). In fact, resting membrane potential and the duration and amplitude of the action potential also were not affected. From these experiments, we conclude that it is not likely that أناCl(Ca) contributes much to أناtis and DADs in failing human ventricular cells.

        الشكل 2. A, Typical example of voltage-dependence of أناti in human ventricular cells. Inset, Applied voltage-clamp protocol. أناti was measured at potentials between −110 and +50 mV. B, I-V relationship of أناti in human ventricular cells recorded with pipette solution containing high (n=4 ECl=0 mV) and low (n=5 ECl=−50 mV) Cl − . C, Action potential and DAD parameters recorded with pipette solution containing high (n=4 ECl=0 mV) and low (n=5 ECl=−50 mV) Cl − . APD50 and APD90 indicate action potential duration at 50% and 90% repolarization APA, action potential amplitude and Vم, resting membrane potential.

        To substantiate this conclusion, we studied the effects of أناCl(Ca) blockade on the أناti I-V relationship and DAD amplitude. We applied DIDS, a potent inhibitor of anion transport proteins, including أناCl(Ca) القنوات. 23 In these experiments, we used the low-Cl − pipette solution (ECl=−50 mV). Figure 3A shows typical examples of أناtis measured at −80 and +50 mV in the absence and presence of DIDS. The drug had no effect. Figure 3B shows the lack of effect of the stilbene on the mean أناti I-V relationship of 4 cells. Figure 3C and 3D shows that DIDS also had no effect on DAD amplitude or other action potential characteristics (n=4).

        الشكل 3. A, Typical current traces recorded at −80 and +50 mV in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS. B, I-V relationship of أناti in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS (n=4). C, Typical action potential and DAD configuration in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS. D, Action potential and DAD parameters in absence and presence of 0.5 mmol/L DIDS (n=4). Abbreviations as in Figure 2.

        From these experiments, we conclude that there is no or only a very limited role for a Cl − current in DADs and أناti in failing human ventricular cells.

        Dominant Role for أناNa/Ca في أناti and DAD Formation in Human Ventricular Cells

        A salient feature of the أناti I-V relationship is the absence of a reversal potential (Figures 2B and 3B ). This suggests that not a channel mechanism but rather an electrogenic Na + /Ca 2+ exchange underlies أناti. Na + /Ca 2+ exchange can support inwardly and outwardly directed currents. 24 During spontaneous SR Ca 2+ release under voltage-clamp conditions, however, أناNa/Ca does not reverse sign and remains inwardly directed, because any rise in sarcoplasmic Ca 2+ concentration will shift the reversal potential of the exchanger toward more positive membrane potentials. 25,26 The أناti in human ventricular cells was small at positive membrane potentials and increased at more hyperpolarized potentials, with a maximum at −70 mV. At potentials negative to −70 mV, أناti decreases (Figures 2B and 3B ). This behavior is most likely related to voltage-dependency of أناNa/Ca itself, but also to the amount of Ca 2+ released by the SR. 24,27 Spontaneous [Ca 2+ ]أنا oscillations seem to decrease at more hyperpolarized potentials, 20 which will result in a smaller أناti.

        Next, we tested the hypothesis that أناNa/Ca contributes to أناti. We inhibited Na + /Ca 2+ exchange by replacing extracellular Na + with equimolar amounts of Li + . Li + permeates through Na + channels and nonselective cation channels 28 but cannot replace Na + on the Na + /Ca 2+ exchanger. 29,30 Throughout these experiments, 0.5-mmol/L DIDS was present, and the low-Cl − pipette solution (ECl=−50 mV) was used. Figure 4A shows a typical example of the effects of Li + on أناti. Both at −80 and at +50 mV, an inwardly directed أناti was found (left), which completely disappeared after substitution of Li + for Na + (right). Aftercontractions were still visible, however, indicating that spontaneous SR Ca 2+ release was not disrupted. Figure 4B shows the mean أناti I-V relationship of 4 cells before and after the maneuver. After substitution of Li + for Na + , أناti was abolished at all potentials. Inhibition of Na + /Ca 2+ exchange and the consequent further loading of the sarcoplasm with Ca 2+ prevents stable current-clamp recordings. For this reason, we could not evaluate the effect of Li + on DAD formation. Nevertheless, from these data, we conclude that أناNa/Ca plays a dominant role in أناti and DAD formation in human ventricular cells of failing hearts.

        الشكل 4. A, Typical current traces recorded before (left) and after (right) substitution of all extracellular Na + by Li + . B, I-V relationship of أناti before and after substitution of all extracellular Na + by Li + (n=4).

        In a Rabbit Model, أناCl(Ca) Density Is Not Affected by Heart Failure

        Thus far, we found that in human ventricular cells, DAD and أناti are carried predominantly by أناNa/Ca but not by أناCl(Ca). This is at odds with observations made in a number of animal models. In our experiments, ventricular cells were isolated from explanted hearts of patients with end-stage heart failure. We cannot exclude the possibility that heart failure affects أناCl(Ca) density, the more so because heart failure is associated with downregulation of a number of cationic currents 31,32 and alterations in Ca 2+ metabolism. 33

        In a concluding series of experiments, we determined whether in an animal model, heart failure influences أناCl(Ca) density. درسنا أناCl(Ca) in cells isolated from control and failing rabbit hearts using the low-Cl − pipette solution (ECl=−50 mV). Moreover, the results obtained in rabbit cells were compared with those obtained with failing human cells. To measure أناCl(Ca), we applied voltage-clamp steps (see Methods) in the absence and presence of DIDS. Figure 5A shows typical examples of the current traces recorded at +50 mV in a control rabbit (left), a failing rabbit (middle), and a failing human (right) cell. By subtraction of the appropriate traces, the DIDS-sensitive أناCl(Ca) was obtained (Figure 5B). Figure 5C shows mean I-V relationships of أناCl(Ca) of 11 control rabbit, 9 failing rabbit, and 6 failing human cells. In both groups of rabbit cells, the typical bell-shaped أناCl(Ca) I-V relationship was found. أناCl(Ca) was not observed in human ventricular cells. Moreover, the أناCl(Ca) density in failing rabbit cells did not differ significantly from that in control rabbit cells. From these data, we conclude that in rabbit, heart failure per se does not necessarily lead to downregulation of أناCl(Ca).

        الشكل 5. A, Superimposed current traces elicited by voltage-clamp steps from −50 to +50 mV in absence and presence of DIDS in a control rabbit cell (91 pF), failing rabbit cell (290 pF), and failing human cell (265 pF). B, DIDS-sensitive currents. C, I-V relationship of أناCl(Ca) in ventricular cells from control rabbit (n=11), failing rabbit (n=9), and failing human (n=6) hearts.

        مناقشة

        ملخص

        The aim of this study was to elucidate the ionic mechanism of DADs and their underlying current, أناti, in failing human ventricular cells. وجدنا أن أناti I-V relationship was inwardly directed between −110 and +50 mV (Figures 2 and 3 ). Neither changes in [Cl − ]أنا nor application of DIDS (Figure 3) affected the DADs or أناtis (Figure 2). أناti was completely abolished, however, by substitution of Li + for extracellular Na + (Figure 4). Because this maneuver blocks أناNa/Ca, we conclude that أناNa/Ca is the principal ionic mechanism of DADs and أناti in failing human ventricular cells.

        Species-Dependency of Ionic Nature of DADs

        Our results indicate that in failing human ventricular cells, only أناNa/Ca contributes to أناti. This is similar to findings in ventricular cells of guinea pig 25,29 but contrasts with observations made in ventricular cells of dog, 11 rabbit, 12 sheep, 14 and ferret. 30 In these species, أناti consisted of both أناCl(Ca) و أناNa/Ca. In our experiments, norepinephrine was present. Adrenoceptor stimulation enhances أناCl(Ca) amplitude, 11 thereby potentially favoring أناCl(Ca) كشف. Furthermore, we found that the density of أناCl(Ca) in rabbit heart cells is not affected by heart failure (Figure 5). Thus, neither our experimental conditions nor heart failure per se can clarify why أناCl(Ca) cannot be found in our failing human ventricular cell preparation. The simplest explanation is that our failing human heart cell preparation does not possess أناCl(Ca). Indeed, Köster et al 34 were not able to detect أناCl(Ca) currents in human ventricular cells when they applied caffeine to induce SR Ca 2+ release, whereas in rabbit Purkinje cells, that same maneuver does activate أناCl(Ca). 35 Finally, the lack of effect of DIDS application and/or intracellular Cl − substitution on steady-state membrane currents and action potentials of our failing human ventricular cells (Figures 2 and 3 ) also implies that in our preparation, both the heart failure–induced, persistently active swelling-induced Cl − current 36 and cAMP-dependent Cl − current (أناCl(cAMP)) 37 are absent. The latter agrees with findings of Oz and Sorota, 38 who were also not able to detect أناCl(cAMP) in human ventricular cells.

        Limitations of Our Study

        Animal models contribute much to our understanding of the electrophysiology of failing hearts. They can never completely substitute, however, for experiments with normal human cells. We found that heart failure in rabbits does not significantly alter أناCl(Ca). We take that as evidence that heart failure per se cannot account for our inability to detect أناCl(Ca) in human ventricular cells of failing hearts. Final proof for the notion that human heart cells do not express أناCl(Ca), of course, lies in experiments with normal human heart cells.

        Implications of Our Study

        The present study demonstrates that in failing human ventricular cells, DADs and their underlying current, أناti, are composed virtually exclusively of أناNa/Ca. أناNa/Ca is activated by spontaneous Ca 2 release from SR. This contrasts with observations made in ventricular cells of a number of animal species in which أناCl(Ca) also contributes to the DADs and أناti. Our findings question the rationale behind أناCl(Ca) blockade as a therapeutic approach in arrhythmias caused by triggered activity.

        This work was supported by the Research Council for Earth and Life Sciences with financial aid from the Netherlands Organization for Scientific Research (grant 805-06.155).


        خيارات الوصول

        احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

        جميع الأسعار أسعار صافي.
        سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
        سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

        احصل على وصول محدود أو وصول كامل للمقالات على ReadCube.

        جميع الأسعار أسعار صافي.


        What is the mechanism responsible for the 'delay' in delayed rectifier potassium channels? - مادة الاحياء

        Potassium Channels

        K+ channels are membrane proteins that allow rapid and selective flow of K+ ions across the cell membrane, and thus generate electrical signals in cells. Voltage-gated K+ channels (Kv channels), present in all animal cells, open and close upon changes in the transmembrane potential. Kv channels are one of the key components in generation and propagation of electrical impulses in nervous system. Upon changes in transmembrane potential, these channels open and allow passive flow of K+ ions from the cell to restore the membrane potential.

        Voltage Gating

        Schematic view of the gating process in Kv channels.

        The tetrameric structure of Kv channels is made of two functionally and structurally independent domains: an ion conduction pore, and voltage-sensor domains. The ion conduction pore is made of four subunits which are arranged symmetrically around the conduction pathway. Voltage-sensor domains are positioned at the periphery of the channel and consist of four transmembrane segments (S1-S4). Structural rearrangement of the voltage-sensor domains in response to changes in the membrane potential, and in particular S4, which includes positively charged amino acids at every third position, results in conformational changes in the conduction pore, which could open or occlude the ion conduction pathway. The nature of these movements and conformational changes in the voltage-sensors have been subject to controversy and several models for voltage-gating have been proposed.

        The recently solved crystal structure of Kv1.2, from rat brain, revealed the molecular architecture of the voltage sensor domain in an open state of the channel. Four Arginine gating residues are identified in the voltage-sensor domain shielded from the lipid molecules. Coupling of the voltage-sensors to the (gate in the) pore domain is via an amphipathic alpha helix that runs parallel to the membrane plane inside the cell. Conformational changes in the voltage-sensor domain are transferred to the ion conduciton pore via the helical linker, and result in opening or closing of the intracellular gate of the ion conduction pathway. However, the nature of this coupling, and the interactions between the linker and the pore still remains a mystery.

        Ion Permeation

        The structural element responsible for the high selectivity of the channel, is a sequence of five amino acids that is highly conserved among potassium channels, voltage-gated or not. This stretch of amino acids, TVGYG, forms the narrowest part of the channel, also known as the selectivity filter. The ion conduction pathway is lined with oxygen atoms in this region which provide four binding sites for K+ ions. The ion conduction mechanism through the selectivity filter, has been postulated and studied . Our recent molecular dynamics study of the pore domain of Kv1.2, could provide trajectories of K+ ion conduction through the channel driven by a voltage bias across the lipid bilayer (click here to download a movie of the conduction trajectory (mpeg,1.6M)). Our results are consistent with the knock-on mechanism suggested by Hodgkin and Keynes, in 1955. During the simulation the selectivity filter is occupied by 2 or 3 K+ ions at each time. The ions reside mainly at sites identified previously by crystallography and modeling, separated by water molecules. When a K+ ion approaches the filter from the cytoplasmic side, the configuration of the ions inside the selectivity filter changes, until the K+ ion enters the selectivity filter. Upon entrance of the K+ ion to the selectivity filter from the cytoplasmic side, the outermost K+ exits the channel to the extracellular solution. The jumps of ions between these sites and the sequence of multi-ion configurations involved in permeation are described thoroughly in here.

        Different scenarios for the K+ conduction through the selectivity filter were observed in our simulations, for which movies of the simulation trajectories are provided here (mpeg,4.7M) and here (mpeg,1.4M).



        Kv1.2 embedded into a solvated lipid bilayer.

        A rotating movie of the open state of the channel is provided here. (mpeg, 11M)

        Gating Charge

        Upon opening of the channel, conformational changes in the voltage-sensor domains (VSD) result in the transfer of 12-13 elementary charges across the membrane electric field. This charge transfer is measured as a transient capacitive current that preceeds opening of the channel. Several charged residues of the VSD, in particular four arginine residues located regularly at every third position on the S4 segment, are known to move across the transmembrane field and contribute to the gating charge. The position of these arginines, known as gating arginines, are highly conserved in all voltage-gated potassium, sodium, or calcium channels. However, the extent of their movement and their displacement across the transmembrane potential has been subject to extensive debate.

        In collaboration with the Roux lab, we have been able to calculate the gating charge of a voltage-gated potassium channel, Kv1.2, from all-atom MD simulations. The total gating charge of the channel is calculated for the full tetrameric channel, as well as an individual voltage-sensor domain (VSD) in an explicit membrane-solvent environment.

        The free energy of each protein conformation (in the open or closed state) is a function of the external voltages applied. The displacement charge (or the electric dipole) of the entire system, including water, ions, and the lipid molecules, couples the potential energy of the protein state to the external voltages applied. When simulated under a voltage bias, the difference between the displacement charge of the two systems (open and closed) represents the gating charge of the channel. The open probability of the channel at a given voltage, is then determined from the difference in the free energy of the two protein states (open and closed) at this particular voltage.


        The gating charge of Kv1.2 calculated for the ful tetrameric channel (left) and an individual VSD (right). The calculations are performed on the open and closed state models of Kv1.2 (Pathak et al. Neuron 2007,56:124-40). The models are refined through externsive MD simulation in a membrane environment prior to these calculations.

        Electrostatic Potential within the VSD

        Across a perfectly homogeneous lipid membrane, the electrostatic potential drops linearly from the interacellular to the extracellular side. However, the irregular shape of the protein and its dielectric inhomogenity modulates the membrane potential within the VSD. In particular, water-filled crevices within the protein change the spatial variation of the potential across the membrane. Using free energy calculation in MD simulations, we have calculated the electrostatic free energy of several residue side chains along the TM helices of the voltage-sensor domains (VSD). These residues are known to move within the transmembrane field when the channel transitions from the open to the closed state, and contribute to the gating charge.

        We have calculated the transmembrane potential at the position of key charged residue side chains inside the VSD. In these calculations, the intracellular solution is assumed to be at potential V=1, while the extracellular solution is grounded. The calculations reveal that the transmembrane potential drops rapidly over a distance of about 10-15A within the protein. Such a sharp drop in the potential results in a very focused electric field within only one third of the bilayer thickness. The sharp drop in the transmembrane potential is due to the presence of a water-filled crevice located within the VSD, which provides a high-dielectric medium in contrast to the low-dielectric medium of the surrounding protein and lipid molecules.


        Fraction of transmembrane potential acting on key charged residues of the VSD plotted against z-axis normal to the membrane.

        In the open state of the channel, the potential acting on the gating residues (R1-R4) varies from its full value (at z=-5 A) to zero (at z = 10 A) over the extracellular half of the membrane bilayer. As a result, all four gating arginines positioned within 15 A of the membrane-solvent interface are exposed to the extracellular potential. This trend is also seen for the closed state of the channel. Although, the closed conformation of the VSD places the gating arginies near the intracellular inteface. These arginines, spread over a distance of

        10 A, are exposed to the intracellular potentia at 1V.

        Displacement of charged residues across the membrane potential results in the transfer of a net electric charge across the membrane that can be detected as gating currents in electrophysiological experiments. For example, in the open state of the channel, R4, the forth gating arginine of the VSD, is positioned near the center of the membrane at 0.2 of the potential. In the closed state of the channel, R4 is placed near the intracellular potential at 0.9 of the voltage bias. Upon transition of the channel from the open to the closed state, movement of R4 results in the transfer of 0.7 elementary charges across the membrane. We have determined the contribution of individual charged residues of the VSD to the total gating charge. The results show that the gating charge mainly arises from three of the four arginines, R2, R3, and R4, and the average movement of these residue side chains is about 9 A normal to the membrane.

        Final refinement

        13e). The difference can be accounted for by considering the contribution of individual residues to the gating charge. In contrast to what was expected, our results showes that R1, the first gating arginine, does not move signitficantly within the membrane potential. We have performed steered molecular dynamics (SMD) simulations, in which the side chain of R1 is pulled down toward the intracellular solution, and the total gating charge is monitored during the course of the simulation. The results show that relatively small motion of these residue side chains is sufficient to increase the gating charge by 2.5 e. During these simulations, rearrangement of arginine side chains is accompanied by disrupting a salt bridge interaction between R1 and E0 (on the S1 segment), and replacing it with strong interactions between R1 and E1 (on the S2 segment), which appear to block the entry of water molecules from the extracellular side. These results suggest that, rather than being the true resting state existing under hyperpolarizing conditions, the initial closed state model corresponds to an intermediate substate appearing early during channel activation.



        Permeation of potassium ions through VSD.

        Voltage sensor domains act as ion channels

        Voltage sensor domains (VSD) consist of four transmembrane segments that form an anti-parallel helical bundle (S1-S4). Mutation of the first gating arginine (R1) on the S4 segment to smaller uncharged amino acids such as serine or asparagine will turn the VSD into an ion channel, allowing permeation of cations through these helical bundles while the main ion conduction pore is closed. These currents, known as omega currents, travel through the VSD and are distinct from the K+ currents passing through the central ion conduction pathway. Omega pores are cation selective, and have a slight preference for larger cations. We have performed molecular dynamics simulations of ionic permeation through the VSD in its resting state conformation. Simulations of the wild-type VSD and four of its mutants revealed the presence of a negatively charged constriction region near the center of the membrane which might act as a selectivity filter that prevents permeation of anions through the pore. Two highly conserved charged residues, R1X and E1, on two helical segments of the VSD form part of this selectivity filter. Mutation of these residues, both in experiments and our simulations, significantly increases the magnitude of the omega-current, another indication that the resting state model of the VSD obtained through our simulations is a viable representative of the functional state of the protein.


        Study Questions for Lectures on the Molecular Biology of the Action Potential

        1. What is the proposed membrane topology for voltage-gated sodium channels? And what is it for شاكر potassium channels?

        2. What evidence is there that voltage-gated sodium, potassium, and calcium channels are related?

        3. What part of the sodium channel forms the pore? What part of the potassium channel forms the pore? How would you prove it?

        4. What accounts for ionic selectivity? What are their molecular bases? What is the key difference between potassium channels and sodium channels?

        5. Can you alter the ion selectivity of an ion channel? يشرح.

        6. What part of the voltage-gated channel forms the voltage sensor? لماذا تظن ذلك؟

        7. What could you do experimentally (or what has already been done) to prove that this part of the channel is the one actually responsible for sensing voltage?

        8. How is the channel activated by voltage changes?

        9. Are all ion channels voltage-sensitive? If not, why aren't they?

        10. How do sodium and potassium channels inactivate? Could you identify the molecular basis of channel inactivation?

        11. What is voltage clamp? What could you learn about an action potential from voltage-clamp analysis? (assume that you vary the voltage from 㫞 mV to +70 mV, with 10 mV/step and that the neuron only has a fast sodium current and a delayed rectifier potassium current).

        12. If you treat a squid giant axon with TTX, what kind of current-voltage (I-V) plot do you get? لماذا ا؟

        13. If you treat a squid giant axon with TEA, what kind of current-voltage (I-V) plot do you get? لماذا ا؟

        14.What is reversal potential? What is Eمراجعة for sodium? What is Eمراجعة for potassium? Could you

        use them to explain the amplitude of an action potential?

        15. What will happen to the action potential shape if you partially reduce the amount of potassium currents?

        16. Draw an action potential. Label the following on your diagram: sodium channel activation, sodium channel inactivation, sodium channel closure, potassium channel activation, potassium channel closure.

        17. What are gating currents? Are they carried by charged ions such as sodium and potassium? Do they have a threshold for activation?

        18. Draw five traces of single channel currents from a voltage-gated sodium channel activated at +20 mV (from Vح = -70 mV)? Compare them with the macroscopic current you obtained from voltage-clamp at the same depolarizing voltage. How do they differ?

        19. Could you use molecular terms to explain the refractory period of action potentials?

        Study Questions for `Other Ion Channels and Intrinsic Membrane Properties of Neurons' and `Ion Channels and Disease'

        1. What are considered the major factors that determine the personality (i.e. intrinsic membrane properties) of neurons?

        2. What are the minimal requirements of ion channel types for a tonically active neuron?

        3. What are the minimal requirements of ion channel types for a rhythmically bursting neuron?

        4. What is so special of low-voltage activated ion channels? Could you give a few examples of this kind of ion channels?

        5. Are channels always activated by depolarizations? If not, could you give two examples?

        6. What is so special of the transient potassium current (Iأ)؟ Could you explain it using your molecular biology knowledge?

        7. Give one unique feature of Ca 2+ -activated potassium current.

        8. What is afterhyperpolarization (AHP)? What are the cause and usefulness of it?

        9. Is inward rectifying potassium current identical to Iح؟ What are their differences?

        10. What is dendrite? Is it passive? How would a neuron use it to tune its own activity?

        11. How would one obtain the activation and inactivation curves of an ion channel experimentally? Use voltage-gated sodium channel as an example.

        12. What is reversal potential? How would one determine the reversal potential for voltage-gated sodium currents?

        13. Draw a current-voltage plot for each type of K channel (delayed rectifier, transient potassium channel, inward rectifier, and Ca 2+ -activated potassium channel).

        14. What does it mean that one of the sodium currents is transient and that one is persistent?

        15. What important consequence does the refractory period have for the conduction of action potentials?

        16. How does changing Iح affect neuronal firing?

        17. How does changing the delayed rectifier affect neuronal firing?

        18. How would you change the frequency of neuronal firing?

        19. What are specific examples of how modifications of channel properties lead to pathologies? Use sodium channel as an example.

        20. How might mutations in general affect channel properties (for example, a mutation in the promoter region might cause the over or under expression of a certain ion channel)?

        Study Question for Mechanisms of Synaptic Transmission

        1. Discuss the structure and function of electrical synapses.

        2. What advantages might electrical synapses have over chemical synapses?

        3. What steps are involved in chemical synaptic transmission?

        4. What currents might be responsible for excitatory synapses? What currents might be responsible for inhibitory synapses?

        5. In what ways are inputs integrated? What is the purpose of integrating inputs?

        6. What do you usually find in the presynaptic terminal? What is an active zone?

        7. Describe the interaction of sodium and potassium at the neuromuscular junction. Include the following terms in your description: ACh, reversal potential, EPSP.

        8. Describe the evidence supporting vesicle fusion with the presynaptic membrane.

        9. If calcium blockers are applied to the axon, what effect will this have on synaptic transmission if the axon undergoes an action potential?

        10. What are the differences between an EPSP and an IPSP? What determines whether a specific transmitter is excitatory or inhibitory?

        11. What is shunting? Explain it using the Ohms law.

        12. What are the two essential components of the vesicle hypothesis?

        13. What do you expect to see on the presynaptic terminal membrane using freeze-fracture techniques when a) the nerve is not stimulated and b) the nerve is intensely stimulated?

        14. What is capacitance? What would an increase in membrane capacitance suggest?

        15. What is a quantum? What is quantal release?

        16. What is a MEPP? How does this differ from an EPSP?

        17. What is the evidence that calcium is required for vesicle exocytosis?

        18. What is the core complex? ما هي مكوناته؟

        19. What is SNARE? How many SNARE proteins do you find in nerve terminals? Which one is v-SNARE and which is (are) t-SNAREs?

        20. Why do dermatologists use botulinum toxins to reduce wrinkles and keep their patients `youthful'? What do these toxins do to SNARE proteins?

        21. What is the SNARE hypothesis? Why do we think it is no longer correct?

        22. What evidence do we have to suggest that SNARE proteins are important for vesicle fusion?

        23. What are the advantages and disadvantages of `knock-out' experiments?

        24. What is synaptotagmin? Why is it suggested to be a calcium sensor?

        25. Is synaptotagmin the only calcium sensor? إذا لم يكن كذلك ، فلماذا؟

        26. Why do you need to recycle synaptic vesicles in nerve terminals?

        27. What is clathrin? How does it endocytose synaptic vesicles?

        28. How might the homogeneous sized vesicles be regulated?

        29. What is dynamin? What roles does it play during vesicle recycling?

        30. What impacts would defects in endocytosis and recycling have on vesicle exocytosis?