معلومة

هل هناك مواد محددة غير بروتينية تطلقها مسببات الأمراض في مضيفها؟


عند قراءة المقالات البحثية ، اكتشفت أن بروتينات تسمى المؤثرات يتم إطلاقها في الخلية المضيفة عندما يهاجم العامل الممرض مضيفًا. سؤالي هو ، ما إذا كانت مسببات الأمراض تطلق أيضًا مواد غير بروتينية؟

هل تمت دراسة هذه المواد وتصنيفها على نطاق واسع؟ هل توجد قائمة بهذه المركبات؟ هل هذه المركبات فريدة من نوعها لمسببات الأمراض؟


عندما أخرجت رقبتي (وأتوقع أن تلدغها بجعة سوداء) يبدو أن جميع أمثلة السموم التي تفرزها مسببات الأمراض البكتيرية عندما تصيب مضيفًا حيوانيًا (السموم الخارجية) هي بروتينات.

ومع ذلك ، تفرز الفطريات مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة غير البروتينية (السموم الفطرية) الغريبة (وغالبًا ما تكون سيئة جدًا). ليس من الواضح من السؤال ما إذا كنت مهتمًا بهذه الأنظمة لأنها تختلف نوعًا ما عن تلك التي تنطوي على البكتيريا. اختلاف واحد عن السموم البكتيرية هو أن السموم الفطرية لا تفرز داخل الخلية المصابة ، ولكن فقط في بيئتها. وبالتالي ، يتم إفراز cercosporin على سطح النباتات التي يقيم عليها Cercospora ويمكن تناوله من خلال الآفات في النبات. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كان النبات هو الهدف الرئيسي لهذه السموم ، وليس "الأعداء" البكتيرية. لذا فإن مفهوم المضيف / الممرض أقل وضوحًا في هذا السياق.

يبدو أن هناك حالة مضيفة / مُمْرِضة غامضة مماثلة مع السموم مثل الساكسيتوكسين ، ذيفان المحار المشلول الذي تفرزه بعض الطحالب البحرية والبكتيريا الزرقاء.


استجابة الخلايا البائية متعددة النسيلة

استجابة الخلايا البائية متعددة النسيلة هو وضع طبيعي للاستجابة المناعية يظهره الجهاز المناعي التكيفي للثدييات. إنه يضمن التعرف على مستضد واحد ومهاجمته من خلال أجزائه المتداخلة ، التي تسمى الحلقات ، بواسطة نسخ متعددة من الخلايا البائية. [1] [2]

في سياق الاستجابة المناعية الطبيعية ، يتعرف الجهاز المناعي على أجزاء من مسببات الأمراض (مثل البكتيريا) على أنها غريبة (غير ذاتية) ، ويتم التخلص منها أو تحييدها بشكل فعال لتقليل الضرر المحتمل. هذه المادة التي يمكن التعرف عليها تسمى مستضد. قد يستجيب الجهاز المناعي بطرق متعددة لمولد الضد ، ومن السمات الرئيسية لهذه الاستجابة إنتاج الأجسام المضادة بواسطة الخلايا البائية (أو الخلايا الليمفاوية البائية) التي تتضمن ذراعًا من الجهاز المناعي تُعرف باسم المناعة الخلطية. الأجسام المضادة قابلة للذوبان ولا تتطلب اتصالًا مباشرًا من خلية إلى خلية بين العامل الممرض والخلية B لتعمل.

يمكن أن تكون المستضدات عبارة عن مواد كبيرة ومعقدة ، وأي جسم مضاد منفرد يمكنه فقط الارتباط بمنطقة صغيرة محددة على المستضد. وبالتالي ، غالبًا ما تتضمن الاستجابة المناعية الفعالة إنتاج العديد من الأجسام المضادة المختلفة بواسطة العديد من الخلايا البائية المختلفة ضد نفس مولد المضاد. ومن هنا جاء مصطلح "polyclonal" المشتق من الكلمات بولي، وهذا يعني الكثير ، و الحيوانات المستنسخة من اليونانية كلون، بمعنى تنبت أو غصين [3] [4] [5] الاستنساخ هو مجموعة من الخلايا تنشأ من خلية "أم" مشتركة. تُعرف الأجسام المضادة التي يتم إنتاجها في استجابة متعددة النسيلة باسم الأجسام المضادة متعددة النسيلة. تختلف الأجسام المضادة متعددة النسيلة غير المتجانسة عن جزيئات الأجسام المضادة أحادية النسيلة ، والتي تكون متطابقة وتتفاعل مع حاتمة واحدة فقط ، أي أكثر تحديدًا.

على الرغم من أن الاستجابة متعددة النسيلة تمنح مزايا للجهاز المناعي ، على وجه الخصوص ، احتمالية أكبر للتفاعل ضد مسببات الأمراض ، إلا أنها تزيد أيضًا من فرص الإصابة ببعض أمراض المناعة الذاتية الناتجة عن تفاعل الجهاز المناعي ضد الجزيئات الأصلية المنتجة داخل المضيف.


ضرر مباشر

الضرر المباشر للعائل هو آلية عامة تستخدمها الكائنات المسببة للأمراض لضمان العدوى وتدمير الخلية المضيفة.

أهداف التعلم

وصف العمليات المختلفة التي تستخدمها مسببات الأمراض لإتلاف العائل والتأكد من العدوى

الماخذ الرئيسية

النقاط الرئيسية

  • يجب أن تمتلك الكائنات المسببة للأمراض آليات لتفادي هجوم الجهاز المناعي.
  • يمكن أن تنتج مسببات الأمراض إنزيمات تعطل الأنسجة الطبيعية وتسمح بمزيد من الغزو للأنسجة.
  • يمكن أن تنتج مسببات الأمراض سمومًا تتداخل مع وظيفة البروتين التي تعتبرها الخلية المضيفة ضرورية للصيانة المناسبة.

الشروط الاساسية

  • الخناق: مرض يصيب الجهاز التنفسي العلوي بسبب سم تفرزه الوتدية الدفتيريا.
  • البلعمة: العملية التي تدمج بها الخلية جزيئات غريبة داخل الخلايا.

الضرر المباشر للعائل هو آلية عامة تستخدمها الكائنات المسببة للأمراض لضمان العدوى وتدمير الخلية المضيفة. عادة ما يتسبب الكائن الممرض في حدوث أضرار بسبب عملية النمو الخاصة به. يتميز تعزيز المرض بقدرة الكائن الممرض على دخول العائل وإلحاق الضرر والدمار بالخلية المضيفة. يجب أن يظهر الكائن الممرض خصائص محددة تعزز نموه في خلية مضيفة بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، القدرة على غزو الخلايا المضيفة واستعمارها والارتباط بها.

إن قدرة العامل الممرض على الدخول إلى الخلية المضيفة أمر أساسي في قدرة العامل الممرض على تعزيز المرض والتسبب فيه. القدرة على التلاعب بعملية البلعمة هي آلية تستخدمها البكتيريا في كثير من الأحيان للتأكد من أنها تغزو مضيفًا بشكل فعال. البلعمة هي عملية تستخدمها البلعمة (خلايا الدم البيضاء) كآلية دفاعية للحماية من الأجسام الغريبة. تبتلع البالعات الغزاة وتعرضهم على عوامل إضافية داخل جهاز المناعة تؤدي إلى تدميرهم. ومع ذلك ، غالبًا ما يُظهر العامل الممرض الناجح والمدمّر القدرة على التهرب من البلعمة.

الآلية (الآليات) المستخدمة من قبل مسببات الأمراض لتجنب البلعمة تشمل تجنب كل من الاتصال والابتلاع. تستخدم مسببات الأمراض التي تظهر القدرة على تجنب الاتصال عمليات مختلفة لتحقيق ذلك ، بما في ذلك: القدرة على النمو في مناطق من الجسم حيث تكون الخلايا البلعمية غير قادرة على الوصول إلى القدرة على تثبيط تنشيط الاستجابة المناعية التي تمنع الانجذاب الكيميائي وتتداخل معها. البالعات إلى موقع الإصابة و & # 8216 اقتحام & # 8217 الجهاز المناعي لتحديد البكتيريا على أنها & # 8216 نفسها. & # 8216 آلية (آليات) إضافية يمكن للبكتيريا من خلالها تجنب التدمير عن طريق تجنب الابتلاع. يتم تحقيق ذلك من خلال قدرة البكتيريا على إظهار إنتاج الجزيئات التي تتداخل مع قدرة البالعات على استيعاب البكتيريا. تتضمن الجزيئات التي تتداخل مع هذه العملية أنواعًا معينة من البروتينات والسكريات التي تمنع الابتلاع.

محمي من البلعمة: المكورات العنقودية الذهبية تظهر خصائص فيزيائية ، خاصة كبسولة ، تحمي البكتيريا من البلعمة.

بمجرد أن يتجنب العامل الممرض بنجاح ابتلاع الجهاز المناعي وتدميره ، يصبح ضارًا لأن البكتيريا تتكاثر بعد ذلك. في كثير من الأحيان ، تلتصق البكتيريا مباشرة بالخلايا المضيفة وتستخدم العناصر الغذائية من الخلية المضيفة لعملياتها الخلوية الخاصة. عند استخدام المغذيات المضيفة لعملياتها الخلوية ، قد تنتج البكتيريا أيضًا سمومًا أو إنزيمات تتسلل إلى الخلية المضيفة وتدمرها. ينتج عن إنتاج هذه المنتجات المدمرة ضرر مباشر للخلية المضيفة. ستؤدي نفايات الميكروبات أيضًا إلى إتلاف الخلية. تتضمن أمثلة البكتيريا التي تلحق الضرر بالأنسجة عن طريق إنتاج السموم ما يلي: بكتريا الخناق الوتدية و العقدية المقيحة. خاصة، بكتريا الخناق الوتدية يسبب الدفتيريا ، وهو مرض يصيب الجهاز التنفسي العلوي. ينتج سمًا ، وهو سم الخناق ، والذي يغير وظيفة البروتين المضيف. يمكن أن يؤدي السم بعد ذلك إلى تلف الأنسجة الإضافية بما في ذلك القلب والكبد والأعصاب. الأبراج العقدية يرتبط بالتهاب الحلق العقدي و & # 8220 مرض أكل اللحم. & # 8221 تنتج البكتيريا إنزيمات تعمل على تعطيل جلطات الفيبرين. تتشكل جلطات الفيبرين في مواقع الإصابة ، في هذه الحالة ، في موقع الغزو الأجنبي. ستفتح الإنزيمات القادرة على هضم الفيبرين منطقة داخل الخلايا الظهارية وتعزز غزو البكتيريا للأنسجة.


علم الأحياء الدقيقة 212 امتحان 3

تتكامل جينات العاثيات في جينوم الخلية المضيفة ولا يتم التعبير عنها.

توجد جينات Phage كنقطة انطلاق.

يبقى DNA Phage داخل غلاف البروتين.

الموائل الطبيعية للكائن الدقيق أو المصادر التي يمكن أن يصاب المضيف منها.

خصائص الكائن الدقيق التي تمكنه من الإصابة بالعدوى والتسبب في المرض.

المواقع داخل المضيف التي يمكن أن يقيم فيها كائن حي دقيق ويسبب المرض.

العوامل التي تمكن الكائنات الحية الدقيقة من مقاومة الأدوية المضادة للميكروبات.

PAMPs هي جزيئات موجودة فقط في الكائنات الحية الدقيقة ، وتعمل كجزيئات إشارة للتعرف على العوامل الممرضة.

لا تحتوي الفيروسات على PAMPs لأنها ليست خلايا حية.

PAMPs هي جزيئات إشارة موجودة في جميع الكائنات الحية ، وتساعد جهاز المناعة على تمييز الذات من غير الذات.

توجد PRRs في جميع الأوقات على الخلايا البلعمية وحتى الخلايا الليمفاوية ، بغض النظر عما إذا كانت قد واجهت PAMP المقابلة لها.

الخلايا البلعمية ، مثل العدلات والخلايا المتغصنة ، تصنع فقط PRRs بمجرد أن تواجه PAMP المقابل.

توجد PRRs في جميع الأوقات على الخلايا البلعمية وحتى الخلايا الليمفاوية ، بغض النظر عما إذا كانت قد واجهت PAMP المقابلة لها.

عادة ما تتكون علامات الخلايا التي تتعرف عليها أجزاء من الجهاز المناعي من الدهون والإنزيمات.

البلعمة هي إحدى الطرق التي يتم بها تدمير الخلايا الأجنبية بواسطة جهاز المناعة.

يميز كل من دفاعات الخط الأول والثاني الذات عن الخلايا غير الذاتية.

يتم تصنيع مستقبلات الخلايا البائية فقط عن طريق إعادة التركيب الجيني.

على عكس مستقبلات الخلايا البائية ، لا تُفرز مستقبلات الخلايا التائية أبدًا.

مستقبلات الخلايا البائية هي غلوبولين مناعي.

شكل مواقع ارتباط المستضد على مستقبلات الخلايا الليمفاوية غير متغير.

الأفراد المناعيون لا يحملون عامل مرض معدي معين.

يمنح التحصين الشامل حماية غير مباشرة للأعضاء غير المحصنين.

من المرجح أن تواجه مسببات الأمراض في مجموعة سكانية تم تحصينها إلى حد كبير.

يتم الحفاظ على مناعة القطيع فقط من خلال حدوث أمراض طبيعية.

يمنح التحصين الشامل حماية غير مباشرة للأعضاء غير المحصنين.

المكورات العنقودية الذهبية والمكورات العقدية المقيحة هي الكائنات الحية المسببة.

أكثر طرق الإرسال شيوعًا هي الاتصال المباشر وغير المباشر.

لم يتم العثور على عوامل ضراوة بكتيرية مرتبطة بالمرض.

يظهر المرض فقط عند الرضع والأطفال الصغار.

يتوفر لقاح عالي الفعالية

تسببه خمسة أنواع من البروتوزوان المتصورة

يمر الطفيل بمرحلة جنسية ولاجنسية أثناء التطور

يمر الطفيل بمرحلة جنسية ولا جنسية أثناء التطور

أدت زيادة درجة الحرارة إلى تغيير موطن بعوضة الزاعجة ، حيث نقلت فيروسات زيكا وحمى الضنك إلى الشمال.

يظهر فيروس الحصبة في حالات تفشي المرض في مناطق كاليفورنيا الدافئة والمشمسة.

أدت زيادة هطول الأمطار إلى انفجار في أعداد فأر الغزلان ، وهي ناقلات فيروس هانتا التي يمكن أن تنتقل إلى البشر عن طريق البول والبراز.

أدت زيادة هطول الأمطار إلى انفجار في أعداد فأر الغزلان ، وهي ناقلات فيروس هانتا التي يمكن أن تنتقل إلى البشر عن طريق البول والبراز.

تظهر عملية تحويل السكر إلى كحول في المعادلة: C6H12O6 → 2CO2 + 2C2H5OH.

الحد الأدنى من مكونات تخمير البيرة هو الماء والشعير والجنجل ، ويمكن إضافة مكونات أخرى من الخميرة مثل الذرة أو فول الصويا لتغيير ملامح النكهة.

تسخين خليط الهريس إلى 75 درجة مئوية يزيد من نشاط الإنزيمات التي تحلل النشا إلى السكريات الأحادية.

يتم غلي نقيع الشعير بقفزات كراميل السكريات ، والقضاء على أي ملوثات بكتيرية ، وإعطاء نكهة ورائحة للبيرة.

تظهر عملية تحويل السكر إلى كحول في المعادلة: C6H12O6 + O2 → 2CO2 + 2C2H5OH + H2O.

الحد الأدنى من مكونات تخمير البيرة هو الماء والشعير والجنجل وخميرة يمكن إضافة المكونات الأخرى مثل الذرة أو فول الصويا لتغيير ملامح النكهة.


قد لا تغطي اتفاقية الأسلحة البيولوجية بعض البيولوجيا التركيبية

تحدت دراسة الفيروسات ذات مرة مفهوم العالم لما هو "بيولوجي" ، ولم يتضح لبعض الوقت ما إذا كانت الفيروسات تخضع لاتفاقية الأسلحة البيولوجية (BWC). الكذب "على حافة الحياة" ، من المحتمل أن الفيروسات لم يتم حظرها كسلاح بيولوجي حتى تم تعريفها كعامل بيولوجي في عام 1969 ، بعد أكثر من 40 عامًا من المعاهدة الأولى متعددة الأطراف التي تحظر الحرب البيولوجية. تصيب الفيروسات مضيفيها عن طريق التكاثر من خلال الخلايا الحية ، وينتشر العديد منها المرض من شخص إلى آخر ، مثل فيروس كورونا الجديد الحالي الذي يسبب COVID-19. بينما تعتبر الفيروسات اليوم من العوامل البيولوجية المعدية ويتم حظرها بشكل قاطع كوسيلة من وسائل الحرب ، فإن بعض أنواع البيولوجيا التركيبية (SynBio) قد تشكل معضلة مماثلة ومع ذلك قد لا تكون مشمولة بنفس القيود.

يتضمن SynBio مجموعة من التقنيات المستخدمة لإعادة تصميم الكائنات الحية عن طريق هندستها للحصول على خصائص أو قدرات جديدة ، أو لاستخدام مواد غير بيولوجية تحاكي التأثيرات البيولوجية ، تسمى المحاكاة الحيوية. في حين أن المادة الأولى من اتفاقية الأسلحة البيولوجية تقنن حظر القانون العرفي لتسليح المواد البيولوجية أو مسببات الأمراض ، فإن الاتفاقية لا تغطي بالضرورة تطوير أو استخدام المحاكاة الحيوية ، وهي فئة فرعية خطيرة من SynBio. قد يتم تسليح هذه المواد إلى عوامل غير بيولوجية تعمل على تغيير الكائنات الحية ، مما يمثل تحديًا لتعريف "المواد البيولوجية". أدى عدم اليقين العلمي هذا إلى فتح ثغرات في القانون ، وليس من الواضح ما إذا كان بإمكان الدول الأعضاء في اتفاقية الأسلحة البيولوجية إغلاقها.

الحرب البيولوجية

يشعر قادة الحكومة بالقلق من الحرب البيولوجية جزئيًا لأنهم يرون الدمار الذي تسببه الأمراض الطبيعية. إن جائحة الفيروس التاجي هو أحدث مثال على تفشي طبيعي للمرض يسبب الدمار. كان للطاعون تأثير عميق على السياسة الأوروبية في أوائل الفترة الحديثة ، وأدت الإنفلونزا الإسبانية عام 1918 إلى تعطيل جيوش الحلفاء والقوى المركزية خلال الحرب العالمية الأولى. وقتل جائحة الإنفلونزا الآسيوية عام 1957 1.1 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ، بما في ذلك 116000 أمريكي. في الآونة الأخيرة ، دمرت متلازمة الشرق الأوسط التنفسية والإيبولا الشرق الأوسط وأفريقيا. بينما أحرزت العلوم الطبية تقدمًا في الوقاية من الأمراض المعدية وعلاجها وعلاجها ، فإن جائحة الفيروس التاجي يسلط الضوء على السباق اليائس للبقاء في طليعة مسببات الأمراض. يبدو أن فيروس كورونا الجديد لم يتم تطويره كسلاح بيولوجي ، لكن وزير الخارجية مايك بومبيو أشار إلى أن الفيروس ربما يكون قد تسرب من مختبر في ووهان. يسلط عدم اليقين هذا الضوء على صعوبة التمييز بين الفاشيات الطبيعية أو الإطلاق العرضي أو ربما حتى الاستخدام المتعمد.

من المحتمل أن يعود استخدام مسببات الأمراض والسموم لقتل العدو إلى عصور ما قبل التاريخ - يعتقد علماء الآثار أن أعضاء بعض القبائل البدوية غطوا أطراف سهامهم بالسموم المأخوذة من النباتات والحيوانات. تجري القوى العظمى اليوم أبحاثًا دفاعية عن الحرب البيولوجية. ومع ذلك ، كان للحرب البيولوجية بين الدول تأثير ضئيل بشكل ملحوظ مقارنة بوسائل وأساليب الحرب الأخرى. قد يكون هذا بسبب قدرة الدول على تحقيق أهدافها من خلال الوسائل التقليدية ، أو عدم الرغبة في التصعيد لاستخدام الأسلحة غير التقليدية. ومع ذلك ، فإن احتمالية تسبب الأسلحة البيولوجية في وقوع إصابات جماعية لا تزال مصدر قلق ، ولهذا السبب تسعى الدول إلى اتفاقيات للحد من الأسلحة ومنع انتشارها للسيطرة عليها.

تعد SynBio بدرجة أكبر من التحكم مقارنة بالعوامل البيولوجية التقليدية لأن مسببات الأمراض التي تم إنشاؤها بشكل مصطنع ومعالجتها وتعزيزها - البكتيرية والفيروسية على حد سواء - يمكن أن تستهدف مجموعات ديموغرافية محددة ، بما في ذلك المجتمعات العرقية أو الإثنية أو السكان الذين لديهم سمات وراثية محددة. يمكن إنشاء عوامل تهديد جديدة غير موجودة في الطبيعة أو تتكون من مواد غير عضوية. قد تولد هذه العوامل الممرضة تأثيرات بيولوجية تضعف الوظائف أو تعوق أو تسبب الوفاة. قبل ثماني سنوات ، على سبيل المثال ، كان العلماء قادرين على هندسة فيروس H5N1 ، مما جعله ينتقل بين البشر من خلال السعال أو العطس. نادرا ما يصاب فيروس "أنفلونزا الطيور" بشكله الطبيعي أو ينتشر بين البشر. ووصفته صحيفة نيويورك تايمز بأنه "يوم القيامة الهندسي". تمكن العلماء أيضًا من إعادة بناء فيروس شلل الأطفال الحي من نقطة الصفر ، فيروس الإنفلونزا الإسبانية عام 1918 وجدول الحصان ، أحد أقارب الجدري ، باستخدام المعلومات الجينية المتاحة للجمهور والبريد الذي يطلب مادة الحمض النووي.

إذا اقترب تقدم التكنولوجيا الحيوية في تخليق الجينات الاصطناعية مع التقنيات العسكرية الناشئة ، فستواجه الدول خطرًا أكبر من الإطلاق العرضي أو حتى إساءة الاستخدام المتعمد لمسببات الأمراض كأسلوب أو وسيلة حرب. الصين ، على سبيل المثال ، تستثمر بكثافة في التكنولوجيا الحيوية لتحقيق مكاسب تجارية وطبية. ومع ذلك ، فقد يستغلون أيضًا التكنولوجيا الحيوية للتطبيقات العسكرية. ضع في اعتبارك اهتمام الصين بالتكنولوجيا الحيوية للدفاع الوطني. تشياو ليانغ ووانغ شيانغ سوي ، المفكرين العسكريين الصينيين البارزين ، يفكرون في الحرب البيولوجية باعتبارها "مجالًا جديدًا للحرب" وطريقة مشروعة لإجراء نزاع مسلح "يتجاوز القواعد". زعم كبير الأطباء في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة التابعة لجيش التحرير الشعبي أن التقنيات الحيوية الناشئة ستسمح "باستهداف أكثر دقة ومباشرة على البشر مقارنة بالطرق الأخرى ، والتي ستلعب دورًا أكثر أهمية في العمليات العسكرية المستقبلية". واقترح كذلك الذي - التي تقع التقانات الحيوية الناشئة خارج نطاق الحظر المفروض على الأسلحة البيولوجية. في بعض الحالات ، قد يكون على حق من الناحية القانونية. تقيد اتفاقية الأسلحة البيولوجية تطوير أو استخدام هذه الجراثيم المصممة خصيصًا "التي ليس لها ما يبرر الوقاية أو الحماية أو الأغراض السلمية الأخرى" أو كوسيلة من وسائل الحرب. قد تستخدم المحاكاة الحيوية مواد غير بيولوجية لتوليد نفس التأثيرات ، مثل الوفاة أو المرض أو عطل بيولوجي - ربما خارج اتفاقية الأسلحة البيولوجية.

التزامات نزع السلاح

بشكل عام ، تم حظر الأسلحة البيولوجية التقليدية بموجب القانون الدولي من خلال المعاهدات والقانون الدولي العرفي. في عام 1969 ، قبل التصديق على اتفاقية الأسلحة البيولوجية ، أكد الرئيس ريتشارد نيكسون أن "الولايات المتحدة يجب أن تتخلى عن استخدام العوامل والأسلحة البيولوجية الفتاكة ، وجميع أساليب الحرب البيولوجية الأخرى". كان بروتوكول جنيف لعام 1925 أول معاهدة متعددة الأطراف تحظر "استخدام الأساليب البكتريولوجية في الحرب". وبموجب شروطها الخاصة ، حظرت المعاهدة استخدام الأسلحة البيولوجية أثناء النزاعات المسلحة. صدقت الولايات المتحدة على بروتوكول جنيف لعام 1925 في عام 1975 ، عندما صادقت في نفس الوقت على اتفاقية الأسلحة البيولوجية. بينما يركز بروتوكول جنيف لعام 1925 على الاستخدام المحظور ، وسعت اتفاقية الأسلحة البيولوجية من نطاق حظر الاستخدام من خلال حظر تطوير "العوامل الجرثومية أو غيرها من العوامل البيولوجية أو التكسينات" أو إنتاجها أو تخزينها أو حيازتها أو الاحتفاظ بها مهما كان مصدرها أو طريقة إنتاجها ، الكميات التي ليس لها أي مبرر لأغراض وقائية أو وقائية أو أغراض سلمية أخرى ". يحظر بشكل أساسي استخدام المواد البيولوجية لأي شيء آخر غير الأغراض السلمية. ومع ذلك ، فإن ما إذا كانت المعاهدة تنطبق على جميع تطبيقات SynBio يمثل مشكلة.

في أوسع تفسير لها ، فإن اتفاقية الأسلحة البيولوجية "تنطبق على جميع العوامل الجرثومية أو العوامل البيولوجية أو السموم الطبيعية أو المصطنعة أو المعدلة أيا كان مصدرها أو طريقة إنتاجها". تم اشتقاق هذا الفهم في البداية من الوثيقة الختامية للمؤتمر الاستعراضي الثاني لاتفاقية الأسلحة البيولوجية في عام 1986. وقدمت بلغاريا والجمهورية الديمقراطية الألمانية اقتراحًا أشار إلى "مخاوف" ناشئة عن التطورات في التكنولوجيا الحيوية والتي "قد تؤدي إلى إنشاء كائنات دقيقة مسببة للأمراض وتكسينات. "مع التطبيق العسكري. لقد أرادوا تأكيدًا على أن اتفاقية الأسلحة البيولوجية تغطي أيضًا "الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض التي تم إنشاؤها اصطناعيًا" على الرغم من أن نص المادة الأولى من اتفاقية الأسلحة البيولوجية لا يشير إلى عوامل بيولوجية مخلقة أو مصطنعة أو معدلة. تم الاتفاق على هذا الفهم الأوسع بتوافق الآراء ، بما في ذلك الولايات المتحدة ، في ختام الاجتماع وأعيد تأكيده في المؤتمرات الاستعراضية الثالث والرابع والسادس والسابع. ومع ذلك ، فإن مثل هذه الإعلانات ليست ملزمة قانونًا ، لأنها ليست جزءًا من عملية التعديل والمراجعة الرسمية. ومع ذلك ، تعد هذه البيانات مصدرًا موثوقًا للتفسير على أنها "اتفاقية لاحقة بين الأطراف فيما يتعلق بتفسير المعاهدة ،" بموجب المادة 31 (3) من اتفاقية فيينا لقانون المعاهدات (VCLT). في حين أن الولايات المتحدة لم تصدق على VCLT ، إلا أنها تعتبر العديد من أحكام الاتفاقية على أنها تعكس القانون الدولي العرفي.

بافتراض أن اتفاقية الأسلحة البيولوجية تغطي جميع العوامل البيولوجية المُنشأة أو المُعدَّلة صناعياً أو صناعياً ، كيف يتم تعريف العامل البيولوجي؟ لا تقدم اتفاقية الأسلحة البيولوجية تعريفًا محددًا ، باستثناء نص المادة الأولى "العوامل الجرثومية أو العوامل البيولوجية الأخرى ، أو السموم". في عام 1969 ، حددت الجمعية العامة للأمم المتحدة العوامل البيولوجية بأنها "كائنات حية ، مهما كانت طبيعتها ، أو مواد معدية مشتقة منها - والتي تهدف إلى التسبب في المرض أو الوفاة للإنسان أو الحيوانات أو النباتات ، والتي تعتمد على تأثيرها على القدرة على التكاثر في شخص أو حيوان أو نبات مهاجم. " في الولايات المتحدة ، تم تنفيذ اتفاقية الأسلحة البيولوجية من خلال قانون مكافحة الإرهاب للأسلحة البيولوجية لعام 1989 ، والذي يعرف حاليًا العوامل البيولوجية بأنها

أي كائن حي دقيق (بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، البكتيريا ، أو الفيروسات ، أو الفطريات ، أو الريكتسيا أو البروتوزوا) ، أو مادة معدية ، أو أي مكون طبيعي أو معد للهندسة الحيوية أو مركب من أي كائن حي دقيق أو مادة معدية ، قادرة على التسبب في ... الموت ، المرض ، أو خلل بيولوجي آخر في الإنسان أو الحيوان أو النبات أو كائن حي آخر.

باستخدام هذه التعريفات الواسعة ، من المحتمل أن يشمل الحظر المفروض على العوامل البيولوجية المسلحة جميع المواد البيولوجية سواء كانت من مسببات الأمراض التي تحدث بشكل طبيعي ، أو الكائنات الحية المعدلة أو المتلاعب بها ، أو التي تم إنشاؤها بشكل مصطنع في المختبر من نقطة الصفر. لكن عوامل SynBio جنبًا إلى جنب مع التقنيات سريعة التطور ، مثل تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 وتكنولوجيا النانو والمحاكاة الحيوية ، لا تقتصر على المواد أو التطبيقات البيولوجية.

ضع في اعتبارك المحاكاة الحيوية. لا يزال هناك تقدم ونمو أسي في البحث في هذا المجال ، مع إمكانية إنشاء مواد غير بيولوجية اصطناعية جديدة تحاكي التأثيرات البيولوجية التي تضعف وظائف بيولوجية محددة لأغراض خبيثة. مثل هذا التلاعب البيولوجي هو بالضبط ما تصوره الكولونيل Guo Ji-wei و Xue-sen Yang: إنشاء عوامل تهديد جديدة قادرة على استهداف مجموعات أو أفراد بناءً على سماتهم البيولوجية وتسبب آثارًا معيقة ، ويمكن أن تشمل إنشاء عوامل غير بيولوجية. سلاح مصمم للتفاعل مع الجينوم المحدد لزعيم وطني ، مثل رئيس الولايات المتحدة. تسمح هذه التطورات في SynBio والتقنيات الناشئة بتسليح عوامل تهديد غير بيولوجية جديدة ، ومن المحتمل أنها تقع خارج نطاق اتفاقية الأسلحة البيولوجية.

حتى إذا فسرت الدول على نطاق واسع التطورات في SynBio لتشمل عوامل التهديد غير البيولوجية ، على النحو المحظور بموجب هذه المعاهدات ، فإن طبيعة الاستخدام المزدوج للبحث تزيد من المخاطر. يمكن الوصول إلى تطبيقات SynBio الآن أكثر من أي وقت مضى. كان هناك توسع سريع في الأبحاث من قبل الدول والقطاع الخاص ومجموعات الهواة البيولوجية والمنظمات الدولية مثل مسابقة iGEM السنوية. ببساطة ، تتسارع التكنولوجيا بشكل أسرع من القانون الدولي. بغض النظر عما إذا كانت جميع جوانب SynBio تخضع لحظر كامل بموجب اتفاقية الأسلحة البيولوجية وبروتوكول جنيف لعام 1925 أم لا ، تظل التكنولوجيا الحيوية ساحة تنافس الدولة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا أصبحت التقنيات موجودة في كل مكان ، فحتى الجهات الفاعلة غير الحكومية ستبحث عن طرق جديدة لإحداث الفوضى في المجتمع. إذا كان من الممكن تسليح التكنولوجيا ، فمن المحتمل أن تكون كذلك.

وسائل وطرق الحرب

بغض النظر عما إذا كانت بعض تطبيقات SynBio تقع خارج نطاق اتفاقية الأسلحة البيولوجية وبروتوكول جنيف لعام 1925 ، فإن أي استخدام لمثل هذه الأسلحة لا يزال خاضعًا لقانون النزاعات المسلحة. ينص بند مارتنز ، الذي ظهر لأول مرة في ديباجة اتفاقية لاهاي لعام 1899 وتم تدوينه بشكل أكبر في البروتوكول الإضافي الأول لعام 1977 ، على أنه يجب تحليل أي سلاح جديد بموجب قانون الحرب لتحديد ما إذا كان غير قانوني في حد ذاته (محظور بموجب جميع الظروف) أو محظورة لاستخدامات معينة. في حين أن الأسلحة البيولوجية الكلاسيكية هي المثال الجوهري على كونها غير قانونية بطبيعتها ، فماذا عن أسلحة SynBio التي تتحدى التسمية "البيولوجية"؟

بشكل عام ، يركز القانون الدولي العرفي على اثنين من المحظورات الأساسية ، وهما تحديد ما إذا كان السلاح يسبب إصابات لا داعي لها أو أنه عشوائي بطبيعته. تحظر قاعدة الإصابات الزائدة الواردة في المادة 35 (2) من البروتوكول الإضافي الأول لعام 1977 استخدام أي سلاح "من طبيعة تسبب إصابات زائدة أو معاناة لا داعي لها". في حين أن الولايات المتحدة لم تصدق على هذه المعاهدة ، فإن القاعدة تعتبر قانونًا دوليًا عرفيًا وتتم الإشارة إليها في المعاهدات التي تكون الولايات المتحدة طرفًا فيها ، مثل لوائح لاهاي لعامي 1899 و 1907. تعتبر الولايات المتحدة عبارة "محسوبة للتسبب في إصابة زائدة عن الحاجة" أكثر دقة. بغض النظر ، تحظر القاعدة الأسلحة المصممة لزيادة إصابة أو معاناة من تمت مهاجمتهم بشكل غير ضروري بما يتجاوز ما تبرره الضرورة العسكرية.

قد يتم تصميم تطبيقات معينة من SynBio بحيث لا تنتهك قاعدة الإصابات الزائدة. على هذا النحو ، فإن فرض حظر شامل في حد ذاته على أساس الإصابة غير الضرورية يبدو أمرًا مشكوكًا فيه. في الواقع ، قد تكون بعض التطبيقات أكثر إنسانية. على سبيل المثال ، قد تكون مستهدفة بدقة أكبر من الأسلحة الأخرى ، أو يمكن تصميمها فقط لتعطيل القدرة دون التسبب في إصابة جسدية أو الوفاة. تشمل النظريات المحتملة الأخرى أسلحة SynBio التي تسبب ضررًا على المستوى المجهري دون التسبب في ضرر مباشر للأنسجة أو الأعضاء. بدلاً من ذلك ، قد تضعف هذه الأسلحة الوظائف الفسيولوجية الأخرى دون تهديد للحياة ، على سبيل المثال ، عن طريق الحد من قدرة جنود العدو على البقاء مستيقظين أو الحفاظ على التوازن أو أداء المهارات الحركية الأساسية. ولكن حتى لو تم تصميم بعض التطبيقات لقتل هدف بشري ، فقد لا تزيد الألم أو المعاناة مقارنة بالأسلحة الأخرى.

الحظر الأساسي الثاني - الأسلحة العشوائية بطبيعتها - مستمد من مبادئ التمييز والتناسب ، التي تعتبرها الولايات المتحدة القانون الدولي العرفي. يحظر التمييز الأسلحة التي ، بطبيعتها ، لا يمكنها التمييز بين المقاتلين والسكان المدنيين. في حين أن الولايات المتحدة ليست طرفًا في البروتوكول الإضافي الأول لاتفاقية جنيف ، تنعكس القاعدة العرفية في المادة 51 (4) (ب) من تلك المعاهدة وتنص على أن "الهجمات العشوائية هي ... تلك التي تستخدم طريقة أو وسيلة القتال الذي لا يمكن توجيهه إلى هدف عسكري محدد ". يحظر مبدأ التناسب الأسلحة عندما تكون الآثار العرضية المتوقعة مفرطة بشكل غير ضروري مقارنة بالميزة العسكرية المتوقع اكتسابها من استخدام السلاح. بشكل أساسي ، السلاح ذو التأثيرات الخارجة عن السيطرة يلبي هذا التعريف. تم تدوين هذه القاعدة أيضًا في البروتوكول الإضافي الأول في المادة 51 (4) (ج).

الخلاصة - ليست غير قانونية في حد ذاتها

الأسلحة البيولوجية التقليدية هي أمثلة كلاسيكية للأسلحة العشوائية ، فبمجرد إطلاقها يصبح انتشارها غير متوقع ولا يمكن السيطرة عليه. هذا النقص في التمييز هو السبب الأكثر إقناعًا لحظر الدول مثل هذه العوامل الممرضة. في الواقع ، من المحتمل أن ينطبق هذا المنطق على معظم أسلحة SynBio ، والتي تقع ضمن المادة الأولى من اتفاقية الأسلحة البيولوجية أيضًا. ومع ذلك ، يتضمن SynBio أيضًا تطوير مواد غير بيولوجية يمكنها تقليد العمليات والاستجابات البيولوجية ، ويبدو أن هذه المحاكاة الحيوية لا تندرج ضمن اتفاقية الأسلحة البيولوجية أو القانون العرفي الذي تعكسه.

في حين أن تطبيقات SynBio هذه قد لا تكون غير قانونية بطبيعتها أو خاضعة لحظر المعاهدة الحالي ، إلا أنه يمكن استخدامها بطريقة. في هذا السياق ، فإن مبادئ قانون الاستهداف - التمييز والتناسب والضرورة العسكرية والاحتياطات الممكنة في الهجوم - ستحكم دائمًا كيفية استخدام الأسلحة. قد تنتج التكنولوجيا أسلحة تقدم تمييزًا أكبر حيث يمكن تصميمها لاستهداف مقاتلين معينين أو مجموعات من المقاتلين بناءً على سمات دقيقة أو سمات توجيهية ، مثل المهنة أو حتى التعرض المسبق للقاحات. لن تكون هذه الأسلحة غير قانونية أثناء النزاع المسلح في حد ذاته. لكن استخدامها سيخضع للقواعد التي تحكم سير الأعمال العدائية وسيتم تقييمه على أساس كل حالة على حدة. باختصار ، قد تخلق SynBio وتقاربها مع التقنيات الناشئة أسلحة غير محظورة حاليًا بموجب التزامات نزع السلاح العالمي أو القانون الدولي العرفي ، وتثير هذه الفجوة القانونية احتمالية تسليح عوامل التهديد غير البيولوجية المصممة خصيصًا لخلق تأثيرات مستهدفة. قد يكون لهذه القدرات التكنولوجية الحيوية التكتيكية عواقب استراتيجية محتملة ومع ذلك قد تقع خارج النظام الحالي.


نتائج

تحليل ملزم

تم اختيار ما مجموعه 587 مركبًا كيميائيًا وفقًا لخصائص هيكلية وكيميائية فيزيائية معينة تمكن من تطوير المزيد من العقاقير الصيدلانية النباتية المحتملة [22]. ما يقرب من ثلث هذه المركبات لها أوزان جزيئية تبلغ & lt300 Da ، مما يشير إلى طبيعتها الشبيهة بالجزء ومدى ملاءمتها للتحسين المحتمل. تضمن الفحص الأولي لمجلدات NLP المحتملة الحقن المتسلسل لجميع المركبات بتركيزين فوق NLP المعطّل برقاقة المستشعر من ص. أفانيديرماتوم (البرمجة اللغوية العصبيةبيا) (الشكل 1 أ) ، مثل البرمجة اللغوية العصبيةبيا أصبح نموذجًا مهمًا لدراسة تفاعلات البرمجة اللغوية العصبية مع الأغشية الدهنية [20 ، 21]. أظهرت المركبات المختلفة استجابات نموذجية لـ SPR التي اقترحت إما عدم وجود ارتباط أو تجميع تحليلي بتركيزات أعلى أو ارتباط يعتمد على التركيز (الشكل 1 ب). تم حذف المركبات التي كانت قابلة للذوبان جزئيًا فقط في المخزن المؤقت لتشغيل SPR أو التي لم ترتبط من الاختبارات اللاحقة. لاختيار المجلدات الواعدة ، تم تعيين نقطة ربط لكل مستشعر ، أي الاستجابة قبل 5 ثوانٍ من نهاية الحقن (الشكل 1 أ). لوحظت الاستجابات المعتمدة على التركيز لـ 67 مركبًا (مظللة بأشرطة رمادية في الشكل 1 أ) ، والتي تم اختيارها لمزيد من تجارب الربط التفصيلية (الشكل 1 ج). كشفت المعايرة اللاحقة عن ارتباط العديد من المركبات بالبروتين ، ومع ذلك ، كانت التفاعلات ضعيفة ولم تصل إلى التشبع في نطاقات التركيز المختبرة ، كما هو موضح في الشكل 1 ج لأحد المركبات. عادةً ، تم تقييم تركيزات مركبة تصل إلى 0.5 ملي مولار ، حيث لا يمكن إذابة العديد من المركبات في المخزن المؤقت الذي يعمل ب SPR بتركيزات أعلى.

(أ) ربط كل مركب بـ NLPبيا تم اختباره في البداية بتركيزين ، 20 و 200 ميكرومتر. تم حقن عنصر تحكم عازلة بين المركبات المختلفة. تمثل النقاط استجابات ملزمة قبل 5 ثوانٍ من نهاية كل حقنة. (B) Sensorgrams were used to obtain the data in (A) and are presented for the buffer injection (black), 20 μM compound (light orange), and 200 μM compound (dark orange). Typical responses included no binding at any concentration (left), aggregation of compounds at the higher concentration (right), or concentration-dependent binding (middle). (C) Afterwards, 67 compounds that exhibited concentration-dependent binding to NLPPya were further screened at an extended range of concentrations. The titrations shown are for the compound 5D11 [61], which was titrated with concentrations ranging from 31 to 500 μM (from the bottom to the top in the upper graph). 5D11 does not exhibit saturated binding for the tested concentration range (bottom graph). The line is a linear fit to the responses obtained from the sensorgrams presented in the upper panel (5 s before the end of the injection).

The most promising NLPPya binders were compounds 6G7 و 7C8 with Kد values of 130.9 ± 36.4 μM (n = 6) and 52.8 ± 6.0 μM (n = 3), respectively (Fig 2). 6C3 exhibited stable binding to NLPPya however, the maximum binding response was at least 100 times higher than expected for 1:1 binding, which is indicative of a promiscuous inhibitor [23]. 6E11 did not bind to NLPPya (Fig 2) and was thus selected as a negative control for all subsequent experiments. The binding of 6C3, 6G7، و 7C8 was additionally tested on another NLP, NLPPp, which is secreted by ص. parasitica [15]. Similarly, 6C3 exhibited nonspecific binding, and 6G7 و 7C8 exhibited Kد values of 71.9 ± 19.1 μM (n = 2) and 40.5 ± 29.7 μM (n = 4), respectively (Fig 2).

The most promising binders were compounds 6G7 و 7C8. The binding response of 6C3 exceeded the expected response for a 1:1 interaction, indicating multi-site binding. مجمع 6E11 was used as a control. Data were fit to the steady-state affinity model.

The selected compounds inhibited NLP-induced necrosis

The toxic effects of NLPs on plant tissues are primarily observed as tissue necrosis [19,24], a gradual decay of leaf mesophyll cells and chlorosis of the leaves. The NLP-induced leaf tissue necrosis provides a robust and efficient functional assay for the identification of NLP inhibitors. Infiltration assays on tobacco leaves were used to test the potential inhibitory activity of 6G7, 6C3، و 7C8 (S1 Fig), which exhibited the highest affinity to NLPs in the SPR screening experiments (Fig 2). The necrotic lesions were inspected after 24 h. The compounds alone (at 1 mM) did not exert toxic effects on leaf tissues (S1A Fig). Next, we injected 400 nM NLPPp and 200 nM NLPPya alone or together with increasing concentrations of compounds subaxially into the leaf (S1 Fig). 6E11, which did not interact with NLPPya in the SPR assay (Fig 2), did not affect NLPPp cytotoxicity (S1B Fig). All three compounds that bound to NLPs (Fig 2) inhibited NLPPp- and NLPPya-induced necrosis (S1B and S1C Fig).

The selected compounds inhibited the growth of ص. infestans

ص. infestans is one of the most devastating plant pathogens that causes major damage to potato and tomato production worldwide. To assess their possible inhibitory effect, 6C3, 6G7، و 7C8 were applied to potato leaves together with spore preparations of ص. infestans. Reductions in the size and coloring of infection spots indicated that the infections were largely reduced or disappeared in the presence of 6C3, 6G7، و 7C8, but not in the presence of 6E11 (Fig 3A). Similarly, RT-PCR revealed that pathogen growth was significantly reduced in the presence of 6C3, 6G7، و 7C8 (Fig 3B).

(أ) ص. infestans growth on potato leaves (Solanum tuberosum). Each potato leaf was inoculated with both 1 mM of the control compound 6E11 (left half of the leaf) and 1 mM of the test compound (right half of the leaf). The leaves are representatives of ten repetitions, each conducted in parallel (applied on the top and the bottom of the leaf). (B) Quantification of ص. infestans growth on potato leaves 4 days after infection by real-time PCR. ***P<0.001 between the test and control compound Student’s t-test.

Phytopharmaceuticals are only useful if they are not toxic to humans and other living organisms. Therefore, the toxicities of 6G7, 6C3، و 7C8 were tested on the human colon epithelial adenocarcinoma cell line Caco-2 (S2 Fig). Cells were incubated overnight with the selected compounds at different concentrations, and cell toxicity was monitored with an MTT assay (S1 Methods). The lowest tested concentration of 7C8 (3.125 μM) reduced Caco-2 cell viability by 35%, and 12.5 μM 7C8 reduced cell viability to 20% of the untreated control. 6C3 did not affect cell viability at concentrations below 500 μM, while concentrations of 1 mM and 2 mM reduced cell viability by 8% and 15%, respectively. 6G7 did not affect cell viability, even at concentrations approximately 10 times higher than its Kد for NLPs.

The interaction of 6G7 with NLPPya as determined by STD-NMR

The most promising candidate for further biophysical and functional evaluation was 6G7 according to its functional properties, solubility, and SPR results. We encountered solubility problems with 7C8, which was poorly soluble at concentrations of >180 μM using 5% DMSO, while 6C3 exhibited promiscuous binding in SPR experiments (Fig 2), which is not desirable for development of specific inhibitors. We, therefore, performed in-depth characterization of 6G7 biophysical and functional properties.

We independently confirmed its interaction with NLPPya by using the saturation transfer difference-nuclear magnetic resonance (STD-NMR) approach. We observed clear STD signals in the presence of 6G7 (Fig 4A), but not in the presence of the negative control 6E11 (Fig 4B). Epitope mapping revealed the highest relative STD effects for the 6G7 protons H1، ح2, and H4, indicating that their corresponding aromatic ring is located closest to NLPPya (Fig 4A). In comparison, the other aromatic ring of 6G7 is positioned further away from the surface of NLPPya, as is demonstrated by the lower STD effects of protons H5−H8. Accordingly, the lowest STD effect was detected for the methyl moiety. STD-NMR experiments at different 6G7 concentrations allowed for the estimation of Kد at 150 ± 7 μM (Fig 4C), which is comparable with the value determined by SPR.

(A) 1 H and STD-NMR spectra of ligand 6G7 in the presence of NLPPya. The NMR spectra were recorded at 25°C, 4 s saturation time, 400 μM ligand concentration, and 1:50 receptor-to-ligand ratio in 25 mM Tris-د11 and 150 mM NaCl in 2 H2O and 5% DMSO-د6 at 600 MHz. Signals are labeled according to the atom numbers shown in the scheme, in which the relative degree of hydrogen atom saturation is marked with a corresponding color scale normalized to H1. Arrows indicate the overall STD effects for the symmetric atoms H5/8 و ح6/7. (B) 1 H and STD-NMR spectra of 6E11 in the presence of NLPPya under the same experimental conditions as in (A). (C) STD-amplification factor as a function of 6G7 concentration (0−560 μM). Experimental data were fit to Eq 2.

Binding mode assessment by molecular dynamics simulations

In order to explore the binding mode of compound 6G7, we initially attempted at identifying the potential ligand’s binding sites with various small molecule probes [25] on the NLPPya crystal structure (PDB ID 3GNZ) and two representative structures obtained from a cluster analysis of a μs-long molecular dynamics (MD) simulations trajectory of NLPPya in explicit solvent [13]. Three binding sites were identified (S3 Fig). Among these the central cavity harbouring the Mg 2+ ion, implicated in plant membrane sphingolipid receptor recognition [21], was the most likely binding site according to molecular docking simulations [26]. In addition, this was the only cavity where the ligand was retained in subsequent force field MD simulations (S4 Fig). Indeed, 6G7 remained stably bound to this cavity for 1 μs, while it rapidly dissociated from the two other identified binding sites within few ns of MD simulations. Due to the limitations of force fields in the description of Mg 2+ ions [27] the binding pose of 6G7 was also refined by performing 5 ps of hybrid quantum/classical (QM/MM) MD simulation, where the ligand, the metal and its coordination sphere were treated at QM level of theory. As a result, the carboxyl group of 6G7 coordinated the Mg 2+ ion, while the Asp93 and Asp104 residues of NLPPya and two water molecules completed the octahedral coordination sphere of the metal (Fig 5A). In order to assess the agreement of this binding pose with the STD-NMR experiments, we calculated the radial distribution function of 6G7 vs. NLPPya hydrogen atoms (the radial distribution function accounts for the probability of finding a protein hydrogen atom at a given distance from the selected hydrogen atom of the inhibitor). As a result, the hydrogen atoms of the benzoic acid fragment were the closest to the protein residues (Fig 5B), in line with the STD-NMR experiments (Fig 4A). In addition, we also explored the possible binding modes of 6E11, 6C3 و 7C8 to NLPPya central cavity. In this case we obtained a meta-stable binding pose exclusively for 7C8, which remained bound for hundreds of ns between the NLPPya loops, before dissociating, while the two remaining compounds (6E11, 6C3) dissociated from their initial docking poses within few ns of MD simulations (S5 Fig).

(A) Complex of NLPPya with the 6G7 ligand and inset of 6G7 binding mode, as obtained after

5 ps of quantum/classical (QM/MM) simulations. ال 6G7 carboxyl group bound to Mg 2+ ion, whose octahedral coordination sphere is completed by three water molecules, and by the NLPPya residues Asp93 and Asp104. The protein is represented as gray cartoons, the Mg 2+ ion as a yellow van deer Waals sphere, while the residues completing the Mg 2+ coordination sphere and the ligand are shown in licorice with carbon, oxygen, nitrogen and hydrogen atoms depicted in gray (for protein), green (for inhibitor), red, blue and white, respectively. (B) Radial distribution function plotting the probability density of finding a NLPPya protein hydrogen atoms at r distance (Å) from any hydrogen atoms of 6G7.

Functional characterization of 6G7

Finally, we performed thorough functional characterization of 6G7. After 24 h, NLPPya-induced leaf chlorosis was efficiently reduced in the presence of 1 mM 6G7, dissolved in buffer containing 10% DMSO (Fig 6A and 6B). Cytolytic activity of NLPs can also be assayed by measuring ion leakage of tissue [20], where increase in electrolytic conductivity of water correlates with the amount of ion leakage from cells. قدرة 6G7 to reduce cytotoxic damage induced by NLPPya was assessed 2 h after incubation of treated leaf tissue in water. We confirmed that 500 μM and 1 mM 6G7 concentrations efficiently inhibit ion leakage induced by NLPPya from tobacco cells (Fig 6C).

(A) The effects of 500 μM and 1 mM 6G7 on necrotic lesions formation induced by infiltrating tobacco leaves with 100 nM NLPPya. 6G7 and protein were dissolved in 20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5.8, containing 10% DMSO (buffer). The upper part of the leaf was photographed after 24 h. The injected solution of protein caused leaf necrosis, whereas buffer or the compounds alone did not substantially affect the plant tissue. (B) Statistical analysis of leaf chlorosis developed 24 hours after infiltrating tobacco leaves with either buffer, 6G7 or 100 nM NLPPya in absence and presence of 6G7. Values are means ± SD (n = 16), **P<0.01 vs. control (NLPPya) Student’s t-test. Buffer, 20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5.8, 10% DMSO. (C) Quantification of cell death by means of ion leakage experiment measurement. Values are means ± SD (n = 12–18), *P<0.05, **P<0.01 vs. control (100 nM NLPPya) Student’s t-test. Buffer, 20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5.8, 10% DMSO.


Nucleic Acids: DNA and RNA

DNA/RNA Is Genetic Material

Transformation in Bacteria

In 1928, in an attempt to develop a vaccine against pneumonia, Frederick Griffith became the first to identify bacterial transformation, in which the form and function of a bacterium changes. Both virulent and avirulent العقدية الرئوية were under his study. The virulence of the bacterium is determined by its capsular polysaccharide. Virulent strains have a capsule which is enclosed in a capsular polysaccharide, whereas avirulent strains do not. The nonencapsulated bacteria are readily engulfed and destroyed by phagocytic cells in the host animal's circulatory system. However, due to their protective outer polysaccharide capsule, virulent strains are not easily engulfed by the host's immune system, so they can multiply and cause pneumonia.

The presence or absence of the capsule also causes a visible difference between colonies of virulent and avirulent strains. Encapsulated bacteria form smooth, shiny-surfaced colonies (S) when grown on an agar culture plate. On the other hand, nonencapsulated strains produce rough colonies (R). As such, it is easy to identify the difference between these two strains through standard microbiological culture technique.

In Griffith's experiment , the virulent S. pneumoniae that has a smooth (S) capsule in its appearance was capable of causing lethal infections upon injection into mice ( Fig. 1.1 ). Because of their lack of a protective coat, the R-type bacteria are destroyed by the animal after the injection, as previously described. As such, the mice are still alive after the injection of R-type bacteria. When S-type bacteria were killed by the heat, they were no longer able to cause a lethal infection upon injection into mice alone. However, when the heat-killed S-type bacteria and live R-type bacteria were injected together, neither of which causes lethal infection alone, the mice died as a result of pneumonia infection. It was found that the virulent trait that was responsible for production of the polysaccharide capsule was passed from the heat-killed S-type cells into the live R-type cells, thus converting the R-type bacteria into S-type bacteria, allowing it to become virulent and lethal by evading the host's immune response. Griffith concluded that the heat-killed bacteria somehow converted live avirulent cells to virulent cells, and he called the component of the dead S-type bacteria the “transforming principle.”

Fig. 1.1 . Schematic diagram of Griffith's experiment which demonstrates bacterial transformation.

DNA Is the Genetic Material for Bacteria

Griffith's work led to further research of the transformation phenomenon. In 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty published what is now considered a classic paper in the field of molecular genetics. In this work, they demonstrated that DNA is the transforming principle. The schematic diagram of their experiment is shown in Fig. 1.2 . In their experiments, they removed the protein from the transforming extract through organic solvent extraction. After this treatment, proteins were absent from the transforming extract. They found that the transforming principle was still active, which meant the heat-killed bacteria were still able to convert live avirulent cells to virulent cells. They also performed chemical, enzymatic, and serological analysis, together with the results from electrophoresis, ultracentrifugation, and ultraviolet spectroscopy. These treatments can remove carbohydrates, lipids, protein, or RNA from the extract. They found that carbohydrates, lipids, protein, and RNA were also not the transforming substance. Chemical testing of the final product gave a strong positive reaction for DNA. The final confirmation came with experiments using crude samples of the DNA-digesting enzyme deoxyribonuclease (DNase), which can degrade DNA, specifically. They demonstrated that the transforming principle can be destroyed by this enzyme. There was no loss of transforming activity after heat inactivated this enzyme. As such, their observations confirmed that DNA is the transforming substance.

Fig. 1.2 . Schematic diagram of Avery, MacLeod, and McCarty's experiment which demonstrates that DNA is the transforming principle.

DNA Is the Genetic Material for Bacteriophage

The second major piece of evidence supporting DNA as the genetic material was through experiments conducted by A. D. Hershey and Martha Chase in 1952. Hershey and Chase used T2 bacteriophage in their experiment to identify whether DNA or protein is the genetic material. Bacteriophage can infect بكتريا قولونية and use the host to synthesize new phage particle. The phage consists of a protein coat surrounding a core of DNA. The phage attaches to the bacterial cell, and the genetic component of the phage enters the bacterial cells. Following infection, the viral genetic component dominates the cellular machinery of the host cells and leads to viral reproduction. Subsequently, many new phages are constructed, and the bacterial cell is lysed, releasing the progeny viruses. This process is normally referred to as the lytic cycle.

To define the function of the protein coat and nucleic acid in the viral reproduction process, Hersey and Chase radioactively labeled phage DNA with phosphorus-32 ( 32 P) and labeled phage protein with sulfur-35 ( 35 S). This is because DNA has phosphorus but not sulfur, whereas protein contains sulfur, but not phosphorus. Hershey and Chase let the labeled T2 bacteriophages infect the unlabeled bacteria and inject their genetic material into the cells ( Fig. 1.3 ). After the attachment and genetic material entry, the empty phage coats were removed through high shear force in a blender. The force stripped off the attached phages so that the phage and the bacteria could be analyzed separately. Centrifugation separated the lighter phage particles from the heavier bacterial cells. Following this separation, the bacterial cells, which now contained viral-labeled DNA, were eventually lysed as the new phages were produced. These progeny phages contained 32 P but not 35 S. These results suggested that the protein of the phage coat remains outside the host cells and is not involved in directing the production of new phages. On the other hand, phage DNA enters the host cells and is directly involved in phage reproduction. Because the genetic material must first enter the infected cells, they concluded that DNA is the genetic material, and that it contains genes passed along through generations.

Fig. 1.3 . Schematic diagram of Hershey-Chase experiment which demonstrates that DNA is directing reproduction of T2 phage in infected بكتريا قولونية الخلايا.

Taken together with work that had been done before, Hershey and Chase's work provided final, strong evidence to prove that DNA is the genetic material. Although these experiments demonstrated that DNA is the genetic material in bacteria and viruses, it was generally accepted that DNA is a universal substance as the genetic material in eukaryotes. This is because some indirect evidence has indicated that DNA is the genetic material in eukaryotes. For example, the genetic material should reside on the chromosome and be found in the nucleus. Both DNA and protein fit these criteria, but only DNA is enriched inside the nucleus, whereas protein is enriched in the cytoplasm. Furthermore, DNA is also found in both chloroplasts and mitochondria, which are also known for performing genetic functions. As such, DNA is only found where primary genetic functions occur. On the other hand, protein is found everywhere in the cell.

Direct evidence that DNA is the genetic material in eukaryotes comes from recombinant DNA technology. For example, a segment of a DNA fragment corresponding to a specific gene is isolated and ligated to bacterial DNA which can self-replicate inside the bacterial cell. The resulting complex is sent into a bacterial cell, and its genetic expression is examined. The subsequent production of the eukaryotic protein derived from that specific DNA segment in the bacterial cell demonstrates that DNA is the genetic material in the eukaryotic cells. This so-called gene cloning technique is now widely used in current biomedical research and pharmaceutical production ( Fig. 1.4 ).

Fig. 1.4 . Schematic diagram of a typical gene cloning process and the application of the gene cloning. The production of the specific eukaryotic protein derived from that introduced eukaryotic DNA segment proves that DNA is the genetic material in the eukaryotic cells.

RNA Is the Genetic Material for Viruses

Although DNA is the genetic material for most organisms, it has been demonstrated that the other type of nucleic acid, RNA, can also be genetic material. It was first demonstrated that when purified RNA from tobacco mosaic virus was spread on tobacco leaves, the leaves showed lesions of viral infection. Thus, it was concluded that RNA can be used as genetic material in viruses. Some groups of viruses are known to use DNA as their hereditary material, such as the T2 bacteriophage in Hershey and Chase's experiment. Those that use RNA as genetic material are called retroviruses. Retroviruses use a unique strategy, reverse transcription, to replicate their genetic material by using RNA as the template to synthesize complimentary DNA. This DNA intermediate can be incorporated into the genome of the host cell, and when the host DNA is transcribed, copies of the original retroviral RNA are produced. This type of RNA virus includes human immunodeficiency virus (HIV), which causes AIDS.


Zooming in on bacterial weapons in 3D

The plague, bacterial dysentery, and cholera have one thing in common: These dangerous diseases are caused by bacteria which infect their host using a sophisticated injection apparatus. Through needle-like structures, they release molecular agents into their host cell, thereby evading the immune response. Researchers at the Max Planck Institute for Biophysical Chemistry in Göttingen in cooperation with colleagues at the Max Planck Institute for Infection Biology in Berlin and the University of Washington in Seattle (USA) have now elucidated the structure of such a needle at atomic resolution. Their findings might contribute to drug tailoring and the development of strategies which specifically prevent the infection process.

Bacterial infection of host cells: Pathogens of the type Salmonella typhimurium (orange) establish contact to a human host cell (blue).

© MPI for Infection Biology, Christian Goosmann, Diane Schad, Rashmi Gupta and Michael Kolbe

Bacterial infection of host cells: Pathogens of the type Salmonella typhimurium (orange) establish contact to a human host cell (blue).

Hundreds of tiny hollow needles sticking out of the bacterial membrane – it is a treacherous tool that makes pathogens causing plague or cholera so dangerous. Together with a base, embedded in the membrane, these miniature syringes constitute the so-called type III secretion system – an injection apparatus through which the pathogens introduce molecular agents into their host cell. There, these substances manipulate essential metabolic processes and disable the immune defence of the infected cells. The consequences are fatal as the pathogens can now spread within the organism without hindrance. To date, traditional antibiotics are prescribed to fight the infection. However, as some bacterial strains succeed in developing resistances, researchers worldwide seek to discover more specific drugs.

The exact structure of the 60 to 80 nanometre (60 to 80 millionths of a millimetre) long and about eight nanometre wide needles has so far been unknown. Classical methods such as X-ray crystallography or electron microscopy failed or yielded wrong model structures. Not crystallisable and insoluble, the needle resisted all attempts to decode its atomic structure. Therefore Adam Lange and Stefan Becker at the Max Planck Institute for Biophysical Chemistry together with a team of physicists, biologists and chemists chose a completely novel approach. In cooperation with David Baker at the University of Washington, and Michael Kolbe at the Max Planck Institute for Infection Biology, the scientists successfully combined the production of the needle in the laboratory with solid-state NMR spectroscopy, electron microscopy, and computer modelling. The researchers deciphered the structure of the needle atom by atom and visualised its molecular architecture for the first time in the angstrom range, a resolution of less than a tenth of a millionth of a millimetre.

This required progresses in several fields. “We have made big steps forward concerning sample production as well as solid-state NMR spectroscopy,” says Adam Lange. “Finally, we were also able to use one of the presently most powerful solid-state NMR spectrometers in Christian Griesinger’s NMR-based Structural Biology Department at our Institute.” With 20 tesla, the magnetic field of this 850 megahertz spectrometer is about 400,000 times as strong as that of the earth.

Syringes isolated from شيغيلا فلكسنري. Adding soluble needle protein leads to a spontaneous elongation of some needles. The bar corresponds to 100 nanometres (1 nanometre corresponds to a millionth millimetre).

© MPI for Infection Biology, Christian Goosmann, Michael Kolbe

“We were surprised to see how the needles are constructed,” says Lange. As expected, the needles of pathogens causing diseases as diverse as food poisoning, bacterial dysentery, or the plague show striking similarities. However, in contrast to prevailing assumptions, the similarities are found in the inner part of the needles whereas the surface is astonishingly variable. According to the scientist, this variability might be a strategy of the bacteria to evade immune recognition by the host. Changes on the surface of the needle make it difficult for the host’s immune system to recognize the pathogen.

The scientists Lange, Kolbe, Becker, and their Max Planck colleagues Christian Griesinger und Arturo Zychlinsky, have focused on the bacterial injection apparatus for several years. Together with the Federal Institute for Materials Research and Testing they already showed in 2010 how bacteria assemble their miniature syringes. The discovery of their structure in atomic detail not only enables researchers to gain new insights into how these pathogens outwit their host cells, it also offers the prospect to block the syringe assembly and the delivery of the bacterial factors using tailored molecules. Such substances, referred to as antiinfectives, could act more specifically and much earlier during infection than traditional antibiotics. “Thanks to our new technique, we can produce large amounts of needles in the lab. Our aim is now to develop a high-throughput method. This will allow us to search for new agents that prevent the formation of the needle,” explains Stefan Becker.


A single genetic change in gut bacteria alters host metabolism

Scientists have found that deleting a single gene in a particular strain of gut bacteria causes changes in metabolism and reduced weight gain in mice, according to a study in the journal eLife.

The research provides an important step towards understanding how the microbiome – the bacteria that live in our body – affects metabolism.

It is well established that the microbiome influences the development of obesity and metabolic diseases such as diabetes. But although these associations are well known, the specific ways in which the microbiome affects metabolism are harder to decipher. This is because the gut contains so many species of bacteria producing many different kinds of metabolites. Untangling their different effects is a significant challenge.

In this study, researchers used a kind of 'genetic scalpel' to remove a particular gene from the microbiome and then investigated the effects of this change on host metabolism. They decided to focus on a group of substances that occur naturally in the human gut called bile acids. Imbalances in the bile acid pool are thought to contribute to diet-induced obesity. However, the question of which specific bile acids cause these effects remains unclear.

To address this question, the team focused on a class of bacterial enzymes called bile salt hydrolases. “Previous research has shown that these hydrolases play an important role in regulating host metabolism, but not exactly how,” explains senior author Sloan Devlin, Assistant Professor in the Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology at Harvard Medical School, US. “We took a novel approach to understanding the role of these enzymes by controlling the activity of a selective bile salt hydrolase in the mouse gut.”

After identifying a bacterial species with a bile salt hydrolase that only metabolises certain types of bile salts, they generated two strains of bacteria – one with the hydrolase and one without – and introduced them into germ-free mice. As hoped, they found that mice colonised with the hydrolase-deficient strain had much higher amounts of certain unmetabolised bile salts in their intestine.

They next investigated the downstream effects of altering the levels of specific bile salts on mouse metabolism. They were surprised to find that the mice colonised with bacteria lacking the hydrolase gained less weight than the mice colonised with the normal bacteria. They also found the animals had lower levels of fats and cholesterol in the blood and liver than those with the hydrolase, and they had a preference for metabolising fats rather than carbohydrates for energy.

Genetic analysis revealed that in addition to alterations related to metabolism, there were also changes in genes controlling circadian rhythm and immune response. This suggests that bile acid alterations caused by bacteria can cause a broader range of changes in the host.

“Previous work has shown that the microbiome as a whole affects metabolism, but our paper provides a more reductive view,” concludes Professor Devlin. “By showing that deleting a single gene results in downstream changes in the host metabolism, we establish this particular gene as a potential target for future drug development and provide a step towards a fuller understanding of how the microbiome affects metabolism.”


Considerations for dosing and formulations

Understanding the needs of the target patient population, as well as practicality in clinical development, can be considered early during the development of an engineered live bacterial therapeutic. Bacterial cells grown in fermenters often must be purified and concentrated to yield a product that is suitable for dosing. For orally administered therapeutics, administration of a frozen suspension may be possible for in-clinic dosing (e.g., in Phase 1 trials). However, for outpatient studies, formulations that require frozen storage and at-home reconstitution present challenges for patients, potentially leading to compliance issues 89 and risks of product instability. Cold chain storage also presents a challenge for supplying frozen drug products. Therefore, a solid formulation that is stable at room temperature is ideal for an orally administered product. This requires that the live organism can endure processes that convert a liquid culture to a solid form, such as lyophilization or spray drying, to retain viability and potency. Technological advances including microencapsulation and cryoprotectants could improve the stability of future LBP formulations 90,91 , and buffering may be considered to preserve cell activity and viability in the stomach. LBP formulations must also be palatable to patients to ensure compliance with dosing 89 .

For indications that require injection of the engineered live bacterial therapeutic, such as intratumoral administration, these drugs will be reconstituted and administered at a clinic that specializes in this procedure, and frozen liquid formulations are feasible. Hydrogel formulations have also been used for delivery of intratumoral drugs and may improve the concentration of the LBP within the tumor 92 . For dermatological conditions, the LBP may be formulated as a cream or gel so that it can be applied topically by the patient, but engineered bacterial cells will require stability at the storage conditions needed for home use. Odor and color masking may also be needed for any LBP to ensure patient compliance 93 .

A quantitative biomarker of the strain’s activity in the body is also very helpful to bridge early formulations with those used later in development and commercialization. For example, a Phase 1 safety study could be conducted with a frozen liquid preparation of cells to demonstrate activity of the LBP in humans, while a solid oral formulation (e.g., a sachet or capsule) is being developed. Production of the strain-specific biomarker can then be used as a benchmark to bridge to solid formulations before advancing into more lengthy and costly efficacy studies in patients.


Are there specific non-protein substances that pathogens release into their host? - مادة الاحياء

Physical and Chemical Barriers (Innate Immunity)

  • ال جلد has thick layer of dead cells in the epidermis which provides a physical barrier. Periodic shedding of the epidermis removes microbes.
  • ال mucous membranes produce mucus that trap microbes.
  • شعر within the nose filters air containing microbes, dust, pollutants
  • أهداب lines the upper respiratory tract traps and propels inhaled debris to throat
  • Urine flushes microbes out of the urethra
  • Defecation و vomiting -expel microorganisms.
  • ليسوزيم, an enzyme produced in tears, perspiration, and saliva can break down cell walls and thus acts as an antibiotic (kills bacteria)
  • Gastric juice in the stomach destroys bacteria and most toxins because the gastric juice is highly acidic (pH 2-3)
  • اللعاب dilutes the number of microorganisms and washes the teeth and mouth
  • حموضة on skin inhibit bacterial growth
  • Sebum (unsaturated fatty acids) provides a protective film on the skin and inhibits growth
  • Hyaluronic acid is a gelatinous substance that slows the spread of noxious agents

Nonspecific Resistance (Innate Immunity)

  • Phagocytic cells ingest and destroy all microbes that pass into body tissues. على سبيل المثال macrophages are cells derived from monocytes (a type of white blood cell). Macrophages leave the bloodstream and enter body tissues to patrol for pathogens. When the macrophage encounters a microbe, this is what happens:
    1. The microbe attaches to the phagocyte.
    2. The phagocyte's plasma membrane extends and surrounds the microbe and takes the microbe into the cell in a vesicle.
    3. The vesicle merges with a lysosome, which contains digestive enzymes.
    4. The digestive enzymes begin to break down the microbe. The phagocyte uses any nutrients it can and leaves the rest as indigestible material and antigenic fragments within the vesicle.
    5. The phagocyte makes protein markers, and they enter the vesicle.
    6. The indigestible material is removed by exocytosis.
    7. The antigenic fragments bind to the protein marker and are displayed on the plasma membrane surface. The macrophage then secretes interleukin-1 which activates the T cells to secrete interleukin 2, as described below under specific resistance .
  • إشعال is a localized tissue response that occurs when your tissues are damaged and in response to other stimuli. Inflammation brings more white blood cells to the site where the microbes have invaded. The inflammatory response produces swelling, redness, heat, pain
  • Fever inhibits bacterial growth and increases the rate of tissue repair during an infection.

Specific Resistance (Acquired Immunity)

  1. When an antigen is detected by a macrophage (as describe above under phagocytosis), this causes the T-cells to become activated.

    The activation of T-cells by a specific antigen is called cell-mediated immunity. The body contains millions of different T-cells, each able to respond to one specific antigen.

  2. The T-cells secrete interleukin 2. Interleukin 2 causes the proliferation of certain cytotoxic T cells و الخلايا البائية.
  3. From here, the immune response follows 2 paths: one path uses cytotoxic T cells and the other uses B cells.
  • The cytotoxic T cells are capable of recognizing antigens on the surface of infected body cells.
  • The cytotoxic T cells bind to the infected cells and secrete cytotoxins that induce apoptosis (cell suicide) in the infected cell and perforins that cause perforations in the infected cells.
  • Both of these mechanisms destroys the pathogen in the infected body cell.

Click here for an animation on cytotoxic T cells.

The animation is followed by practice questions. Click here for even more practice questions.

Activation of a helper T cell and its roles in immunity:

T Cell Pathway

  • T-cells can either directly destroy the microbes or use chemical secretions to destroy them.
  • At the same time, T cells stimulate B cells to divide, forming plasma cells that are able to produce الأجسام المضادة و memory B cells.
  • If the same antigen enters the body later, the memory B cells divide to make more plasma cells and memory cells that can protect against future attacks by the same antigen.
  • When the T cells activate (stimulate) the B cells to divide into plasma cells, this is called antibody-mediated immunity.

Click here for an animation on the immune response.

The animation is followed by practice questions.

  • IgG
  • IgM
  • IgA
  • IgE
  • IgD

There are 3 major types of T cells:

These cells secrete interleukin 2 (I-2) which stimulates cell division of T cells and B cells. In other words, these cells recruit even more cells to help fight the pathogen.

These cells remain dormant after the initial exposure to an antigen. If the same antigen presents itself again, even if it is years later, the memory cells are stimulated to convert themselves into cytotoxic T cells and help fight the pathogen.

This material is based upon work supported by the Nursing, Allied Health and Other Health-related Educational Grant Program, a grant program funded with proceeds of the State&rsquos Tobacco Lawsuit Settlement and administered by the Texas Higher Education Coordinating Board.


شاهد الفيديو: الحكيم في بيتك. تعرف على الفرق بين المرض النفسي والمرض العقلي مع سعد محمد (شهر نوفمبر 2021).