معلومة

38: TTC Motility Agar - علم الأحياء


أهداف التعلم

  • حدد طرقًا مختلفة لإجراء اختبار الحركة

بطاقة SIM

أعماق SIM عبارة عن وسيط متعدد الاختبارات يشتمل على 3 اختبارات: كبريتيد (H2غاز S) ، وإنتاج الإندول ، والحركة. لقد قمت بالفعل باختبار القدرة على الحركة عبر شريحة الإسقاط المعلقة ، وإليك طريقة إضافية لتحديدها ، بأقل ضجة وضوضاء. في الواقع ، هناك طريقة أفضل لتحديد الحركة ، أجار الحركة صبغة تترازوليوم، التي ستستخدمها أيضًا في المختبر. كل من هذه الآجار لها مزايا. بطاقة SIM هي في الواقع 3 اختبارات في واحد ، ولكن من ناحية أخرى ، فإن القدرة على الحركة مع التيترازوليوم أسهل بكثير للقراءة من أجل الحركة. التيرازوليوم هو ملح عديم اللون يصبح أحمر عند اختزاله ، ويحدث نتيجة التمثيل الغذائي البكتيري.

اختزال الميتوكوندريا لـ MTT إلى منتج فورمازان أزرق من ويكيبيديا (الائتمان: روغان جرانت).

المواد المطلوبة

  • أجار SIM عميق لكل كائن حي
  • 1 أجار متحرك TTC مع صبغة تترازوليوم لكل كائن حي
  • الكائنات الحية: كليبسيلا ، إي كولاي

الإجراء

  1. تلقيح في أنبوب وسائط SIM بإبرة ، وصولاً إلى الأسفل.
  2. تلقيح في أنبوب من أجار TTC الحركي بصبغة تترازوليوم بإبرة ، وصولاً إلى القاع.
  3. احتضان عند 25 أو 37 درجة مئوية.

ترجمة

بطاقة SIM

  1. أمسك الأنبوب أمام الضوء وانظر إلى خط الطعنة لتحديد القدرة على الحركة.
  2. إذا كان غير متحرك ، فسترى خط الطعنة المستقيم السليم.
  3. إذا كان MOTILE ، سينتشر خط الطعنة الأصلي في الوسط حيث تنتشر البكتيريا في جميع أنحاء. في الواقع ، قد لا تتمكن حتى من رؤية خط طعنة على الإطلاق: قد يكون عكرًا في جميع أنحاء الوسط. لهذا السبب ، قد ترغب في مقارنة بطاقة SIM الملقحة ببطاقة غير محصنة.

أجار الحركة مع تترازوليوم

ينطبق نفس الوصف أعلاه على هذه الوسيلة ، ولكن مع الصبغة الملونة المضافة والمفيدة التيترازوليوم والتي تتحول إلى اللون الأحمر نتيجة لعملية التمثيل الغذائي للبكتيريا.

أسئلة

  1. ما هي وظيفة التيرازوليوم؟
  2. كيف يمكنك معرفة ما إذا كان الكائن الحي متحركًا؟

اختبار حديد السكر الثلاثي (TSI) & # 8211 المبدأ والإجراء والاستخدامات والتفسير

تمتلك معظم البكتيريا القدرة على تخمير الكربوهيدرات ، وخاصة السكريات. من بينها ، يمكن لكل بكتيريا تخمير بعض السكريات فقط ، في حين أنها لا تستطيع تخمير البعض الآخر. وبالتالي ، فإن السكريات التي يمكن للبكتيريا تخمرها والسكريات التي لا تستطيع تخمرها هي خاصية البكتيريا وبالتالي معيار مهم لتحديد هويتها.

اختبار حديد السكر الثلاثي (TSI) هو اختبار ميكروبيولوجي سمي لقدرته على اختبار قدرة الكائنات الحية الدقيقة على تخمير السكريات وإنتاج كبريتيد الهيدروجين. يتم استخدام مائل أجار لوسط خاص به سكريات متعددة تشكل صبغة حساسة لدرجة الحموضة (أحمر الفينول) ، 1٪ لاكتوز ، 1٪ سكروز ، 0.1٪ جلوكوز ، وكذلك ثيوسلفات الصوديوم وكبريتات الحديدوز أو كبريتات الأمونيوم الحديدية. الاختبار. كل هذه المكونات عند مزجها معًا وتسمح بالتصلب بزاوية ينتج عنها أنبوب اختبار أجار بزاوية مائلة. يوفر الشكل المائل لهذه الوسيلة مجموعة من الأسطح التي تتعرض إما للهواء المحتوي على الأكسجين بدرجات متفاوتة (بيئة هوائية) أو غير معرضة للهواء (بيئة لاهوائية) يتم بموجبها تحديد أنماط تخمير الكائنات الحية.


1. جبل الرطب 2. اختبار حركة الأنبوب

إجراء :

1. قم بعمل تعليق لمستعمرة من كائنات الاختبار في الماء المقطر على شريحة زجاجية. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام حلقة من الوسط من ثقافة مرق طازجة. ضع غطاء زجاجي عليها. افحص تحت المجهر باستخدام محلول هيبوكلوريت لاحتوائه على كائنات حية.

2. طريقة الإسقاط المعلق: قم بتنظيف قسيمة الغطاء. ضعي الفازلين على أركانه الأربعة. ضع قطرة من الماء المقطر في المركز واستحلب مستعمرة من كائنات الاختبار. ضع الشريحة الزجاجية عليها برفق وأمسكها من أعلى لأسفل. انظر تحت المجهر مع هدف 10x ثم 40X. شوهدت هوامش القطرات على وجه التحديد. من الواضح أن الكائنات المتحركة تتحرك بسرعة في الميدان. تظهر الكائنات الحية غير المتحركة حركة براونية ذهابًا وإيابًا ، لكن هذه الكائنات لا تتحرك فيما يتعلق ببعضها البعض.


نظام اختبار قائم على أجار أحادي الأنبوب لتحسين الحركة والتقاط المناعي لـ الإشريكية القولونية O157: H7 بواسطة H7 الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد الفوطي

تين. 1. رسم تخطيطي يوضح التحضير والتلقيح لنظام الاختبار القائم على أجار أحادي الأنبوب. مبدأ الطريقة هو أن تعزيز الحركة بواسطة TSB (0.4٪ [وزن / حجم] أجار) والأسر المناعي اللاحق للبكتيريا المسوط H7 في طبقة الأجار الوسطى التي تحتوي على أجسام مضادة خاصة بالسوط H7 تؤدي إلى تأخير أو توقف الحركة من خلال طبقة أجار الوسطى. تين. 2. أنابيب تمثيلية تظهر حركية بكتريا قولونية سلالات O157: H7 على وسائط MIO و TSBA. يشير الأنبوب 1 إلى درجة حركية تبلغ 4 في وسط MIO ويوضح أيضًا المظهر المتنوع أو الضبابي لهذه الوسيلة. تُظهر الأنابيب 2 و 3 و 4 نموًا في وسط TSBA مع درجات نمو 4 و 3 و 2 على التوالي. تين. 3. أنابيب تمثيلية تظهر ردود فعل بكتريا قولونية O157: H7 مع H7 المصل المضاد يمتص في طبقة الأجار الوسطى. (أ) بكتريا قولونية O157: H7 سلالة 36E1. الأنابيب 5 و 6 تحتوي على 30 ميكرولتر من محلول ملحي معقم (0.85٪ [وزن / حجم] كلوريد الصوديوم) و 30 ميكرولتر من مضاد H7 ، على التوالي ، لكل مل من وسط TSBA. يحتوي الأنبوبان 7 و 8 على 60 ميكرولتر من محلول ملحي و 60 ميكرولتر من مصل H7 ، على التوالي ، لكل مل من وسط TSBA. يظهر تأخر نمو أكبر في الأنبوب 8. (B) بكتريا قولونية O157: H7 سلالة ATCC 43894. الأنبوبين 9 و 10 يحتويان على 30 ميكرولتر من محلول ملحي معقم (0.85٪ [وزن / حجم] كلوريد الصوديوم) و 30 ميكرولتر من مضاد H7 ، على التوالي ، لكل مل من وسط TSBA. تحتوي الأنابيب 11 و 12 على 60 ميكرولتر من محلول ملحي و 60 ميكرولتر من مصل H7 ، على التوالي ، لكل مل من وسط TSBA. يظهر تأخر نمو أكبر في الأنبوب 12.

نقاش

تمتلك البكتيريا سالبة الجرام ستة آليات مختلفة على الأقل لنقل البروتينات عبر الأغشية البكتيرية (تمت مراجعتها في المرجع 5). من بين هذه المسارات الستة ، تمت الإشارة إلى إفراز البروتين الناجم عند ملامسة البكتيريا للخلايا المضيفة باسم مسار الإفراز من النوع الثالث (10). تشمل متطلبات مسارات الإفراز من النوع الثالث عدم وجود تسلسل إشارة أمينية نهائية قابلة للانقسام ، كارهة للماء في البروتين المفرز ، وتصدير البروتين عبر الأغشية البكتيرية الداخلية والخارجية بدون وسيط محيطي ، وإشارة للحث على الإفراز (23). تتطلب معظم البروتينات المفرزة من النوع الثالث ولكن ليس كلها على ما يبدو مرافقات (7 ، 8). لقد أظهرنا ذلك في مكان آخر C. jejuni توليف مجموعة جديدة من البروتينات عند الزراعة مع الخلايا الظهارية ، والتي يفرز بعضها (22 ، 37). البروتينات المفرزة سميت بـ كامبيلوباكتر مستضدات الغزو (بروتينات Cia) لأنها وُجدت ضرورية للغزو الأقصى للخلايا الظهارية المعوية بواسطة C. jejuni (22 ، 30 ، 37). نظرًا لأن بروتينات Cia يتم تصنيعها وإفرازها استجابةً لمحفز بيئي ولا تتم معالجة بروتين CiaB المُفرَز ، يبدو أن بروتينات Cia تتوافق مع معايير بروتينات النوع الثالث. ومع ذلك ، فإن البحث عن C. jejuni كشف الجينوم أن نظام التصدير الوحيد الظاهر من النوع الثالث في C. jejuni هو الجهاز السوطي.

يوجد قدر كبير من الأدلة على أن الحركة ضرورية لتحقيق أقصى استعمار للحيوانات من خلال C. jejuni (32 ، 33 ، 34 ، 36 ، 42). بالتوازي مع هذه الدراسات ، تم عمل إضافي لتشريح أهمية الحركة مقابل الجلد الفعلي في تفاعل C. jejuni مع الخلايا الظهارية المستزرعة (15 ، 41 ، 43). استهدف المحققون الجينات التي تشفر مختلف المكونات الهيكلية السوطية ، وبينما تم الإبلاغ عن تناقضات فيما يتعلق بالأنماط الظاهرية لطفرات معينة (14 ، 43) ، يبدو أن هناك إجماعًا بين الباحثين على أن الحركة تلعب دورًا في C. jejuni طريقة تطور المرض. علاوة على ذلك ، فإن الحركة والتعبير عن fla من الواضح أن الجين ضروري للغزو الأقصى للخلايا حقيقية النواة ولانتقال C. jejuni عبر الخلايا المستقطبة (15 ، 41). ربما أكثر صلة بهذه الدراسة ، الاختلافات في إمكانات الغازية C. jejuni flaA (flaB & # x0002b ) و C. jejuni flaA flaB سلالات لوحظت في دراسات سابقة C. jejuni flaA (flaB & # x0002b ) تم الإبلاغ عن سلالات أكثر توغلاً من سلالات C. jejuni flaA flaB سلالة (15 ، 41). ومن الجدير بالذكر أيضًا أن غزو أ C. jejuni flaA (flaB & # x0002b ) تم تعزيز السلالة بمقدار 10 أضعاف من خلال تعزيز الاتصال بين الخلية المضيفة للبكتيريا عبر الطرد المركزي ، في المقابل ، لم تغير خطوة الطرد المركزي الإمكانات الغازية للبكتيريا المضيفة C. jejuni سلالة من النوع البري (40). بناءً على الاختلاف الملحوظ في الإمكانات الغازية لـ C. jejuni flaA (flaB & # x0002b ) سلالة مقابل C. jejuni flaA flaB سلالة ، جرانت وآخرون. (15) خلص إلى أن الهيكل السوطي لعب دورًا في الاستيعاب المستقل عن الحركة. قبل هذه الدراسة ، لم يكن من الواضح كيف يمكن أن يكون للجلد أي تأثير C. jejuni غزو ​​الخلية المضيفة بخلاف منح الحركة أو العمل مباشرة كمادة لاصقة.

بالنظر إلى عملنا السابق الذي يشير إلى أن بروتينات Cia يتم إفرازها بطريقة تعتمد على النوع الثالث وغياب نظام إفراز من النوع الثالث مخصص لتصدير بروتينات الفوعة في C. jejuni الجينوم ، أجريت تجارب لتحديد ما إذا كان السوط بمثابة جهاز تصدير Cia. الطفرات التي ألغت تصدير السوط (flhB, flgB, flgC، و flg) ، هيكل خيوط (fliD, fla, شحم) ، وتوليف الشعيرات (fli). مع هذه المسوخ ، أظهرنا ذلك C. jejuni ترتبط الحركية والفوعة. على وجه التحديد ، نظهر أن C. jejuni يتم إفراز بروتينات Cia عن طريق جهاز تصدير السوط. نظام الإفراز الذي يستخدمه C. jejuni يبدو أنه فريد من نوعه لأن أيًا من بروتينات الخيوط مطلوب لإفراز بروتين Cia.

لاختبار ما إذا كانت مكونات الجهاز السوطي بمثابة C. jejuni جهاز تصدير Cia ، تم إجراء تجربتين منفصلتين. تم إنشاء الطفرات في العديد من الجينات الهيكلية السوطية في C. jejuni سلالة F38011 لتحديد ما إذا كان فقدان جهاز سوطي تشغيلي أدى إلى فقدان تصدير Cia. بالإضافة إلى ذلك ، مع اثنين من المسوخ C. jejuni سلالة 81116 التي كانت معيبة في التعبير عن أحد خيوط السوط أو كلاهما بالإضافة إلى تصدير بروتين Cia ، قمنا باختبار ما إذا كانت استعادة خيوط السوط تستعيد أيضًا تخليق بروتين Cia. الطفرات التي أثرت على تصدير مكونات السوط (flhB) أو المكونات الهيكلية غير الخيطية (flgB, flgC، و flg) أدى إلى النمط الظاهري S & # x02212. تم الحصول على نتائج مقارنة مع ثانية C. jejuni سلالة ، 81116 ، حيث تقوم الجينات بترميز خيوط السوط (fla و شحم) تم تحورها. استكمال عيب الشعيرة السوطية في 81116 بأي منهما fla أو شحم استعادة قدرة الكائن الحي على إفراز بروتينات Cia. للتأكد من أن النمط الظاهري S & # x02212 الذي يعرضه C. jejuni 81116 flaA flaB متحولة لم تكن فريدة من نوعها لسلالة معينة ، أ C. jejuni F38011 flaA flaB تم إنشاء متحولة. ال C. jejuni F38011 flaA flaB عرض متحولة أيضًا النمط الظاهري S & # x02212 (غير معروض). لذلك ، فإن الأدلة الجينية المقدمة تتوافق مع إفراز بروتين Cia من خلال نظام التصدير السوطي.

إدخال الطفرات fliD (Cj0548) و flgC (Cj0527c) كان من المتوقع أن يكون له تأثير قطبي على التعبير الجيني المصب. نظرًا لأنه من المتوقع أيضًا أن ترتبط جينات المصب في هذه العوامل المفترضة بالتخليق الحيوي السوطي ، فقد توقعنا أن يكون النمط الظاهري المرتبط بالقطبية على جينات المصب مشابهًا لنمط الجين المستهدف. فيما يتعلق ب flgB و flgC, fliE (Cj0525c) و pbpB (Cj0524) ستتأثر أيضًا. في حالة fliD, fliS (Cj0549) وإطار قراءة افتراضي مفتوح ليس له وظيفة معروفة (Cj0550) سيتأثران.

حقيقة أن كمية بروتين FlaA قد تم تقليلها في lysates كامل الخلية من C. jejuni flgB, flgC، و flg المسوخ ، كما تم الحكم عليه من خلال تحليل اللطخة المناعية مع المصل المضاد للسوط ، أثار احتمال أن C. jejuni قد تمتلك عامل FlgM المضاد سيجما. في البكتيريا مثل السالمونيلا, يرسينيا، و هيليكوباكتر بيلوري، يمنع المنظم السلبي FlgM نسخ السوط استجابةً لمركب جسم خطافي قاعدي معيب (6 ، 9 ، 11). بروتين مطابق لمتماثل FlgM المفترض الذي يُظهر تشابهًا مع بروتين FlgM الذي تم تحديده مؤخرًا من جرثومة المعدة (9) تم التعرف عليه في جينوم C. jejuni NCTC 11168 (Cj1464). في S. المعوية التيفي المصلي ، & # x003c3 28 يشارك في تنظيم التعبير الجيني لبروتينات النوع الثالث (13). بالنظر إلى هذه الحقيقة ، من الواضح أن التعبير عن جينات الفوعة في S. المعوية يتأثر serovar Typhi ، وإن كان بشكل غير مباشر ، بـ FlgM وتجميع جهاز تصدير السوط. بغض النظر ، يتم إفراز بروتينات Cia في a C. jejuni fliA (& # x003c3 28) متحولة. لذلك ، فإن وكالة المخابرات المركزية لا يمكن أن تخضع الجينات لتنظيم النسخ عبر آلية تتضمن عامل مضاد سيغما FlgM. نتائجنا تتفق مع نتائج Jagannathan et al. (17) الذي لاحظ أن أ C. jejuni fliA عرض متحولة سوطًا مبتورًا تشير هذه النتيجة إلى أن & # x003c3 28 ليست مسؤولة عن نسخ الجينات التي تشفر جهاز تصدير السوط في C. jejuni.

يلعب ATPase FliI دورًا أساسيًا في تجميع الأجهزة السوطية وفي تصدير البروتين السوطي. لمعالجة ما إذا كان النمط الظاهري S & # x02212 لبعض من C. jejuni المسوخ كان بسبب التأثيرات التنظيمية ، والتعبير عن ciaB تم تحليله في C. jejuni F38011 أنا متحولة. بعد إنشاء الطفرة ، تم استخراج الحمض النووي الريبي من البكتيريا التي تمت زراعتها في مرق مولر-هينتون مع 0.05 ٪ deoxycholate تحت ظروف ميكروية. الأهم ، ciaB تم نسخها في C. jejuni F38011 أنا متحولة ، كما يحكم عليها النسخ العكسي- PCR. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيع بروتين CiaB في C. jejuni F38011 أنا متحولة ، كما تم الحكم عليه من خلال تحليل لطخة مناعية مع جسم مضاد خاص بـ CiaB.

تتوافق نتائج هذه الدراسة مع الفرضية القائلة بأن مسار إفراز السوط من النوع الثالث مطلوب لتصدير بروتين Cia. يتطلب إفراز بروتينات Cia جسمًا قاعديًا وظيفيًا وخطافًا وواحدًا على الأقل من بروتينات الفتيل. إلى جانب تجارب وضع العلامات الأيضية التي تم فيها C. jejuni تم فحص سلالات لإفراز البروتين ، وتشير بيانات التقيد والاستيعاب إلى أن الاختلاف في غزو C. jejuni flaA flaB & # x0002b و C. jejuni flaA flaB سلالات ناتجة عن إفراز Cia. بناءً على الأنماط الظاهرية لـ C. jejuni ciaB متحولة (Mot & # x0002b، S & # x02212) ، من الواضح أيضًا أن الحركة ، في غياب إفراز بروتين Cia ، ليست كافية C. jejuni غزو ​​الخلايا الظهارية. نعتقد أن البيانات المقدمة هنا تكشف ما لم يكن واضحًا في السابق حول جهاز تصدير البروتين Cia والعلاقة بينهما C. jejuni حركية وغزو الخلية المضيفة.


تحديد الحركة والتلصق الذاتي العطيفة الصائمية المسوخ بواسطة طفرات الينقولات العشوائية

تين. 1. موقع مواقع إدخال الينقولات داخل C. jejuni الجينوم. تم تحديد تسلسل النوكليوتيدات الذي يحيط بمواقع الإدخال لـ 28 محولًا ، ومواضع موقع الإدخال داخل C. jejuni تم تعيين كروموسوم NCTC11168 (36). يشار إلى المحولات المتورطة في الانجذاب الكيميائي بنوع غامق ، بينما تتم الإشارة إلى المحولات المتورطة في AAG عن طريق التسطير. تين. 2. تحليل اللطخة الغربية لسطح FlaA من 28 متحولة حركية. C. jejuni تم استخلاص بروتينات الغشاء الخارجي باستخدام الجلايسين- حمض الهيدروكلوريك وتم عزلها بالكهرباء بواسطة دوديسيل كبريتات الصوديوم-بولي أكريلاميد الكهربي. بعد نقل الجل ، تم إجراء الكشف المناعي باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة مضاد لـ FlaA. يشار إلى الحركة (Mot) على النحو التالي: + ، 67 إلى 100٪ حركة تحكم ± ، 31 إلى 66٪ حركة تحكم - ، 0 إلى 32٪ حركة تحكم. تم تحديد AAG في مرق MH عند RT لمدة 3 ساعات ويشار إليها على النحو التالي: + ، AAG ± ، حركيات AAG المعدلة - ، لا AAG. flh هو تعريف flh متحولة C. jejuni سلالة 81-176 (27) ، تستخدم كعنصر تحكم سلبي flh ب هو عدد مفترض 480 flh متحولة الإدراج. تين. 3. حركية AAG لـ 28 متحولة حركية. C. jejuni تم حصاد المسوخات الحركية بعد النمو بين عشية وضحاها وتم تعليقها في مرق MH في RT. تمت إزالة عينة 100 ميكرولتر من التعليق بعناية في النقاط الزمنية المشار إليها ، و OD600 تم تحديده. تم تحليل جميع المسوخات الـ 28 ، ومع ذلك ، تم رسم خطوط للطفرات المختارة من أجل الوضوح. تمثل Cj1318 و Cj1333 و Cj1340c و Cj1062 طفرات AAG. محدد flh تم استخدام متحولة (0 ٪ حركية و FlaA -) (الشكل 2) كعنصر تحكم سلبي (27). تم استخدام السلالات 480 و 81-176 كعناصر تحكم إيجابية. تين. 4. مقايسة غزو طفرات AAG. يشار إلى الغزو كنسبة مئوية من غزو السيطرة. تم استخدام السلالة 480 كعنصر تحكم إيجابي ، و fla و flh تم استخدام السلالات كعناصر تحكم سلبية. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي لثلاث تجارب. تين. 5. AAG من C. jejuni على خلايا هيلا. سلالة من النوع البري 480 (مجموعة تحكم) تحتوي على gfp و isogenic flh تحتوي على متحولة حركية gfp تم السماح لها بالالتصاق بخلايا هيلا لمدة 1.5 ساعة وتمت ملاحظتها مجهريًا. (أ و ب) سلالة 480 تحت ظروف التباين الطوري والفلوريسنت ، على التوالي. (ج ود) flh متحولة تحت ظروف التباين الطوري والفلوري ، على التوالي. تين. 6. C. jejuni عائلة NCTC11168 Cj1318. الموضح هو ملف C. jejuni جزء NCTC11168 من الحمض النووي يمثل ثلاثة من طفرات AAG الأربعة (Cj1318 و Cj1333 و Cj1340c) بالإضافة إلى أفراد عائلة Cj1318 الآخرين ، المشار إليهم باللون الرمادي. neuC2, neuB2, neuB3, ptmA، و ptmB من المعروف أنها تؤثر على إضافة حمض السياليك إلى C. jejuni بروتينات (12 ، 23). fla و شحم هي الجينات للوحدات الفرعية الرئيسية والثانوية ، على التوالي.

عزل وتحديد البكتيريا المختزلة للحديد من تربة الجلي

تم عزل واحد وسبعين بكتيريا لاهوائية اختيارية ، قادرة على تقليل أكسيد الحديد في المزرعة النقية ، من ثلاثة أنواع مختلفة من التربة الجليدية. تم انتقاء البكتيريا عشوائياً من صفائح مصبوبة (10 −5 و 10 6) تم تلقيحها بعينات تربة مخففة متسلسلة. جرت محاولة لتحديد هذه السلالات عن طريق الاختبارات المورفولوجية والكيميائية الحيوية. من بين هذه البكتيريا التي تقلل الحديد 71 ، كانت جميعها باستثناء ثلاثة قادرة على تقليل النترات إلى نتريت و 35 تقليل النتريت إلى مركبات غازية (نزع النتروجين) ، ولكن سلالة واحدة فقط (العصوية الرقيقة) أنتجت H.2S. بناءً على خصائصها الفسيولوجية والمورفولوجية ، تم تخصيص 38 سلالة للجنس الزائفة، 31 sporeformers للجنس عصية واثنان كانا يعتبران كورنيفورم (مفصليات؟) بكتيريا. الأنواع التي تم تحديدها كانت ملاحظة. نيتريفيكان (23), ملاحظة. ستوتزيري (8) ملاحظة. الفلوريسين بوتيدا (5), بكتيريا سيريوس العصويه (6), B. cereus فار. mycoides (14) و العصوية الرقيقة (9). لا يمكن تحديد نوعين من العصيات البوغية ، واثنين من pseudomonad غير المصطبغة ونوعان من البكتيريا. تمت مناقشة أهمية إنزيم اختزال نترات النترات (نتراتاز) لهذه البكتيريا للتنفس اللاهوائي وكآلية للحد من الحديد.

العنوان الحالي: Institut für Mikrobiologie der Technischen Hochschule، 61 Darmstadt، Rossdörferstrasse 140، Germany.


المواد والأساليب

السلالات البكتيرية والبلازميدات.

تم سرد السلالات والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول & # x200B Table1. 1. يشفر pPA56 مجال الإشارات السيتوبلازمية لـ Tsr (الأحماض الأمينية 290 & # x02013470) (22). pMS103 يشفر مجالًا مشابهًا من القطران (الأحماض الأمينية 257 & # x02013553) مدمجًا في سحاب ليسين عند نهايته N في pMS105 ، الأحماض الأمينية 212 & # x02013553 من القطران مدمجة أيضًا في سحاب ليسين ، ولكن مع منطقة رابط مرنة إضافية بينهما . تم تحوير المواقع الأربعة للإزالة & # x0002fmethylation في القطران (QEQE) لإنتاج QQQQ في هذين البلازميدات (23). تم الإبلاغ عن جميع الأجزاء السيتوبلازمية الثلاثة لتنشيط CheA kinase ومنح تحيز CW الدوراني للسوط (22 ، 23).


نتائج

تحديد مستقبل كيميائي جديد ، Mcp4

تم إجراء شاشة لتحديد المستقبلات الكيميائية الجديدة ، أو بروتينات الانجذاب الكيميائي التي تقبل الميثيل (MCPs) ، والتي قد تستشعر إشارات لتوجيه الحركة في م. زانثوس. لأن هذه الدراسات بدأت قبل توافر م. زانثوس تسلسل الجينوم ، استخدمنا نهج التهجين لتحديد جينات المستقبلات الكيميائية الجديدة. لقد استفدنا من المجال الطرفي C المحفوظ بدرجة عالية (HCD) لمستقبلات MCP ، والذي يشارك في تحويل الإشارات إلى بروتينات Che (Le Moual and Koshland ، 1996 Zhulin ، 2001). من خلال محاذاة تسلسل MCPs من مجموعة متنوعة من البكتيريا والعتائق ، وهو مجال يمتد من الأحماض الأمينية 180 إلى 381 من DifA ، م. زانثوس تم تحديد نظام الفرق MCP ، على أنه المجال المحفوظ للغاية (الشكل 1 ب). تم استخدام مسبار مطابق لتسلسل ترميز هذا المجال لفحص مكتبة cosmid لـ م. زانثوس الجينوم (Hager وآخرون، 2001). تم تحليل الكوسميدات التي تم تهجينها مع المسبار بشكل أكبر عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية ، وتم استنساخ الأجزاء المهمة وتسلسلها. من بين ستة كوزميدات مهجنة ، احتوت خمسة منها على ديف الجين ، واحتوى cosmid المتبقي على متماثل MCP غير معروف سابقًا ، والذي أطلقنا عليه اسم mcp4. يحتوي Mcp4 على مجالين غشائيين متوقعين في الطرف N بالإضافة إلى مجال HAMP (الموجود في h istidine kinases ، و denylyl cyclases ، والبروتينات التي تقبل الإيثيل و p hosphatases) ، و HCD وأربعة مواقع مثيلة مفترضة في الطرف C ، مما يشير إلى أن بنية المستقبل وطوبولوجيا تشبه بكتريا قولونية مستقبلات القطران (الشكل 1 أ). تم استخدام mp4 في البحث عن الانفجار (Altschul وآخرون. ، 1997) من قاعدة بيانات البروتينات غير الزائدة عن الحاجة ووجد أنها أكثر تشابهًا مع Mcp3 من Rhodospirillum centenum، مع هوية 37 ٪ (E = 2 × 10 −39) أكثر من 334 من الأحماض الأمينية من المجال C- المحطة المحفوظة. لم يُظهر المجال N-terminal أي تشابه مع أي بروتينات في قاعدة البيانات.

يعتبر Mcp4 متماثلًا لبروتينات الانجذاب الكيميائي المعروفة التي تقبل الميثيل. A. هيكل المجال المتوقع لـ Mcp4 على أساس التشابه مع Tar ، و بكتريا قولونية مستقبلات الأسبارتات. يشار إلى مناطق الغشاء بواسطة TM ، وبالتالي تحديد مجال الاستشعار المحيطي. تم العثور على مجالات HAMP في العديد من متماثلات MCP (Zhulin ، 2001) ، وتم تحديد مواقع المثيلة المتوقعة MH1 و MH2. المجال المحفوظ للغاية (HCD) موجود في جميع MCPs من البكتيريا والعتائق. B. محاذاة تسلسل clustalw من HCD من بكتريا قولونية القطران و م. زانثوس FrzCD و DifA و Mcp4. تشير الصناديق المظلمة إلى هوية التسلسل ، ويشير التظليل الفاتح إلى التشابه.

Mcp4 هو جزء من مجموعة جينية تشبه الانجذاب الكيميائي

من خلال مزيد من التسلسل للمنطقة المحيطة mcp4، حددنا مجموعة جينية رابعة تشبه الانجذاب الكيميائي على م. زانثوس الجينوم. تم تقديم بيانات التسلسل هذه إلى قواعد بيانات DDBJ / EMBL / GenBank تحت رقم الانضمام AY101609. تم تسمية هذه المجموعة الجينية بـ che4 أوبرون هو محور هذه الورقة (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى Mcp4 ، فإن ملف che4 يقوم المشغل بترميز اثنين من متماثلات CheW (CheW4A و CheW4B) ، وهو هجين CheA-CheY (CheA4) ، ومنظم استجابة (CheY4) ومتماثل CheR (CheR4). تشير عمليات البحث المتفجرة باستخدام CheW4A و CheW4B إلى أن هذه البروتينات تشبه إلى حد كبير بروتين تحويل إشارة الانجذاب الكيميائي من تألق الزائفة PfO-1 مع هوية 35٪ أكثر من 74 حمض أميني (E = 4 × 10 −5) و 34٪ هوية أكثر من 107 أحماض أمينية (E = 1 × 10 10) على التوالي. CheR4 هو 34٪ مطابق لما يزيد عن 245 من الأحماض الأمينية لميثيل ترانسفيراز من بكتريا قولونيةO157: H7 EDL933 (E = 5 × 10 −27). بالإضافة إلى مجال ميثيل ترانسفيراز ، يحتوي CheR4 على 225-amino-acid C-terminal المنطقة التي تحتوي على مجال واحد متكرر رباعي الببتيد (TPR) ، مشابه لذلك الذي لوحظ في FrzF ومتجانسات CheR الأخرى. وظيفة (وظائف) هذه المجالات في methyltransferases غير معروفة (شيومي وآخرون. ، 2002). CheY4 هو 38 ٪ متطابق مع 122 من الأحماض الأمينية لمجال المستقبل لمنظم استجابة مكون من مكونين من نوستوك ص. PCC 7120 (E = 4 × 10 −16) ، و CheA4 هو 27 ٪ متطابق مع 847 من الأحماض الأمينية إلى كيناز بروتين الهيستيدين الكيميائي من العطيفة الصائمية (E = 8 × 10 −76). CheA4 ، مثل الكينازات الموجودة في م. زانثوس تحتوي مسارات Frz و Che3 أيضًا على مجال مستقبل C-terminal. على الرغم من وجود العديد من متماثلات CheA الهجينة في قاعدة بيانات GenBank ، إلا أن وظيفة مجالات الاستقبال الخاصة بهم لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. والجدير بالذكر أن che4 لا يحتوي الموضع على جين يقوم بترميز متماثل CheB methylesterase أو homologue CheZ. من خلال تحليل تسلسل المصب cheA4، حددنا إطار قراءة مفتوحًا متشعبًا (ORF) مع عدم وجود تماثل للبروتينات في قاعدة بيانات الانفجار. المنبع (245 نقطة أساس) من مضغ، حددنا الجين المنسوخ بشكل متباين الذي يشفر بروتينًا بهوية 42 ٪ أكثر من 284 من الأحماض الأمينية (E = 4 × 10 −55) إلى مجال كيناز في كيناز بروتين سيرين / ثريونين من Thermoanaerobacter tengcongensis.

ال che4 تتألف الكتلة من أوبرا. A. التنظيم الجيني لل che4 منطقة. تم تسمية الجينات بناءً على التناظر لجينات الانجذاب الكيميائي المعروفة. تمثل الخطوط الموجودة أسفل الجينات المناطق التي تم تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في (ب). تم نسخ B. DZ2 mRNA عكسيًا ، وتم اكتشاف cDNA الناتج عن طريق تضخيم PCR للمناطق A أو B أو C أو D كما هو محدد في (A). تم الكشف عن المنتج على هلام الاغاروز 1٪ ، مما يشير إلى أن الجينات في الموضع موجودة في نفس النسخة. (+) مع النسخ العكسي (-) بدون النسخ العكسي.

ال che4 يتم نسخ كتلة الجينات كعامل أوبيرون

من أجل تحديد ما إذا كانت الجينات الموجودة في che4 تم نسخ الموضع بشكل مشترك ، وتم إجراء النسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) على إجمالي الحمض النووي الريبي. تم استخدام أربعة أزواج مختلفة من التمهيدي لتضخيم مناطق من (كدنا) تغطي جميع الجينات في الكتلة (الشكل 2 أ). مجموعة التمهيدي "أ" مرتبطة مضغ و cheR4 مجموعة التمهيدي "ب" مرتبطة cheR4 و mcp4 مجموعة التمهيدي "ج" مرتبطة mcp4 و cheY4 ومجموعة التمهيدي "D" مرتبطة cheY4, مضغ و cheA4. تم الحصول على المنتج لجميع التفاعلات الأربعة ، مما يشير إلى أن الجينات الموجودة في che4 يتم نسخ الكتلة بشكل مشترك ، وبالتالي تشكل عامل تشغيل (الشكل 2 ب). يشير عدم وجود منتج في الممرات التي تفتقر إلى النسخ العكسي إلى أن الإشارات لم تكن نتيجة تلوث الحمض النووي في إعداد الحمض النووي الريبي.

عزل وتحليل المسوخ في che4 أوبرون

لتحديد ما إذا كان نظام Che4 يعمل على تنظيم الحركة ، يتم حذف الكل che4 أوبرون (Δche4مرجع سابق) في سلالة من النوع البري (A + S +) ، DZ2. تم قياس الحركة من خلال قطر السرب على أجار ناعم غني بالمغذيات (0.3٪) ، والذي يفضل الحركة S ، والأجار الصلب (1.5٪) ، والذي يسمح للخلايا بالتحرك باستخدام كل من أنظمة الحركة A و S (شي وزوسمان ، 1993). Δche4مرجع سابق لم تظهر الخلايا الطافرة عيوبًا حركية يمكن ملاحظتها تحت أي من الظروف المختبرة (بيانات الشكل 3 أ غير معروضة). لكن، م. زانثوس يمكن دفعها بشكل مستقل إما عن طريق نظام الحركة A أو S. من الممكن أن يكون هناك عيب خفي في Δche4مرجع سابق متحولة مقنعة في سلالة من النوع البري تمتلك كلا نظامي الحركة. لتحديد ما إذا كان نظام Che4 متورطًا في حركية A أو S. che4 تم إدخال حذف الأوبرا في السلالات التي تحتوي فقط على الحركة S (A - S +) أو الحركة A (A + S -). في A + S - (بيلا) سلالة ، Δche4مرجع سابق يبدو أن الطفرة متطابقة مع الوالد A + S فيما يتعلق بحجم السرب على أسطح أجار صلبة أو ناعمة (البيانات غير معروضة) ومورفولوجيا حواف السرب (الشكل 3 ب) ، مما يشير إلى أن che4 الطفرات ليس لها تأثير على الحركة. في المقابل ، في A - S + (aglB1) سلالة ، Δche4مرجع سابق متحولة أظهرت احتشادًا محسّنًا على أسطح أجار صلبة. علاوة على ذلك ، تم حذف ملف cheY4 تسبب الجين في نمط ظاهري محسن مماثل في سلالة الخلفية A - S + ، مما يشير إلى أن CheY4 هو الناتج الرئيسي للنظام (الشكل 4 أ). من المثير للدهشة أنه لم يلاحظ أي نمط ظاهري شاذ على سطح أجار ناعم (0.3 ٪) في أي من المسوخ (البيانات غير معروضة).

Δche4مرجع سابق الطفرة لا تؤثر على الحركة. تم طلاء الخلايا على وسائط غنية (CYE) بنسبة 1.5 ٪ أجار وحضنت عند 32 درجة مئوية. أ. احتشاد سلالات A + S +. تم التقاط الصور بعد يومين. حواف الحشد تظهر لسلالات A + S لإظهار الخلايا A + المفردة. تم التقاط الصور بعد 4 أيام.

ال che4 تظهر المسوخ عيوب الحركة S في aglB1 الخلفية (A - S +). أ. المسوخ التي تحتوي على محذوفات من الكل che4 أوبرون cheY4 و mcp4 في القمه - (aglB1) معرفتي. تم طلاء الخلايا على وسائط غنية (CYE) تحتوي على 1.5 ٪ أجار وتم تصويرها بعد 4 أيام. تم التقاط جميع الصور بنفس التكبير. باء مستعمرة حافة aglB1Δche4مرجع سابق متحولة. تم التقاط صور حافة المستعمرة بعد 5 أيام من النمو على الوسائط الغنية. جيم ديف طفرة معرفية على مدى che4مرجع سابق حذف. تم طلاء الخلايا بألواح وسائط غنية تحتوي على 1.5٪ أجار وتم تصويرها بعد 4 أيام.

لأن ملف Δche4مرجع سابق و ΔcheY4 أظهرت المسوخات فقط احتشادًا محسنًا في الوالد A - S + وعلى أسطح أجار صلبة ، كان من الممكن أن يتم حذف che4 أوبرون استعادة حركية للخلفية A - S +. لاختبار هذا الاحتمال ، قمنا بتقييم المسوخ للحركة A من خلال فحص حواف السرب. يوضح الشكل 4 ب أن حواف ملف aglB1Δche4مرجع سابق كانت المستعمرات الطافرة منفصلة ولم تظهر أي دليل على تحرك الخلايا المفردة بعيدًا عن حافة المستعمرة ، مما يشير إلى أن Δche4مرجع سابق الطفرة لم تعيد الحركة. وبالتالي ، فإن الحشد المعزز الذي يعرضه aglB1ΔcheY4 و aglB1Δche4مرجع سابق يجب أن تنتج الطفرات من تأثير على نظام الحركة S. تشير هذه النتائج معًا إلى أن نظام Che4 يعمل كمثبط لحركة S.

إذا كانت وظيفة CheY4 هي تثبيط حركة S ، فإن الإشارة من خلال المستقبل الكيميائي ، Mcp4 ، يجب أن تؤثر على التثبيط. لاختبار هذه الفرضية ، تم حذف mcp4 تم بناء الجين في الخلفيات المتحولة من النوع البري ، A و S. كما لوحظ سابقًا في Δche4مرجع سابق و ΔcheY4 المسوخ ، لم يكن هناك اختلاف في أنماط الاحتشاد لـ Δmcp4 متحولة في سلالات من النوع البري أو A + S (لا تظهر البيانات). ال aglB1Δmcp4 لم تظهر السلالة عيوبًا في الحركة على أسطح أجار ناعمة ، على غرار ΔcheY4 و Δche4مرجع سابق المسوخ (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، فإن aglB1Δmcp4 متحولة نمط ظاهري منخفض للحشود على أسطح أجار صلبة ، وهو عكس ذلك الذي شوهد في aglB1ΔcheY4 و aglB1Δche4مرجع سابق (الشكل 4 أ). تشير هذه البيانات إلى أن إشارات Mcp4 تعمل على التخفيف من تثبيط الحركة S بوساطة CheY4.

Che4 المسوخات تظهر مستويات من النوع البري للبنى المرتبطة بالحركة S.

تتطلب الحركة S إنتاج وبثق النوع الرابع pili (Kaiser and Crosby، 1983 Sun وآخرون. ، 2000) ، مادة مصفوفة خارج الخلية (ألياف) (Arnold and Shimkets ، 1988) ومستضد LPS O (Bowden and Kaplan ، 1998). ال aglB1ΔcheY4 و ال aglB1Δche4مرجع سابق المسوخ ، والتي أظهرت احتشادًا محسّنًا ، و aglB1Δmcp4 mutant ، التي أظهرت احتشادًا منخفضًا ، تم تحليلها لتحديد ما إذا كانت قد قدمت مستويات متغيرة من هذه المكونات. تم الكشف عن مستويات مماثلة من البلين في جميع السلالات عن طريق تحليل اللطخة المناعية لمستخلصات الخلية الكاملة باستخدام الأجسام المضادة ضد PilA ، مونومر البلين (البيانات غير معروضة). علاوة على ذلك ، لم يظهر تحليل اللطخة المناعية للبلين المنفصمة عن سطح الخلية أي فرق بين che4 المسوخ والسلالة الأم (الشكل 5 أ). غياب البلين في Δبيلق تضمن السلالة (الشكل 5 أ ، الممر 5) أن المستحضرات لم تكن ملوثة بالبيلين داخل الخلايا لأن PilQ هو السريرين الضروري لتصدير البلين. تشير هذه النتائج إلى أن تجميع بيلوس لم يتأثر بالطفرات. وبالمثل ، فإن تحليل اللطخة المناعية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة إما بـ FibA (بروتين مرتبط بالألياف) أو LPS O-antigen لم يُظهر المستويات المتغيرة لمكونات سطح الخلية هذه بالنسبة إلى aglB1 الوالد (الشكل 5 ب وج). مقتطف من أ ديف تم تضمين متحولة كعنصر تحكم سلبي لمادة المصفوفة خارج الخلية وإنتاج FibA. تمشيا مع تحليل اللطخة المناعية ، كانت أصباغ Calcofluor البيضاء وأحمر الكونغو التي تلطخ الألياف قادرة على ربط الخلايا الطافرة بكميات مماثلة للسلالة الأم (البيانات غير معروضة). وبالتالي ، فإن جميع الهياكل المعروفة المطلوبة لحركة S موجودة في che4 المسوخ.

مكونات الحركة S موجودة في che4 المسوخ. الممرات 1 aglB1 الممرات 2 aglB1Δmcp4 الممرات 3 aglB1ΔcheY4 والممرات 4 aglB1Δche4مرجع سابق. For (A), lane 5, ΔpilQ lane 6, ΔpilA. For (B), lane 5, ΔpilA lane 6, difA. A. Surface pilin. Immunoblot of pili prepared by shearing probed with anti-PilA antiserum. B. Fibrils. Immunoblot of total protein isolated from cells grown to equal densities in liquid CYE medium probed with anti-FibA (mAb2105) antibody. C. LPS O-antigen. Whole-cell samples were prepared as in (B), but probed with anti-LPS O-antigen (mAb783) antibody.

The Dif system is required for Che4 function

The Dif system of م. زانثوس contains homologues to chemotaxis genes and is required for extracellular matrix (fibril) production ( Yang وآخرون. ، 1998). Extracellular matrix material is required for pilus retraction, and dif mutants are consequently hyperpiliated and defective in S motility ( Li وآخرون. ، 2003). Because a deletion of the che4 operon results in cells that have enhanced S motility spreading (Fig. 4A), we wondered whether signalling through the Dif pathway was required for this enhancement. To address this possibility, triple mutants were generated in which the gene for difA (ال dif system receptor) was disrupted in an aglB1Δche4مرجع سابق أضنى. Hard agar swarming assays of aglB1Δche4مرجع سابقdifA mutants were indistinguishable from the aglB1 difA parent, indicating that a difA mutant is epistatic to the Δche4مرجع سابق mutation (Fig. 4C). Similar analysis of the aglB1Δmcp4 difA و ال aglB1ΔcheY4 difA mutants indicated that difA was epistatic to mcp4 و cheY4 (data not shown). These results allow us to conclude that the Che4 system requires either fibril biogenesis or functional type IV pili for the enhancement of S motility observed in the Δche4مرجع سابق و ΔcheY4 المسوخ.

Che4 mutants are defective in regulating cellular reversal frequencies

In order to understand better the effects of the various che4 mutations on motility, video microscopy was used to analyse single cell behaviour. We could not analyse cell movements using traditional techniques because the aglB1 strain lacks the ability to move as single cells on an agar surface. However, Sun وآخرون. (2000 ) have demonstrated previously that single cells using only S-motility are able to move on a solid surface overlain with 1% methyl cellulose. Using this assay, we analysed the movement of cells with the following genotypes: aglB1, aglB1Δmcp4 و aglB1ΔcheY4. At least 50 individual cells were tracked for 30 min, and images were captured at 30 s intervals. Cell velocities and reversal frequencies were quantified for each strain, and a summary of the results is shown in Table 1. Linear regression analysis identified a strong inverse correlation between reversal frequency and velocity for aglB1 cells (Fig. 6A). For example, the slowest quartile of cells reversed on average once every 2.8 min, compared with the fastest quartile of cells, which reversed only once every 4.5 min. This suggests that there is a mechanism to co-ordinate reversal frequency and velocity. The correlation between velocity and reversal frequency was lost in aglB1Δmcp4 و aglB1ΔcheY4 mutants (Fig. 6A). Figure 6B summarizes the data observed in Fig. 6A with individual data points omitted for clarity. The increase in aglB1Δmcp4 reversal frequency (0.34 rev min −1 ) relative to aglB1ΔcheY4 (0.25 rev min −1 ) is statistically significant using Student's ر-test (ف & لتر 1 × 10 −6 ). For comparison, when reversal frequency and velocity are plotted on an inverse graph (velocity on the ذ-axis), the average velocity of both mutants is almost the same (Fig. 6C), consistent with the values in Table 1.

معامل أضنى
aglB1 aglB1ΔcheY4 aglB1Δmcp4
Average velocity (µm min −1 ) ± SEM 6.77 ± 0.43 6.11 ± 0.36 6.31 ± 0.40
Average reversal frequency (min −1 ) ± SEM 0.28 ± 0.01 0.25 ± 0.01 0.34 ± 0.01
Av. rev. for velocity < 6.00 µm min −1 ± SEM (no. of cells) 0.32 ± 0.01 (33) 0.26 ± 0.02 (35) a 0.33 ± 0.02 (27)
Av. rev. for velocity > 6.00 µm min −1 ± SEM (no. of cells) 0.25 ± 0.01 (33) 0.23 ± 0.02 (32) 0.34 ± 0.01 (23) a
% of cells exhibiting active movement (no. of cells evaluated) 82.5 (80) 87 (77) 86.2 (58)
  • Single cell motility was analysed, and the average values for cells exhibiting active movement are presented. SEM is the standard error of the mean.
  • أ. Values are significantly different from the other strains with a 95% confidence.

Reversal frequency correlates with velocity of aglB1 cells, but not of che4 المسوخ. A. Reversal frequency was compared with velocity using linear regression analysis, and ص-values for the slope of each data set were obtained using a two-tailed ر distribution. Each point indicates data for one cell analysed over a 30 min period. The number of cells analysed for each strain is as follows: aglB1, ن = 66 aglB1ΔcheY4, ن = 67 and aglB1Δmcp4, ن = 50. B. Reversal frequency as a function of velocity. The trend lines obtained in (A) were overlain to demonstrate the difference in reversal frequency between the mutants and parent strains. Individual cell data points were omitted for clarity. C. Velocity as a function of reversal frequency. The data from (A) were plotted on opposite axes and overlain to compare the average velocities of the aglB1ΔcheY4 و aglB1Δmcp4 المسوخ. Individual cell data points were omitted for clarity.

The average reversal frequency for cells moving at different velocities cannot be compared because reversal frequency is dependent on velocity for the aglB1 أضنى. Therefore, in order to compare average reversal frequency between the che4 mutants and the parent strain, the data were divided into groups of cells moving more than or less than 6.0 µm min −1 (the median velocity for all the strains), and average reversal frequencies were obtained for these two populations (Table 1). The distribution of reversal rates was compared to determine whether they were statistically distinct at the 95% confidence level using an analysis of variance test followed by Tukey's multiple comparison test. This analysis showed that aglB1 cells moving with velocities < 6.0 µm min −1 reversed once every 3.1 min (0.32 rev min −1 ), significantly less than the 4.1 min between reversals (0.25 rev min −1 ) observed for cells moving with velocities > 6.0 µm min −1 . The reversal frequencies of cells moving more than or less than 6 µm min −1 were statistically indistinguishable for aglB1ΔcheY4 أو aglB1Δmcp4 الخلايا. At velocities < 6.0 µm min −1 , aglB1ΔcheY4 mutants reversed once every 3.8 min (0.26 rev min −1 ), which was significantly more than one reversal every 3.1 min (0.32 rev min −1 ) for aglB1. On the other hand, at velocities > 6.0 µm min −1 , aglB1Δmcp4 mutants reversed significantly less than aglB1 cells with frequencies of once every 2.9 min (0.34 rev min −1 ) and 4.1 min (0.25 rev min −1 ) respectively. aglB1ΔcheY4 reversed less frequently than aglB1Δmcp4 regardless of velocity.

ال che4 operon is required for fruiting body formation in A – S + cells

Because motility is required for cells to aggregate and form fruiting bodies, we assayed expression of the che4 operon under developmental conditions. To follow expression of the che4 operon, an mcp4::lacZ gene fusion was constructed in the wild-type (A + S + ) background. β-Galactosidase activity was assayed in samples harvested at different times during development on CF starvation agar ( Kroos وآخرون., 1986 ). Figure 7 shows that mcp4::lacZ was expressed under vegetative conditions however, there was as much as a 10-fold increase in expression by 48 h of development. These results suggest that the Che4 pathway also plays a role during fruiting body formation.

che4 expression increases during development. β-Galactosidase specific activity resulting from a mcp4::lacZ fusion was analysed at various time points after the onset of starvation. Zero hours of development indicates the time at which cells were shifted from rich media to starvation media. The graph represents the average of three experiments, and error bars depict standard error of the mean.

To determine whether the Che4 pathway was required for development, we analysed che4 mutants under starvation conditions. A – S + (aglB1) cells aggregated poorly on CF agar, but formed distinct fruiting bodies in submerged culture (Fig. 8A). When starved in the submerged culture assay, aglB1ΔcheY4 و aglB1Δche4مرجع سابق mutants did not aggregate at all. في المقابل ، فإن aglB1Δmcp4 mutant did aggregate (Fig. 8A). When heat- and sonication-resistant spores were quantified, the average number of spores obtained from aglB1 in submerged culture was 1.31 × 10 3 spores, compared with the DZ2 wild-type strain, which produced an average of 5.69 × 10 8 spores. ال aglB1ΔcheY4 و ال aglB1Δche4مرجع سابق mutants displayed at least a fivefold reduction in levels of spores relative to the aglB1 parent (five and 30 spores respectively). على العكس من ذلك ، فإن aglB1Δmcp4 mutant produced nine times the level of spores of the aglB1 parent (Fig. 8B). Despite the increase in sporulation in aglB1Δmcp4 relative to aglB1, the level of sporulation is still 10 4 -fold lower then the wild-type A + S + strain. It is worth noting that, although the aglB1ΔcheY4 و ال aglB1Δche4مرجع سابق mutants were unable to aggregate, they formed a cohesive film in the submerged culture assay, indicating that pili and other factors responsible for cell–cell contacts were functional. Thus, the effects on developmental aggregation and sporulation seen in various che4 mutants are attributable to an inability to regulate S motility rather than to changes in the S motility apparatus.

Development is affected by mutations in the che4 أوبرون. A. The aglB1ΔcheY4 و aglB1Δche4مرجع سابق mutants do not aggregate when starved. Cells were grown in submerged culture in MMC buffer for 7 days before photographing. B. Viable spores were measured by plating 7-day-starved cells after heat and sonication treatment. The data are the average of at least three experiments, and the number of spores was normalized to the aglB1 الأبوين. Error bars depict the standard error of the mean. The percentage of spores relative to the aglB1 parent is shown above the bars.


Fig.S1. Expression profiles of motility genes in broth, on 0.6% plates or on 1.5% plates.

TableS1. Original time course microarray data for S. التيفيموريوم in LB broth or on 0.6% or 1.5% LB plates.

TableS2. Full gene list of eight differential expression groups of S. التيفيموريوم under three growth conditions (LB broth, 0.6% or 1.5% LB plates).

الجدول S1. Original time course microarray data for S. التيفيموريوم in LB broth or on 0.6% or 1.5% LB plates.

الجدول S2. Full gene list of eight differential expression groups of S. التيفيموريوم under three growth conditions (LB broth, 0.6% or 1.5% LB plates).

الشكل S1. Expression profiles of motility genes in broth, on 0.6% plates or on 1.5% plates.

Please note: Wiley-Blackwell are not responsible for the content or functionality of any supporting materials supplied by the authors. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المواد المفقودة) إلى المؤلف المقابل للمقال.

اسم الملف وصف
MMI_3977_sm_figS1.xls108 KB دعم عنصر المعلومات
MMI_3977_sm_tableS1.xls3.7 MB دعم عنصر المعلومات
MMI_3977_sm_tableS2.xls254.5 KB دعم عنصر المعلومات

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


شاهد الفيديو: Motility with TTC (شهر نوفمبر 2021).