معلومة

ماذا يعني استخدام DMSO كمذيب في تجارب علم الأحياء؟


في العديد من منشورات علم الأحياء ، رأيت أن ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) يستخدم في إذابة الأدوية. ومع ذلك ، لا تزال الاختبارات المستندة إلى الخلية تُجرى في وسط مائي مثل RPMI أو PBS.

سؤالي هو: إذا كان المركب غير قابل للذوبان في الماء ، فما الغرض من استخدام DMSO؟ على الرغم من أنه يمكن إذابة الدواء في DMSO النقي ، ألا يترسب بعد وضع المركب المذاب DMSO في وسط استزراع؟


عادة ما يتم إذابة هذه المركبات في DMSO لعمل محلول مخزون مركّز (على سبيل المثال 1000x) ، والذي يتم تخفيفه بعد ذلك في وسط الاستزراع. في كثير من الأحيان ، يكون المركب قابل للذوبان في الماء عند هذا التخفيف المنخفض ، ولكن ليس عند التركيز الأعلى المطلوب لصنع مخزون. في بعض الأحيان يكون للمركب قابلية منخفضة للذوبان في الماء وكثير منه يترسب. هذا لا يزال يتيح لنا اختبار تأثير الكسر الذي يظل قابلًا للذوبان.


حيوية الخلية

تم تقييم قابلية بقاء الخلية من خلال البيئة المختزلة للخلايا القابلة للحياة والتي عند الدخول ، تحول المحلول القائم على الريسازورين غير الفلوري إلى ريسوفورين عالي التألق. تم زرع الخلايا في صفيحة 96 بئر بكثافة 1 × 10 4 خلية لكل بئر. عولجت الخلايا بـ 0-72 ساعة باستخدام 0-10 وحدة / مل EPO من أجل بقاء الخلايا القاعدية. لدراسة المقاومة الكيميائية ، تمت معالجة الخلايا بـ 1 U / mL EPO لمدة 4 ساعات ، ثم حضنت مع سيسبلاتين عند 50 ميكرومتر لمدة 72 ساعة. في نهاية العلاج ، تمت إضافة 10 ميكرولتر من كاشف Presto Blue (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى كل بئر تحتوي على 100 ميكرولتر من الوسط. تم تحضين اللوحة بعد ذلك لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وتم قياس امتصاص كل بئر على قارئ صفيحة ميكروية (Varioscan ، Thermo ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 590 نانومتر. تم حساب صلاحية الخلية النسبية كنسبة مئوية من الخلايا غير المعالجة.


كم عدد الممرات التي يجب انتظارها بعد الإحياء قبل التجربة - (ديسمبر / 10/2007)

بعد إذابة الخلايا ، كم عدد الممرات التي تسمح للخلية بالنمو قبل استخدامها للتجربة ، على سبيل المثال تعداء الخلايا؟ أحيانًا أستخدم الخلايا على الفور بعد أن تصبح متجمعة.

بعد إذابة الخلايا ، كم عدد الممرات التي تسمح للخلية بالنمو قبل استخدامها للتجربة ، على سبيل المثال تعداء الخلايا؟ أحيانًا أستخدم الخلايا على الفور بعد أن تصبح متجمعة.

عادةً ما أعبر زنزاناتي مرة واحدة على الأقل. في الغالب لأنني بحاجة إلى عدد أكبر من الخلايا لإجراء تجاربي ، ولكن أيضًا للتأكد من أن الخلايا مناسبة بعد التجميد. لا أعتقد أن هناك معيارًا ذهبيًا.

كيرستن
مستشفى جامعة آرهوس
الدنمارك

بالتأكيد مرة واحدة على الأقل - أذهب مع اثنين لإزالة أي شك

عادة ما نذهب لشخصين. لن & # 39t تريد أي DMSO في تجاربك

شكرا يا رفاق على ردكم. أنا أتفق معك تماما. سأنتظر فقرة واحدة على الأقل قبل استخدام الخلايا للتجارب.

ستحصل على نمو أفضل إذا قمت بإزالة dmso في اليوم التالي للذوبان بمجرد إرفاق الخلايا - فقط استبدل الوسائط - لا يلزم المرور

ستحصل على نمو أفضل إذا قمت بإزالة dmso في اليوم التالي للذوبان بمجرد إرفاق الخلايا - فقط استبدل الوسائط - لا يلزم المرور

يمكنك أيضًا تخفيف خلايا الذوبان في وسائط جديدة (باردة) ، وتدويرها لمدة 10 دقائق @ 800 دورة في الدقيقة ، وإزالة المادة الطافية ثم إعادة تعليق الحبيبات مرة أخرى في وسائط 10 مل.

بعد إذابة الخلايا ، كم عدد الممرات التي تسمح للخلية بالنمو قبل استخدامها للتجربة ، على سبيل المثال تعداء الخلايا؟ أحيانًا أستخدم الخلايا على الفور بعد أن تصبح متجمعة.

يمكنك استخدام الخلايا التالية لإذابة الجليد ، وليس مشكلة. كل ما عليك القيام به هو غسل الخلايا 2-3 مرات ، فإن DMSO يأتي بسهولة وسرعة في تجربتي. يمكنك تمرير الخلايا للتأكد من أنها تتأقلم ، ويتم التعبير عن البروتينات إلى أقصى حد وهكذا دواليك ، لكنني لن أقلق. كثير من الناس يستخدمون الخلايا للمقايسات مباشرة من النيتروجين السائل. هناك بعض الوظائف ، خاصة بالنسبة للخلايا القاتلة الطبيعية ، التي يتم إضعافها من خلال عملية ذوبان التجميد. لا شيء يمكنك القيام به من المرجح أن يستعيد هذه الوظيفة.

عادةً ما أمر مرتين قبل القيام بأي شيء ، ولكن بمجرد إجراء تجربة تعداء سريعة في اليوم التالي إذا قمت بإذابة خلايا CV-1. انها سارت على ما يرام.

ستحصل على نمو أفضل إذا قمت بإزالة dmso في اليوم التالي للذوبان بمجرد إرفاق الخلايا - فقط استبدل الوسائط - لا يلزم المرور

يمكنك أيضًا تخفيف خلايا الذوبان في وسائط جديدة (باردة) ، وتدويرها لمدة 10 دقائق @ 800 دورة في الدقيقة ، وإزالة المادة الطافية ثم إعادة تعليق الحبيبات مرة أخرى في وسائط 10 مل.

هذه هي الإجابة الصحيحة ولكنها ليست الإجابة على السؤال الأصلي. أتفق معك تمامًا بشأن الطرد المركزي عند g منخفضة (من فضلك لا تستخدم RPM لأن هذا لا يعني أي شيء. يجب أن يكون في g).

يا عزيزي ، أنا ودوم نصدم مرة أخرى. في دراساتنا وجدنا على مر السنين أن الاحتفاظ بالخلايا في وسائط DMSO + طوال الليل أكثر ضررًا للخلايا من الطرد المركزي وتقليل تركيز DMSO في الوقت 0.

الجواب على السؤال الأصلي هو. أنها تختلف باختلاف خطوط الخلايا والأولية. كقاعدة عامة ، مطلوب ما لا يقل عن مقطع واحد أو مقطعين. لخلايا J774. أسهل الخلايا وأقلها تدميرًا في العالم. ليس عليك حتى تمريرها للتجريب.


نتائج

تم تعريض الأنسجة الدقيقة البشرية ثلاثية الأبعاد (MTs) لنموذج قلبي ناضج ونموذج كبدي ناضج لوسط مزرعة مع أو بدون 0.1 ٪ DMSO لمدة أسبوعين مع نقاط زمنية لأخذ العينات عند 2 و 8 و 72 و 168 و 240 و 336 ساعة. تم قياس البروتين (ما يقرب من 2000 بروتين مُقاس) ، والنسخة الكاملة (بما في ذلك miRNAs) ومثيل الجينوم الكامل على المواد التي تم الحصول عليها من نفس العينة. يحتوي الشكل 1 على نظرة عامة رسومية للتصميم التجريبي. من أجل الحصول على نظرة عامة أولية على التأثيرات المتقاطعة التي يسببها DMSO ، يتم تلخيص كميات الكيانات المتغيرة تفاضليًا (كلها مصححة للاختبارات المتعددة باستخدام FDR & lt0.05) لكل منصة. اختلفت أعداد الكيانات المتغيرة تفاضليًا بين أنواع الأنسجة ، حيث أظهرت عينات القلب تأثيرًا أكبر لـ DMSO من تأثير الكبد ، باستثناء mRNAs. هذا الاختلاف ملحوظ بشكل خاص بالنسبة للـ miRNAs ومثيل الجينوم. نظرًا لأن بيانات البروتينات كانت أقل إفادة بسبب طبيعتها الجزئية ، فقد تم تضمين هذه النتائج في البيانات التكميلية. علاوة على ذلك ، يوضح تحليل المكون الرئيسي (PCA) ، باستخدام متوسطات ثلاثية ، لكل منصة (الشكل 2 والبيانات التكميلية أمبير) اختلافات واضحة بين 0.1 ٪ DMSO المكشوفة (DMSO) والعينات غير المعالجة (UNTR) ، باستثناء مثيلة في الكبد MTs.

نظرة عامة رسومية على التصميم التجريبي جنبًا إلى جنب مع ملخص للكيانات التفاضلية لكل طريقة تحليل. يتم عرض المعلومات الخاصة بالأنسجة باللون البرتقالي للقلب والأخضر للكبد. علاوة على ذلك ، تم تلوين التعرضات باللون الأزرق ومنصات القياس باللون الأرجواني. الاختصارات: h = ساعات mRNA = messenger RNA miRNA = microRNA.

PCA تصور الاختلافات بين DMSO و UNTR لجميع المنصات المقاسة. (أ) يشير PCA لـ RNAs إلى اختلافات واضحة في تعبير RNA بين DMSO (مثلث) و UNTR (دوائر). تعتبر عينات القلب (على اليسار) أكثر تميزًا عن UNTR من العينات الكبدية (يمين). (ب) يكشف PCA لـ miRNAs عن فصل واضح بين DMSO و UNTR في عينات القلب ، بينما تبدو العينات الكبدية أكثر عرضة لمدة التعرض (كما يتضح من نمط اللون الذي يتوافق مع النقاط الزمنية المحددة ، انظر وسيلة الإيضاح). (ج) يشير PCA الخاص بالمثيلة الحركية إلى الاختلافات بين DMSO و UNTR لعينات القلب ولكن ليس لعينات الكبد.

لدراسة التأثيرات الجزيئية لـ DMSO ، تم تحليل العمليات الخلوية المتأثرة باستخدام النسخة الكاملة. بعد ذلك ، تم التحقيق في التأثيرات الخاصة بالأنسجة لـ DMSO على تنظيم التعبير الجيني عن طريق تحليل التغييرات في miRNAs ومثيل الجينوم.

تأثيرات DMSO على العمليات الخلوية

تم تصوير تأثيرات DMSO على mRNAs بواسطة PCA (الشكل 2 أ ، ب). أشار الفصل الواضح بين UNTR و 0.1٪ DMSO إلى أن DMSO كان قادرًا على التأثير على العمليات الخلوية عن طريق تغيير التعبير الجيني. نتج عن المقارنة بين DMSO و UNTR 2051 جينات معبر عنها تفاضليًا (DEGs = FDR & lt0.05 منها 871 مع | log2FC | & gt1) في MTs للقلب و 2711 DEGs (منها 1879 مع | log2FC | & gt1) في MTs الكبدية ، منها 60.7 تم تنظيم ٪ و 62.9 ٪ DEGs على التوالي.

تحليل مسار DEGs

لتحديد العمليات الخلوية المتأثرة بتعرض DMSO ، تم استخدام DEGs لتحليل التمثيل الزائد للمسار باستخدام ConsensusPathDB 15 مع قاعدة بيانات Reactome المنسقة 16. تم طلب المسارات التي تم تمثيلها بشكل كبير (q-value & lt 0.05) باستخدام الاتصالات الهرمية بين المسارات (الفرعية) التي تم الحصول عليها من متصفح Reactome Pathway (الجداول التكميلية 1،2). تم تضمين ملخص يحتوي على أعلى مستويات المسار الهرمي (من الآن فصاعدًا يشار إليها باسم المجموعات) في الجدول 1 للقلب والجدول 2 للـ MTs الكبدية.

من خلال تحليل المسار على DEGs ، تم العثور على 225 مسارًا تم تمثيلها بشكل كبير (q-value & lt 0.05) في MTs للقلب ، والتي تتوافق مع 19 مجموعة (من إجمالي 25 مجموعة في متصفح المسار) ، و 167 مسارًا تقابل 16 مجموعة في MTs الكبد. كان هناك تداخل كبير بين أنواع الأنسجة ، مع وجود 60 مسارًا و 15 مجموعة في كلا النوعين. على الرغم من وجود اختلافات في حجم تأثير DMSO بين أنواع الأنسجة ، لا يبدو أن العمليات البيولوجية المتأثرة بواسطة DMSO خاصة بالأنسجة.

المجموعة الأكثر تأثرًا بـ DMSO هي كتلة "التمثيل الغذائي" في MTs الكبدية. هنا ، تم العثور على معظم التأثيرات في مسارات "دورة حامض الستريك ونقل الإلكترون التنفسي" (قيمة q: 3.5 * 10 10 ، 63 DEGs من 171 جينًا ، 76.2٪ خاضع للتنظيم) ، "استقلاب الجلوكوز" (قيمة q: 9.9 * 10 −9 ، 36 DEGs من 77 جينًا ، 80.5٪ أقل من التنظيم) و "استقلاب الدهون والبروتينات الدهنية" (قيمة q: 2.9 * 10 6 ، 165 DEGs من 728 جينًا ، 55.2٪ أقل تنظيمًا). لم يتم الكشف عن التغيرات في التمثيل الغذائي للدهون والبروتينات الدهنية في MTs القلب باستخدام DEGs ، ولكن لوحظت تأثيرات مماثلة لـ DMSO من أجل "دورة حمض الستريك ونقل الإلكترون التنفسي" (قيمة q: 1.3 * 10 −12 ، 58 DEGs من 171 جينًا ، 65.5٪ خاضع للتنظيم) و "استقلاب الجلوكوز" (قيمة q: 2.8 * 10 −3 ، 20 DEGs من 77 جينًا ، 55.0٪ خاضع للتنظيم) ، على الرغم من تقليل عدد الجينات في MTs القلب مقارنة بـ MTs الكبدية.

هناك مجموعة أخرى شديدة التأثر بعلاج DMSO في كلا النوعين من الأنسجة وهي "النقل بوساطة الحويصلة". تم اكتشاف تأثيرات DMSO في هذه المجموعة بشكل أساسي في العمليات المتعلقة بنقل البروتين بوساطة Golgi وإفرازه. من هذه العملية ، كان "النقل المتقدم من ER-to-Golgi" هو الأكثر تضررًا (القلب: قيمة q: 2.4 * 10 6 ، 38 DEGs من أصل 134 جينًا ، 68.4 ٪ كبديًا خاضعًا للتنظيم: q-value: 1.0 * 10 - 5 ، 44 DEGs من أصل 134 جينًا ، 44.4٪ خاضع للتنظيم). كان هذا المسار أيضًا جزءًا من مجموعة "التمثيل الغذائي للبروتينات" ، والتي كشفت أيضًا عن تأثيرات DMSO على "الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بـ Asparagine N" (القلب: q-value: 2.1 * 10 6 ، 64 DEGs من 283 جينًا ، 76.6 ٪ أقل تنظيمًا. الكبد: q-value: 1.2 * 10 −7 ، 83 DEGs من 283 جينًا ، 54.8٪ خاضع للتنظيم) ، والتي كانت تعديلات بروتينية بعد النسخ ضرورية لنقل البروتينات من ER إلى Golgi 17.

على الرغم من اكتشاف مجموعة "الاستجابات الخلوية للإجهاد" في كلا نوعي الأنسجة ، تختلف المسارات الممثلة بشكل زائد. تأثر "الشيخوخة الخلوية" بشكل كبير في MTs القلبي (قيمة q: 2.6 * 10 4 ، حجم المسار: 192 ، 42 DEGs ، 64.3٪ خاضع للتنظيم) ، ولكن لم يتم اكتشافه أثناء تحليل المسار في MTs الكبدية. أخيرًا ، كانت المجموعات القلبية الإضافية المتأثرة بـ DMSO هي "دورة الخلية" ، "إصلاح الحمض النووي" ، "التكوين الحيوي للعضيات والمحافظة عليها" ، ولكن أيضًا المجموعة ذات الأهمية العالية (q & lt 0.01) من "تنظيم الكروماتين". نظرًا لأنه تم العثور على المسارات الأكثر تأثراً في كلا نوعي الأنسجة ، فإن هذا يشير إلى الإجراءات القوية لـ DMSO.

لوحظت آثار DMSO في تنظيم التعبير الجيني والترجمة

تم بالفعل اكتشاف المسارات المتعلقة بتنظيم التعبير الجيني والترجمة أثناء تحليل مسار MTs القلب (الجدول 3). على الرغم من أن هذه المسارات لم تكن ممثلة بشكل كبير في MTs الكبدية ، إلا أن كميات DEGs المكتشفة تشير إلى أن DMSO كان قادرًا على التأثير على هذه العمليات ويمكن أن يحفز تعديلات بيولوجية على نموذج الخلية.

تأثيرات DMSO التي لوحظت في التنظيم بواسطة microRNAs

لوحظ التأثير الخاص بالأنسجة لـ DMSO في بيانات التسلسل من miRNAs. من أصل 1،105 miRNAs متسلسلة للقلب ، تم التعبير عن 704 (= 63.7 ٪) تفاضليًا (DE ، FDR & lt0.05) مع 59.5 ٪ تظهر انخفاض التنظيم. علاوة على ذلك ، كشفت مؤامرة PCA (الشكل 2 ج) عن اختلاف واضح بين miRNAs لمجموعات العلاج. في MTs الكبدية ، من بين 1033 miRNAs متسلسلة ، كان 186 (= 18 ٪) DE مع ما يقرب من نصف miRNAs يتم تنظيمها (47.3 ٪). علاوة على ذلك ، لم تكشف مؤامرة PCA فقط عن فصل واضح بين miRNAs لمجموعات العلاج ، ولكنها أشارت أيضًا إلى تأثير يعتمد على الوقت. يمثل المكونان الرئيسيان (الوقت والجرعة) معًا أكثر من 95٪ من التباين الكلي ، تاركين تأثيرًا طفيفًا فقط لعوامل أخرى.

للتحقيق في مصدر الاختلاف الخاص بالأنسجة ، تم فحص تغييرات التعبير الجيني في عملية التكوُّن الحيوي للـ miRNA بمزيد من التفصيل (الشكل 3). يبدأ التكوين الحيوي لـ MiRNA بنسخ ميرنا الأساسي الذي تم نسخه بواسطة polymerase II (مجمع مكون من 11 وحدة فرعية) أو polymerase III (مجمع من 10 وحدات فرعية). في MTs القلب ، احتوى البوليميراز الثاني على جينات واحدة منظمة و 8 جينات منظمة. في MTs الكبدية ، تم تنظيم 5 جينات وتم تنظيم 1. على الرغم من أنه تم تنظيم عدد أقل من الجينات في MTs الكبدية ، إلا أن تغيرات الطيات كانت أكبر مقارنةً بالـ MTs القلبية. لم يظهر انقسام pri-miRNA إلى pre-miRNA متأثرًا بتعرض DMSO. مقامر 1 (التي تشق pre-miRNAs) تم تقليلها في MTs القلبي وتم تنظيمها في MTs الكبدية ، مما يصور اختلافًا واضحًا خاصًا بالأنسجة في الاستجابة لتعرض DMSO. أخيرا، AGO2 (ترميز المكون الرئيسي لـ miRNA-RISC) تم ضبطه في MTs القلب. التغييرات في هذه العملية يمكن أن تحدث اختلافات في محتوى الخلايا ميرنا وبالتالي تؤثر على وظيفتها التنظيمية.

تأثير DMSO في عملية إسكات الجينات بواسطة RNAs. DEGs في التولد الحيوي من ميرنا. تنقسم العملية الكاملة إلى عمليات فرعية (أشكال بيضاوية أرجوانية) وتصور الجينات المعنية (مستطيلات زرقاء) واكتشاف DEGs للقلب (مستطيلات برتقالية) وعينات الكبد (مستطيلات خضراء).

في MTs القلب ، يمكن للجينات الخاضعة للتنظيم في التكوين الحيوي للـ miRNA أن تفسر الكمية العالية للغاية من DE miRNA الخاضع للتنظيم وتشير إلى إلغاء التنظيم الشديد لإسكات الجينات بواسطة miRNAs. في MTs الكبدية ، حيث كان التغيير الوحيد المهم هو تنظيم مقامر 1 (الجدول 3) ، لم تتعطل عملية التكاثر الحيوي ميرنا عن طريق التعرض لـ DMSO.

للحصول على إشارة إلى تأثيرات DMSO على إسكات الجينات بواسطة miRNAs ، تم استخدام قاعدة بيانات miRTarBase 18 ، التي تحتوي على تفاعلات الهدف microRNA التي تم التحقق من صحتها تجريبياً (MTI) ، للحصول على أهداف جينية لـ DE miRNAs المكتشفة. قمنا فقط بتضمين MTIs مع أدلة قوية (تم التحقق من صحتها عن طريق مقايسة المراسل أو Western blot أو qPCR). من بين 704 DE cardiac miRNAs ، يمكن العثور على 281 فقط (= 40 ٪) في قاعدة البيانات ، مما أدى إلى ما مجموعه 2051 من الأهداف الجينية التي يحتمل أن تتأثر بالتغيرات التي يسببها DMSO في إسكات الجين ميرنا. بالنسبة إلى MTs الكبدية ، تم الحصول على أهداف لـ 106 DE miRNAs (= 57 ٪) ، بإجمالي 545 جينًا يحتمل تأثره. تم استخدام أهداف الجينات التي تم الحصول عليها لتصور المسارات الممثلة بشكل زائد باستخدام متصفح Reactome Pathway (الشكل التكميلي 3). بشكل غير متوقع ، كانت المسارات ذات التمثيل الزائد موجودة في نفس المجموعات لكلا النوعين من الأنسجة. لوحظت معظم التأثيرات على "نقل الإشارة" و "الجهاز المناعي" و "التعبير الجيني". ومع ذلك ، فإن إلغاء التنظيم الشديد للـ MTs القلبي والمعلومات المحدودة حول MTIs تجعل أي تحليل لاحق على mRNA المتأثر المفترض غير ذي صلة.

لوحظت آثار DMSO في علم التخلق

من أجل تقييم التعديلات اللاجينية التي أدخلتها DMSO ، فإننا نركز على مثيلة الحمض النووي على نطاق الجينوم. كشف تحليل مسار التعبير الجيني القلبي عن تحرير مسارات مثيلة الحمض النووي. ميثيل ترانسفيراز DNMT1، وهو عامل رئيسي للحفاظ على مثيلة الحمض النووي ، و DNMT3A، وتسهيل كليهما من جديد والحفاظ على مثيلة الحمض النووي ، أثناء تنظيمها TET1، الذي يلعب دورًا رئيسيًا في إزالة المثيلة النشطة ، تم تقليله في MTs القلب (الشكل 4 أ). أشارت زيادة تنظيم الكتّاب اللاجينيين وتقليل تنظيم المحايات بعد علاج DMSO إلى فرط الميثيل الجيني ، مما قد يقلل من نشاط النسخ. في المقابل ، في تحليل المسار الكبدي ، لم يلاحظ إلغاء تنظيم مثيلة الحمض النووي. لاحظ أنه في كلا نوعي الأنسجة ، لوحظ دليل نسخي لإلغاء تنظيم الآليات اللاجينية الأخرى ذات الصلة ، مثل مثيلة الهيستون ، حيث تم التعبير عن 16 جينًا و 13 جينًا بشكل تفاضلي في MTs القلب والكبدية على التوالي.

التنظيم الجيني للتعبير الجيني. (أ) DEGs تشارك في مثيلة الحمض النووي. تنقسم العملية إلى عمليات فرعية (أشكال بيضاوية أرجوانية) وتصور الجينات المعنية (مستطيلات زرقاء) واكتشاف DEGs للقلب (مستطيلات برتقالية) وعينات الكبد (مستطيلات خضراء). (ب) الإثراء النسبي لـ DMRs (DMSO مقابل UNTR ، FDR 5٪) ضمن السمات الجينومية. لكل ميزة ، يتم توضيح عدد DMRs المتداخلة على إجمالي عدد النوافذ المختبرة للميزة المعنية. بالمقارنة مع جميع المناطق الجينومية ، يتم إثراء المناطق ذات الميثيل المفرط للأقمار الصناعية ، والتكرارات البسيطة ، ويتم إثراء CGIs البعيدة عن المروجين دون دليل تنظيمي معروف والمناطق قليلة الميثيل لتكرار بسيط.

كشف التنميط الكامل لميثيل الجينوم بواسطة MeDIP-seq عن 66178 منطقة ميثلة تفاضلية (DMRs q-value & lt 0.05) في MTs القلب. أثرت هذه التعديلات على 1.1٪ من الجينوم المغطى. تمشيا مع التغييرات النصية المرصودة للكتاب ومحايات مثيلة الحمض النووي ، فإن 71 ٪ من DMRs تتوافق مع اكتساب الميثيل (46،984 منطقة مفرطة الميثيل مقابل 19،194 منطقة ميثيل). في المقابل ، في MTs الكبدية ، لم يجتاز DMRs التصحيح للاختبار المتعدد. علاوة على ذلك ، أشارت مؤامرة PCA (الشكل 2 د) إلى وجود اختلاف بين مجموعات العلاج في MTs القلب ولكن ليس في MTs الكبدية. معًا ، هذا التأثير الموضّح الخاص بالأنسجة لـ DMSO على الميثيلوم في نضوج MTs القلب ، بينما بدت MTs الكبدية الناضجة غير متأثرة.

من أجل تحليل التأثيرات التنظيمية لـ DMRs ، تم شرح المناطق بسمات تنظيمية معروفة ، مثل المروجين وجزر CpG (CGIs) ومواقع ربط عامل النسخ (TFBS) وفئات مختلفة من العناصر المتكررة (الشكل 4 ب). عززت كل من المناطق التي تحتوي على نسبة عالية من الميثيل ونقص الميثيل فئات متكررة محددة مثل الأقمار الصناعية (نسبة الأرجحية للفرط / الميثيل الناقص: 4.4 / 2.4) والتكرارات البسيطة (نسبة الأرجحية المفرطة / النقص 6.0 / 9.4) ، بينما لم يتم إثراء العناصر المتكررة بشكل عام. كان تأثير DMSO على تنظيم DNMTs وما تلاه من ميثيل مفرط لتسلسل التكرار يتماشى مع النتائج السابقة في أجسام الفئران الجنينية. كما هو متوقع ، تم إثراء المناطق شديدة الميثيل أيضًا في CGIs دون دليل تنظيمي ، على سبيل المثال لا تتداخل مع TFBS والبعيدة عن مواقع بدء النسخ. كانت نسبة الأرجحية لهذه المناطق على الجينوم 5.5. في حين أن CGIs بشكل عام كانت لديها نسبة أرجحية 3.2 ، لم يكن هناك إثراء لـ CGIs المتداخلة TFBS المعروفة في المروجين ، المناطق ذات أفضل إمكانات تنظيمية تمت دراستها. تمامًا مثل مناطق المحفز ، تأثرت الميزات الأخرى مثل exons و introns و TFBS بفرط الميثيل على احتمالات الخلفية الجينية الملتقطة تقريبًا (الشكل 4 ب). على الرغم من أننا وجدنا أمثلة محددة حيث يحدث تفاعل فرط ميثيل المحفز مع قمع النسخ ، لم يلاحظ أي ارتباط عالمي بين مثيلة المروج التفاضلي والتعبير الجيني. تم تخفيض 148 فقط من 1436 جينًا (10.3 ٪) التي تتميز بمحفزات مفرطة الميثيل في MTs القلبي المعالج بـ DMSO. تم الإفراط في التعبير عن 86 من الجينات (6 ٪) ، على عكس التأثير القمعي المتوقع للمثيلة.

مجتمعة ، تضمنت بياناتنا تأثيرًا أساسيًا لـ DMSO على مثيلة الحمض النووي في MTs القلب ، ولكن ليس في MTs الكبدية. أثرت التعديلات المستحثة بشكل تفضيلي على الأقمار الصناعية والتكرارات البسيطة ، بالإضافة إلى CGIs البعيدة عن المروجين دون دليل تنظيمي معروف. لم يكن التعبير عن الجينات المجاورة مرتبطًا بشكل كبير باختلافات المثيلة. لذلك نستنتج أن قمع النسخ عن طريق فرط ميثيل المروج لم يكن التأثير التنظيمي الأساسي لعلامات المثيلة المتغيرة ، لكن النتائج تشير إلى حدوث خلل عالمي في آليات مثيلة الحمض النووي.


الحفظ بالتبريد لبروتوكول فيديو خطوط الخلايا الثديية

لمزيد من بروتوكولات الفيديو ، يرجى زيارة مكتبة بروتوكولات الفيديو الخاصة بنا هنا.

المواد والكواشف

  • 1 - 2 مل كريوفيلز
  • وحدة التجميد CoolCell® (BioCision)
  • وسائط التجميد

الحفظ بالتبريد

قم بتسمية البيانات المبردة مع التاريخ واسم الباحث ورقم الخلية ورقم المرور ونوع الخلية (وأي معلومات أخرى مفيدة ، على سبيل المثال التعديلات الجينية).

إذا كانت الخلايا ملتصقة ، قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا ، وغسلها في برنامج تلفزيوني ، وأضف التربسين بما يكفي لتغطية الخلايا واحتضانها لمدة 2 دقيقة تقريبًا في حاضنة 37 درجة مئوية. إعادة التعليق في وسائط زراعة الخلايا ونقلها إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل.

إذا كانت الخلايا في حالة تعليق ، فما عليك سوى نقل الحجم المطلوب مباشرةً إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل.

عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات لتحديد مدى صلاحيتها. يجب أن تكون صلاحية الخلية 75٪ على الأقل للحفظ بالتبريد.

أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تحضير وسائط التجميد (الجدول 1).

يرجى ملاحظة أن DMSO غير مناسب لجميع أنواع الخلايا ، لذلك يمكن استخدام الجلسرين كبديل.

قم بإزالة المادة الطافية (احتفظ بهذا مطلوبًا لوسائط التجميد ، انظر الجدول 1) وقم بفك الحبيبات برفق.

أضف وسائط التجميد إلى كثافة الخلية المطلوبة. بالنسبة لخلايا الثدييات ، يكون هذا عادةً 1،000،000 / مل من وسائط التجميد. يجب ألا تكون الخلايا في درجة حرارة الغرفة في وسط التجميد لأكثر من 10 دقائق.

قسامة 1 مل في كريوفاليس وتأمين الأغطية.

انقل الأنابيب المبردة إلى CoolCell (في درجة حرارة الغرفة) وضعها في الثلاجة -80 درجة مئوية. ستضمن CoolCell انخفاض درجة الحرارة بشكل ثابت بمقدار 1 درجة مئوية / دقيقة.

بعد حوالي 24 ساعة ، قم بإزالة الأنابيب المبردة من CoolCell ونقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.

استخدم المادة طافية من خطوة جهاز الطرد المركزي (الخطوة 7).

تخلط جيدا ودافئة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

الجدول 1. أنواع مختلفة من وسائط التجميد لخطوط خلايا الثدييات

إذابة خطوط الخلايا المجمدة

  1. قم بإزالة القارورة المبردة من مخزن النيتروجين السائل وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب حوالي 80٪ فقط (لا تذوب في درجة حرارة الغرفة). يجب ألا يستغرق هذا أكثر من دقيقة واحدة.
  2. باستخدام ماصة ، قم بنقل محتويات القارورة إلى أنبوب فالكون سعة 15 مل يحتوي على حوالي 10 مل من وسائط الاستزراع المُسخنة مسبقًا.
  3. أجهزة الطرد المركزي عند 500-1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، وتجاهل المادة الطافية وإعادة التعليق في الكمية المناسبة من وسائط زراعة الخلايا.
  4. نقل الخلايا إلى وعاء الثقافة ونقلها إلى حاضنة 37 درجة مئوية.

أسئلة وأجوبة

لماذا لا يمكنني ترك الخلايا تذوب في درجة حرارة الغرفة؟

يجب إذابة الخلايا بشكل عام في أسرع وقت ممكن ، فوق درجة حرارة الغرفة. وذلك لأن عملية الذوبان البطيئة يمكن أن تتلف الخلايا.

تحتوي وسائط التجميد على عوامل الحماية من التجمد الأساسية ، مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، لمنع تكوين بلورات الجليد داخل الخلايا وخارجها التي يمكن أن تلحق الضرر بغشاء الخلية ومكوناتها. DMSO له عيب في كونه سامًا للخلايا ، وبالتالي يجب إذابة الخلايا بسرعة أكبر مما هو ممكن في درجة حرارة الغرفة من أجل تسهيل التخفيف السريع وإزالة DMSO من البيئة المباشرة للخلايا.

تساعد عملية التجميد البطيء (-1 درجة مئوية في الدقيقة) أيضًا على منع تكوين بلورات الجليد داخل الخلايا من خلال السماح بتدفق كافٍ من الماء قبل التجميد. يخدم ذوبان الخلايا بسرعة غرضًا إضافيًا وهو منع أي بلورات تكونت أثناء عملية التجميد من إتلاف غشاء الخلية أو مكوناتها.

​​ كم من الوقت يمكنني تخزين الخلايا المحفوظة بالتبريد؟

يمكن الاحتفاظ بالخلايا المجمدة وفقًا للبروتوكولات لعدة سنوات في النيتروجين السائل. من الناحية المثالية ، لا ينبغي تخزين الخلايا المجمدة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لفترات طويلة من الوقت (تصل إلى أسبوع واحد) ويجب نقلها إلى النيتروجين السائل كلما أمكن ذلك. يمكن أن يؤدي تخزين الخلايا عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لفترات طويلة إلى الإضرار بقدرة الخلية على البقاء.

هل وجدت هذا البروتوكول مفيدًا؟ عرض بروتوكول خلايا العد لدينا.


فيديو: ذوبان الخلايا

يقدم هذا الفيديو أفضل طريقة لإذابة الخلايا دون الإضرار بها في هذه العملية المجهدة. يوضح علماؤنا كيفية نقل الخلايا بعناية من التخزين في النيتروجين السائل إلى الحاضنة.

يصف البروتوكول التالي أ الإجراء العام لإذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد. للحصول على بروتوكولات مفصلة ، راجع دائمًا إدراج المنتج الخاص بالخلية.

  1. قم بإزالة القارورة المبردة التي تحتوي على الخلايا المجمدة من مخزن النيتروجين السائل و فورا ضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. قم بإذابة الخلايا بسرعة (& lt 1 دقيقة) عن طريق تحريك القارورة برفق في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يتبقى القليل من الثلج في القارورة.
  3. نقل القارورة إلى غطاء التدفق الصفحي. قبل الفتح ، امسح الجزء الخارجي من القنينة باستخدام 70٪ من الإيثانول.
  4. انقل المقدار المطلوب من وسط النمو الكامل المُسخَّن مسبقًا والمناسب لخط الخلية قطرة في أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الخلايا المذابة.
  5. الطرد المركزي المعلق الخلوي بحوالي 200 × جم لمدة 5-10 دقائق. تختلف سرعة ومدة الطرد المركزي الفعلية تبعًا لنوع الخلية.
  6. بعد الطرد المركزي ، تحقق من وضوح المادة الطافية ورؤية الحبيبات الكاملة. معقم معقم صبغ المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
  7. أعد تعليق الخلايا برفق في وسط نمو كامل ، وانقلها إلى وعاء الثقافة المناسب وفي بيئة الثقافة الموصى بها.

ملحوظة: يعتمد حجم القارورة المناسب على عدد الخلايا المجمدة في القارورة المبردة ، وتختلف بيئة المزرعة بناءً على نوع الخلية والوسائط.


  • نهج عملي صارم، إلى جانب التركيز القوي على التعلم السريري التجريبي - في كل من جناح الفحص بالموجات فوق الصوتية الحديث وفي المستشفيات والعيادات التابعة - يوفر لك ميزة تعليمية رائعة.
  • منهجنا المستقبلي يدمج التكنولوجيا والرعاية الصحية لإعداد الخريجين لفرص وظيفية هائلة حيث يمكنك الإدارة والقيادة في البيئات التي تتلاقى فيها التكنولوجيا والطب.
  • أعضاء هيئة تدريس متحمسون وجذابون هم قادة وطنيون في مجال التعليم بالموجات فوق الصوتية وملتزمون تمامًا بمساعدتك على التطور لتصبح خبيرًا وقائدًا استثنائيًا.
  • خيار استثنائي لبرامج ما قبل الطب والدراسات العليا في مهن الرعاية الصحية. مع إضافة بعض الدورات الإضافية ، يغطي منهج البرنامج العمل الدراسي المطلوب الذي يجعلك مرشحًا قويًا لبرامج الطب أو طب الأسنان أو برامج الدراسات العليا الأخرى في العلوم الطبية أو الصحية.

تخيل الاحتمالات التي يمكن أن تنتج عن حضور برنامج الموجات فوق الصوتية المصنف على المستوى الوطني والذي يضم مجموعة مسح ضوئي حديثة وحديثة حيث يتم تدريس الفصول من قبل أعضاء هيئة التدريس المتميزين الذين هم قادة في مجالهم. والنتيجة هي تجربة تعليمية من الدرجة الأولى ، تكتمل بسنة واحدة من التدريب السريري في الموقع ، والتي تحدد لك طريقًا للنجاح في مجال رعاية صحية ديناميكي.

ما هو التشخيص الطبي بالموجات فوق الصوتية؟

أحدث التصوير بالموجات فوق الصوتية الطبي التشخيصي ، الذي يشار إليه أيضًا بالموجات فوق الصوتية ، ثورة في مجال الطب. يوفر فرصة فريدة في تشخيص وتقييم وعلاج الأمراض والحالات الطبية دون استخدام الجراحة أو حقن الأصباغ أو الإشعاع. التصوير فوق الصوتي الطبي التشخيصي هو أداة تصوير طبي تشخيصية غير جراحية وغير سامة تستخدم فيها موجات صوتية عالية التردد لإنتاج صور لجسم الإنسان. يتم استخدام الموجات فوق الصوتية بسهولة لتصوير القلب وتدفق الدم وأعضاء البطن بالإضافة إلى الجنين النامي والأعضاء التناسلية الذكرية / الأنثوية. لكن الموجات فوق الصوتية وجدت نفسها كأداة رعاية صحية مهمة تتجاوز الأشعة ، والولادة / النساء ، والأوعية الدموية ، وأمراض القلب. يتم استخدامه الآن في مجالات مثل طب الطوارئ وجراحة العظام والطب الرياضي وطب العيون وأمراض الروماتيزم وطب الآلام والعناية المركزة والمزيد. نمت المهنة بسرعة في العشرين عامًا الماضية ومن المتوقع أن تستمر الوظائف في التصوير فوق الصوتي الطبي التشخيصي في النمو خلال العقود العديدة القادمة. يشير تقييم سوق العمل ، والتقدم في التكنولوجيا الطبية ، ومسح لأصحاب العمل الحاليين إلى وجود طلب قوي على أخصائيي تخطيط الصدى المدربين جيدًا.

كيف تصبح مصور الموجات فوق الصوتية الطبية التشخيصية

إن درجة التصوير بالموجات فوق الصوتية الطبية التشخيصية لدينا عبارة عن برنامج مدته أربع سنوات يتضمن تدريبًا إكلينيكيًا لمدة عام واحد. RIT هي واحدة من عدد قليل جدًا من الكليات التي لديها برامج الموجات فوق الصوتية في الولايات المتحدة والتي تؤدي إلى بكالوريوس العلوم في التصوير فوق الصوتي الطبي التشخيصي.

يوفر برنامج الموجات فوق الصوتية في RIT تعليمًا شاملاً في التصوير فوق الصوتي. يبدأ البرنامج بأساس متين في علم الأحياء ، وعلم التشريح البشري وعلم وظائف الأعضاء ، وعلم التشريح المستعرض البشري. تشمل دورات التصوير بالموجات فوق الصوتية محاضرات تعليمية مكثفة مع مسح كامل بالموجات فوق الصوتية في جناح المسح بالموجات فوق الصوتية الحديث ، حيث يحصل الطلاب على تعليمات عملية في أدوات التصوير بالموجات فوق الصوتية ومهارات المسح بالموجات فوق الصوتية وتقنيات تقييم الأوعية الدموية ، والتوليد ، وأمراض النساء ، والبطن. وتصوير الأجزاء الصغيرة بالموجات فوق الصوتية. تحدث هذه الدورات قبل التدريب السريري لمدة عام واحد ، حيث يعمل الطلاب في مجموعة من أماكن الرعاية الصحية (المستشفيات ، ومراكز العيادات الخارجية ، ومكاتب الأطباء ، وما إلى ذلك) حيث يكملون تعليم التصوير بالموجات فوق الصوتية مع الموجهين والأطباء وغيرهم من المهنيين الطبيين . دورات في رعاية المرضى والفنون الحرة تكمل دراستك. بالإضافة إلى تطوير قدرات المسح والتشخيص التي تركز على الصلة بالممارسة السريرية ، يركز البرنامج أيضًا على المهارات في الإدارة والقيادة والبحث. ستكون مستعدًا لشغل وظائف في التصوير فوق الصوتي الطبي التشخيصي والمجالات الطبية ذات الصلة ، بالإضافة إلى كلية الطب وبرامج الدراسات العليا في العلوم الصحية. هذا برنامج يوفر تعليمًا شاملاً وعالي الجودة في التصوير بالموجات فوق الصوتية الطبية. سوف تتخرج معدة جيدًا ومدربًا جيدًا ومطلوبًا في مكان العمل.

تطبيق معرفتك

من خلال نهج عملي صارم ، إلى جانب التركيز على التعلم التجريبي ، ستكتسب ثروة من الخبرة في تطبيق ما تعلمته في محاضرات الفصل والخبرات المعملية على مجموعة متنوعة من مواقف الحياة الواقعية. أعضاء هيئة التدريس المتفانون ملتزمون ومتحمسون لتعليمك ويلتزمون تمامًا بتطوير قادة وقادة متميزين.

Graduates are prepared to pursue a variety of careers in diagnostic medical sonography, nationally and internationally, in medical, industrial, and educational settings. Graduates can be found in a wide range of supervisory and administrative positions in hospitals, clinics, private physicians’ offices, teaching, research, sales, and industry. Graduates also can work as freelance sonographers or for mobile services.

Medical Community Support

Our diagnostic medical sonography degree benefits from a comprehensive, supportive medical community comprised of highly-trained radiologists, physicians, sonologists, sonographers, and echocardiographers that guide, educate, and train our students. Many of these professionals are involved in teaching our students both on-campus and at off-campus clinical sites. Our partner clinical sites also employ many of our graduates. Through these interactions, you are exposed to generous and dedicated health care professionals who will enhance your education through professional development, increase your awareness of community needs, and share a sense of cooperative spirit in which medicine is practiced. In addition, many of our clinical instructors, echocardiographers, and sonographers are alumni of our program and are familiar with the standards, expectations, and rigor of the ultrasound program. Learn more about the program's affiliated faculty.

Ultrasound Program Outcomes and Attrition Rate

RIT’s diagnostic medical sonography degree has exceptional passing rates on the national examinations:

The program has a very low attrition rate (0%) and a retention rate of 100%. Job placement is also 100%.

Additional Sonography Education Opportunities

In addition to the bachelor of science in diagnostic medical sonography, RIT also offers two diagnostic medical sonography certificate programs: a certificate in diagnostic medical sonography and a certificate in echocardiography (cardiac ultrasound). Both of these options are not only designed to meet the growing needs of the national and international medical communities but also the needs of individuals who:

  • Hold a degree in the life sciences and other closely related degrees who are interested in that may be approved by the program director. Additional pre-requisite course work may be required for any type and level of degree.
  • Have a current, active license or registry in an area of medical or allied health sciences, some examples of medical or allied health sciences areas include respiratory therapy, nuclear medicine, physical therapy, radiography (x-rays), nursing, and more. Any of the more than 200 medical or allied health sciences fields also will be considered.

Sonography as a Pre-Med Option

Being accepted into a medical graduate program requires certain qualifications, including completing prerequisite courses, a strong academic record, acquiring pertinent experiences in the field, and developing key intrapersonal and interpersonal qualities. The Premedical and Health Professions Advisory Program works with all students on an individual basis to help them become competitive candidates for admission to graduate programs in the medical and health professions.

The diagnostic medical sonography degree has assisted students in entering the worlds of medicine and dentistry. With the addition of a few courses, and without extending your time at RIT, the ultrasound program can prepare you for medical, dental, or other graduate school programs in the medical or health sciences. Graduates of the ultrasound program have gone on to become physicians, dentists, chiropractors, and more. Learn more about how diagnostic medical sonography degree can be used as a pre-med option.

Sonography Education Resources

Program Policy and Procedures Handbook/Technical Standards
Please refer to these two documents for more information:

Prospective students are invited to view the diagnostic medical sonography program brochure.

Accelerated 4+1 MBA

An accelerated 4+1 MBA option is available to students enrolled in any of RIT’s undergraduate programs. RIT’s Combined Accelerated Pathways can help you prepare for your future faster by enabling you to earn both a bachelor’s and an MBA in as little as five years of study.

We safely invite you to campus for small group tours and information sessions.

Find out what amazing looks like.

Watch video series on student perspectives, academics, admissions, and more.

60+ future-focused workshops for rising high school seniors to plan for college.


Nanotoxicity and regulatory aspects in musculoskeletal regeneration

2.3 Methods to determine the compatibility

Biocompatibility of nanomaterial has gained considerable attention to measure the nanomaterial safety during drug delivery applications. To ensure their biocompatibility, nanomaterial should be stable in physiological environments. There are several methods that are predominantly utilized to determine the compatibility of a nanoparticle (NP). Three major methods have been focused on the compatibility determination of NP, including in vitro cell viability assay, in vitro hemolysis assay, and in vivo zebrafish toxicity studies.

2.3.1 In vitro cell viability assay

Cell viability or cytotoxicity of the NPs may be characterized by in vitro cell culture models. The MTT assay is frequently used to provide preliminary information of the performance of NPs in vitro [132] . Cells are treated with known concentrations of synthesized bare NPs to determine the in vitro cytocompatibility or cell viability. The IC50 concentration is a criterion to evaluate cell line compatibility and the inhibitory concentration for NPs. The choice of cell line for a particular study on cytotoxicity depends upon the disease targeted.

2.3.2 In vitro hemolysis assay

Nanosized drug carriers are highly recommended (from internationally recognized standard ISO-10993) to test their biocompatibility against blood cells [133] . The hemolysis assay is performed to test the hemolytic activity of the NPs by studying their effect on erythrocytes. If the material is highly compatible with blood cells (especially red blood cells, RBCs), it should not produce any morphological changes, and thus the medium remains colorless due to the coagulation property of blood cells [134] . However, in the presence of toxic materials, hemolysis occurs through the disintegration of RBCs that completely turns the medium into red color.

2.3.3 In vivo zebrafish embryo toxicity

Zebrafish is an appropriate animal model used extensively in the fields of developmental biology and medical sciences including toxicology [135, 136] . The model is highly useful since zebrafish and humans have similar characteristics and are genetically similar in early embryonic development and disease processes [137] . الزرد (دانيو ريريو) is small in size, has high fecundity, is inexpensive, and is relatively easy to maintain, and their developmental stages are fast.


Overview of creating artificial cell competency

The first protocol for artificial transformation of بكتريا قولونية was published by Mandel and Higa in 1970 [3]. The procedure showed increased permeability of the bacterial cells to DNA after treatment with calcium (Ca 2+ ) and brief exposure to an elevated temperature, known as heat shock. This method became the basis for chemical transformation. In 1983, Douglas Hanahan published an improved method to prepare competent cells, where optimal conditions and media for bacterial growth and transformation were identified for higher transformation efficiency [4].

As an alternate approach to chemical transformation, an electrical field can be applied to the cells to enhance the uptake of DNA, a method known as electroporation (الشكل 2). In 1982, Neumann et al. reported introduction of foreign DNA into mouse cells by short pulses of high-voltage electric fields [5]. Such electric fields are believed to increase the cell’s membrane potential, thereby inducing transient permeability to charged molecules like DNA. In 1988, transformation of بكتريا قولونية cells by electroporation was published [6].

Figure 2. Chemical transformation vs. electroporation.


Calculating Concentrations for PCR

i) Oligonucleotide primers are generally supplied as "so many OD units/ml" - but what does this mean, in terms of mg/ml, or mmol/ml, etc?

منح: a primer is Y nucleotides (nt) long

منح: the MW of ssDNA is (330 daltons per nt) x (length in nt) (Sambrook et al., 1989 p. C.1)

منح: the concentration of primer (=ssDNA) producing an OD of 1 at 254 nm in a 1 cm cuvette, is 37 ug/ml

ثم: the MW of the primer is 330.Y daltons

And: X OD/ml = 37.X ug/ml = 37.X mg/l = 37.X /330.Y mM = 37.X.1000/330.Y uM

على سبيل المثال:

B 88/77 primer - a 17-mer oligodeoxynucleotide - as supplied is 12.6 OD units/ml. We need to make a 5 uM stock solution for PCR.

MW: 17 x 330 = 5610

تركيز: 12.6 OD x 37 ug/ml = 466 ug/ml = 466 mg/l = 0.466 g/l

Molarity: 0.466/5610 = 0.000083 Molar = 83 uM

وبالتالي: we need 5 ul of oligo stock solution in 83 ul (+78 ul water) to make a 5 uM solution (if 1 ul in 83 ul gives a 1 uM soln. )

ii) Calculation of amounts for PCR reactions: if we need a final concentration of 0.5 uM oligo in the PCR reaction mix (final volume 50 ul), we add 5 ul of 5 uM stock to the reaction mix (1/10 final dilution).

B) Nucleotides:

Stocks of nucleotides for PCR (or other procedure) are NEARLY ALWAYS dNTP s (deoxynucleotides), and concentrations is almost always given in EACH dNTP: that is, the given concentration is EACH nucleotide in the mix, NOT the total concentration. This means that a 2.5 mM dNTP mix for PCR contains 2.5 mM of EACH dNTP, and 10 mM TOTAL dNTPs.

مثال:

i) Make up a 2.5 mM stock solution of dNTPs from stock 100 mM individual dNTPs, supplied by Promega:

  • FIRST mix equal volumes of each nucleotide (eg: 50 ul): this gives you 200 ul of 25 mM mixed dNTPs (Remember: concn. expressed in EACH dNTP).
  • من ثم dilute this (or aliquot) 1/10 with WATER - aliquot into 100 ul amounts and freeze.

ii) Prepare a 1 mM stock of dNTPs with dTTP substituted to 10% (w/w) by digoxigenin-11-dUTP (DIG-dUTP) for use as a labelling mix for PCR labelling of PCR products:

  • DIG-dUTP supplied (by Boehringer Mannheim) at 25 nmol/25ul = 1 umol/ml = 1mM final concentration of DIG-dUTP must be 1/10th that of other nucleotides, and [DIG-dUTP] + [dTTP] must = [any other dNTP]. Therefore to get a 1 mM dNTP stock one must dilute DIG-dUTP stock 1/10.
  • FIRST dilute separate 100 mM dNTP stocks to 10 mM (eg. 5 ul to 50 ul, in water).
  • من ثم mix equal volumes (eg. 10 ul) of 10 mM dCTP, dGTP and dATP stock, and 9/10ths volume of dTTP (9 ul). Add equal volume (eg. 10 ul) of of 1 mM DIG-dUTP.
  • من ثم add water to 10 vol (=100 ul add 51 ul): final concentration each dNTP = 1 mM final concn DIG-dUTP = 0.1 mM, and of dTTP = 0.9 mM.

iii) USE mix made above at 50 uM each dNTP in a PCR reaction mix, final volume 25ul: