معلومة

2.4: تنقية الحمض النووي الريبي وتشغيل عمود التقارب - علم الأحياء


مقدمة

اليوم سيكون يوما حافلا! آخر مرة قمت فيها بإعداد aptamers 6-5 و8-12 بواسطة aptamers في المختبر رد فعل النسخ. الآن يجب عليك تنقية الحمض النووي الريبي (RNA) قبل إثراء الأبتامر المرتبط بالهيم على عمود تقارب.

لعزل الحمض النووي الريبي وتغيير المخازن المؤقتة ، ستقوم مرة أخرى بتنقية العمود. ومع ذلك ، هذه المرة ستكون المصفوفة عبارة عن هلام بولي أكريلاميد بدلاً من راتينج السيليكا. مصفوفة استبعاد الحجم هذه تحتفظ بالأحماض النووية أقصر من 20 قاعدة. بعد التنقية ، ستقوم بتحديد كمية الحمض النووي الريبي الخاص بك عن طريق القياس الطيفي. الأحماض النووية (كل من RNA و DNA) لها ذروة امتصاص عند 260 نانومتر. يمكن استخدام قانون بير لتحديد كمية الحمض النووي الريبي من هذه الذروة: Abs = ε lc ، حيث Abs هو الامتصاص المقاس ، l هو طول المسار (1 سم لمعظم المواصفات) ، c هو التركيز ، و هو معامل الانقراض . بالنسبة للحمض النووي الريبي ، ε هو 0.025 (ميكروغرام / مل سم) -1 ، لذا فإن وحدة امتصاص واحدة تقابل 40 ميكروغرام / مل من الحمض النووي الريبي. يعطي الامتصاص عند 280 نانومتر بعض الدلائل على نقاء الحمض النووي الريبي ، حيث أن البروتينات لها ذروتها الامتصاصية عند هذه القيمة (ويرجع ذلك أساسًا إلى الببتيدات العطرية التربتوفان والتيروزين). عبس260:عضلات المعدة280 النسبة المطلوبة ~ 2: 1. كإعداد نهائي قبل اختيار العمود ، يجب تغيير طبيعة الكمية المناسبة من الحمض النووي الريبي عند 70 درجة مئوية وإعادة طبيعتها في درجة حرارة الغرفة للتأكد من أنها تحتوي على البنية الثانوية الصحيحة. وإلا فإن الأبتامر 8-12 قد لا يرتبط بالهيم.

الآن يجب أن تكون قد اشتركت في الشروط التجريبية لبروتوكولات الأعمدة. ** ستستخدم أنت وشريكك نفس النسبة من aptamers ، لكن عددًا مختلفًا من عمليات غسل الأعمدة. يتكون عمود التقارب الذي ستستخدمه من خرز agarose مع الهيم المربوط. وبالتالي ، عند إضافة aptamers الخاص بك إلى العمود ، يجب أن يتم ربط 8-12 ولكن يجب ألا يتم ربط 6-5. بالطبع ، لن يتم ربط حوالي 6-5 بالعمود على وجه التحديد. لإزالته ، ستضيف قسامات من مخزن الاختيار المؤقت إلى العمود وتترك 6-5 تغسل. إذا كنت تغسل بقوة شديدة ، فقد تفقد حوالي 8-12 أيضًا. يتمثل جزء من تجربة اليوم في التركيز على ظروف الغسيل المثالية ، أي الظروف التي تحافظ على 8-12 جيدًا على العمود بالنسبة إلى 6-5. أخيرًا ، لجمع aptamer الذي يظل مرتبطًا بالعمود ، ستضيف محلول هيم مركز. سوف يتنافس الهيم الحر مع الهيم المربوط لربط الأبتامر ، ويجب التخلص من الأبتامير بسهولة بعد خطوة حضانة قصيرة. أحد المضاعفات الإضافية هو أن الأحماض النووية ترتبط بشكل غير محدد ب [اغروس). وبالتالي ، سوف نستخدم الحمض الريبي النووي النقال في المخزن المؤقت لدينا للتنافس مع الأبتاميرات لهذه المواقع غير المحددة. بشكل عام ، يجب إثراء 8-12 aptamer مقارنة بـ6-5 بنهاية هذه العملية.

بمجرد جمع عيناتك ، ستبدأ عملية تركيز الحمض النووي الريبي الذي تم جمعه. الطريقة الشائعة للقيام بذلك هي ترسيب الملح والإيثانول. يقلل الإيثانول من فحص الشحنة ، مما يسمح للأيونات الموجبة للملح بالارتباط الأيوني وترسيب الأحماض النووية سالبة الشحنة. بعد اختيار العمود ، قد تحتوي عيناتك على القليل من الحمض النووي الريبي ، ويجب أن تستفيد من خطوة هطول الأمطار الطويلة (حتى جلستنا التالية). ستحاول أيضًا الحد من فقد الحمض النووي عن طريق إضافة "ناقل" يترسب مع الحمض النووي الريبي ، أي الجليكوجين. في النهاية ، لمعرفة كيفية أداء الحمض النووي الريبي المختار في اختبار ملزم ، سيتعين عليك أولاً تضخيمه.

** تسجيل بروتوكولات العمود: تم منح الطلاب اختيار الشروط لمعاملين يؤثران على صرامة الاختيار. كانت نسبة البداية للمادة الرابطة (8-12) 2 ، 10 ، أو 50٪ ، بينما بقيت الكمية الإجمالية من الحمض النووي الريبي (8-12 و6-5) ثابتة. كان عدد الغسيل أثناء الاختيار 4 أو 8 أو 16 أو 24 غسلة.

البروتوكولات

قبل البدء اليوم ، تأكد من تنظيف منطقة المقعد والماصات وأجهزة الطرد المركزي باستخدام RNase بعيدًا.

الجزء 1: تحضير أعمدة التنقية الدورانية وتنقية الحمض النووي الريبي

  1. خذ IVTs المذابة من آخر مرة ، وأضف 1/10 من حجم تفاعل DNase إلى كل تفاعل.
    • على سبيل المثال ، لتفاعل 100 ميكرولتر ، يمكنك إضافة 10 ميكرولتر من DNase.
    • ما هو الغرض من إضافة DNase قبل متابعة اختيار العمود؟
  2. ضعها على كتلة حرارية 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وفي غضون ذلك قم بإعداد الأعمدة.
    • ابدأ فورًا في إعداد أعمدة الدوران - مع كل الحضانات والدوران ، سيستغرق الأمر وقتًا أطول مما تعتقد!
    • أثناء التدوير والحضانة ، قد تتمكن أيضًا من بدء الجزء 2 (الخطوات 1 + 2) أدناه.
    • عندما تنتهي فترة الحضانة البالغة 30 دقيقة ، ضع IVTs المهضومة على الجليد. تبرد لمدة دقيقتين على الأقل قبل وضع الحمض النووي الريبي على أعمدة الدوران.
  3. خذ عمودًا واحدًا من نوع Micro Bio-Spin وأنبوب دقيق بحجم 2 مل لكل تفاعل ، ولكل منهما:
  4. اقلب العمود بسرعة للخلف وللأمام بضع نغمات لإعادة تعليق الهلام ، ثم حركه أو اضغط عليه للتخلص من فقاعات الهواء.
  5. قم بإغلاق علامة التبويب البلاستيكية في الجزء السفلي من العمود (قد يتدفق القليل من المخزن المؤقت) ، ثم ضع العمود في أنبوب الميكروفوج سعة 2 مل. قم بإزالة الغطاء واترك المخزن المؤقت الزائد يستنزف.
    • سيستغرق هذا بضع دقائق فقط. يجب أن يستقر الراتينج على مسافة 1-2 مم تقريبًا أسفل عنق العمود الضيق.
    • إذا لم يبدأ المخزن المؤقت في التدفق ، فتحدث إلى هيئة التدريس. في بعض الأحيان ، دفع الغطاء ثم إزالته سيساعد على البدء.
  6. عندما يتوقف المخزن المؤقت عن التدفق ، تخلص من eluant في أنبوب نفايات وطرد الأنبوب لمدة دقيقتين عند 1000 جم. (لا حاجة لاستبدال الغطاء.)
    • هل g هو نفسه RCF أو rpm؟ اسأل إذا كنت غير متأكد!
  7. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحديد إلى أعلى العمود. اتركه يجف عن طريق الجاذبية لبضع دقائق ، ثم قم بتدويره لمدة دقيقة واحدة عند 1000 جرام.
  8. كرر الخطوة 7 ثلاث مرات أخرى. في غضون ذلك ، قم بتسمية أنبوبين إيبندورف سعة 1.5 مل للتجميع (على الجانب و مع ملصق لاصق على الغطاء يشير إلى هوية aptamer) ، وقطع قبعاتهم.
  9. انقل كل عمود إلى أنبوب سعة 1.5 مل - يجب تسمية كل من العمود والأنبوب ، ليكونا في الجانب الآمن - ثم أضف 75 ميكرولتر من تفاعل IVT الخاص بك بلطف إلى منتصف السطح العلوي للجيل.
  10. جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق ، عند 1000 جم. استبدل الغطاء بحذر على كل عينة ، واحفظه على الثلج في الوقت الحالي.

الجزء 2: تحديد كمية استرداد الحمض النووي الريبي

  1. لكل عينة من الحمض النووي الريبي ، ستضيف 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي إلى 695 ميكرولتر من الماء. يجب أن يمنحك هذا قياسًا في نطاق موثوق. يمكنك تحضير أنابيب إيبندورف التي تحتوي على كمية مناسبة من الماء مسبقًا.
  2. للحصول على القياس الأكثر دقة ، يجب عليك أيضًا إعداد محلول طمس يحتوي على كل شيء باستثناء الحمض النووي الريبي ، أي 695 ميكرولتر من الماء و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحديد.
  3. بعد التصفية من عينات الحمض النووي الريبي ، كل ماصة بلطف واختلط لفترة وجيزة (تجنب صنع الفقاعات!) ، ثم خذ 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي وأضفها إلى إبندورف المليء بالماء.
  4. أضف 690 ميكرولتر من الحلول الثلاثة الخاصة بك لفصل الأكواخ والتوجه إلى المواصفات.
    • لاحظ أننا نستخدم اليوم كوفيتات مصنوعة من بلاستيك خاص شفاف للأشعة فوق البنفسجية.
  5. ابدأ بالكوفيت الذي يحتوي على محلول الطمس ، واضرب فارغ على مقياس الطيف الضوئي.
  6. الشروع في إجراء مسح امتصاصي لكل عينة من الحمض النووي الريبي. سجل قيم الامتصاص البالغة 260 نانومتر و 280 نانومتر في دفتر ملاحظاتك. يمكنك ببساطة لمس الشاشة بإصبعك لاختيار الطول الموجي الخشن ، ثم لمس الأسهم للاختيار الدقيق.
    • ما هو الافتراض الذي نتخذه بشأن الكوفيتات عندما نضع محلول الطمس في كفيت منفصل عن العينات؟
  7. أدخل بيانات 260 و 280 نانومتر في ورقة Excel التي أعددتها للواجب المنزلي.
    • تذكر أن قيمة الامتصاص 1 تشير إلى تركيز 40 ميكروغرام / مل من الحمض النووي الريبي المقاس (أي المحلول المخفف وليس المخزون الأصلي).

الجزء 3: تحضير RNA للاختيار

  1. تمييع 75 ميكرولتر من كل عينة من الجيش الملكي النيبالي في اختيار المخزن المؤقت لتركيز 8 ميكرومتر.
    • لاحظ أنه عادة ما يتم استرداد 85-90 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي بعد شطف العمود. إذا كان لديك <75 ميكرولتر ، أخبر هيئة التدريس بذلك.
    • الأوزان الجزيئية الخاصة بالأبتاميرات هي 31،344 جم / مول و 33،824 جم / مول لمدة 6-5 و8-12.
    • سيكون الحجم النهائي على الأرجح 0.5-1.5 مل ؛ تحقق مع هيئة التدريس إذا لم يكن كذلك.
  2. قبل المتابعة ، تأكد من أن لديك ما يكفي من كل أبتامير لمتابعة خطتك التجريبية. إذا لم يكن كذلك ، تحدث إلى هيئة التدريس.
  3. تحضير 2.1 نانومول من خليط أبتامير 6-5 / 8-12.
    • على سبيل المثال ، يحتوي خليط 20٪ 8-12 على 0.42 نانومول من 8-12 و 1.68 نانومول من 6-5 RNA.
  4. ضع جانباً 1.4 نانومول من الخليط في أنبوب إيبندورف جيد الملصقات - سيكون هذا بمثابة عينة اختيارك المسبق في اختبار الربط في اليوم 7 ويجب أن تبقى على الجليد في الوقت الحالي.
  5. سيتم استخدام 0.5 نانومول آخر من الخليط لاختيارات العمودين (0.25 نانومول لكل منهما). إضافة 178 ميكرولتر من المخزن المؤقت التحديد إلى 0.5 نانومول من الجيش الملكي النيبالي. يجب تغيير طبيعة هذا الخليط عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبريده في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل.
  6. بعد فترة التبريد ، أضف 160 ميكرولتر من 125 ميكروغرام / مل tRNA إلى العينة والماصة برفق للخلط.
    • ما هو التركيز النهائي للـ tRNA في عينتك؟
  7. استرداد اثنين 200 ميكرولتر مقسومة من طين حبة الهيمين من هيئة التدريس. تدور كل واحدة لمدة 1 دقيقة عند 1000 ز ، وإزالة ميكرولتر 900 ~ من طاف بواسطة الأنابيب.
    • تم غسل الحبيبات واحتضانها باستخدام مخزن مؤقت للاختيار من أجلك.
  8. أخيرًا ، أضف نصف عينة الحمض النووي الريبي الخاص بك إلى كل أنبوب من الخرزات ، وقم بتغطيته بإحكام ، وقم بتغطيته بورق قصدير ، وضعه على الجوز لمدة ساعة واحدة.
    • يجب أن يكون لديك حوالي 400 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي ، ولكن بسبب فقد الحجم ، قد تضيف أقل بقليل من 200 ميكرولتر لكل أنبوب ، على سبيل المثال 190-195 ميكرولتر.
  9. كمعايير اختبار الربط ، يجب عليك أيضًا تخصيص 1.4 نانومول بالضبط لكل من 6-5 و8-12 على حدة. قم بإعطاء هذين النوعين من الإيبيندورف ، جنبًا إلى جنب مع العينة "المسبقة" ، إلى هيئة التدريس ، مع التأكد من أنهما موحمان جيدًا ومُحكمان. سيتم تخزين هذه العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
    • إذا كنت قلقًا بشأن التبخر ، ولديك عينة لتجنيبها ، يمكنك تخصيص أكثر من 1.4 نانومول إذا كنت ترغب في ذلك. فقط تذكر أن تأخذ 1.4 نانومول فقط للاختبار في يوم فحص الربط.

خلال فترة الحضانة التي تبلغ مدتها ساعة واحدة ، يمكنك الكتابة في دفتر ملاحظاتك ، أو مغادرة المختبر للاستراحة لتناول وجبة خفيفة ، أو الاستعداد للجزء 4 أدناه ، أو قضاء الوقت كما تراه مناسبًا.

الجزء 4: اختيار العمود

  1. يمكنك أنت وشريكك مشاركة موقف خاتم واحد. قم بتثبيت عمودين على حامل الحلقة بحيث يكون لكل منهما إمكانية الوصول إلى أحدهما. (انظر الصورة.)
  2. التقط الجزء السفلي من كل عمود. احتفظ بالقبعات العلوية والسفلية لاستخدامها لاحقًا.
  3. بلل كل عمود بـ 200 ميكرولتر من SB ، واتركه يستنزف.
  4. أضف أنبوبًا واحدًا من خليط الراتينج / الأبتامر إلى كل عمود ، واتركه يصفى.
    • قد تحتاج إلى ضبط وتيرة سحب العينة للحصول على تعليق موحد للخرز في الطرف.
  5. الآن يجب عليك شطف المواد غير الملزمة من العمود. ابدأ بإضافة 200 ميكرولتر من SB إلى أعلى العمود ، واتركه حتى يستنزف.
  6. كرر X مرات ، وفقًا لبروتوكول الغسيل الذي اشتركت فيه. تأكد من أن كل واحد منكم يعرف الشريك الذي يقوم برقم الغسيل! يجب أن تستغرق كل غسلة بضع ثوانٍ فقط.
  7. أخيرًا ، قم بتوصيل الجزء السفلي من العمود باستخدام الغطاء الأصفر ، وأضف 200 ميكرولتر من 2.5 ملي هيمين ، والتي سيتم استخدامها للتخلص من الأبتاميرات. احتضان لمدة 10 دقيقة. ضع الغطاء العلوي بشكل غير محكم على العمود أثناء هذه الحضانة.
  8. قم بفك غطاء العمود ، واسمح للشطف بالتصريف عن طريق الجاذبية إلى إبندورف المسمى جيدًا.

الجزء 5: بدء ترسيب الحمض النووي الريبي

  1. قياس الحجم التقريبي (في غضون بضع ميكرولتر) من المحلول المسترد.
  2. أضف 1/10 حجم أسيتات الأمونيوم ، 1/200 فولت جليكوجين ، و 2.5 فولت 100٪ إيثانول ، بهذا الترتيب.
    • على سبيل المثال ، لمحلول 200 ميكرولتر ، يمكنك إضافة 20 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم.
  3. امنح هيئة التدريس عيناتك ليتم تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى المرة القادمة.

في المرة القادمة

  1. اكتب الجزء التالي من قسم الأساليب (أيام 3 + 4 من الوحدة) ، وقم بتطبيق الملاحظات التي تلقيتها على مسودتك السابقة.
  2. اكتب مسودة قسم المقدمة في تقريرك. راجع المهمة المحددة بالإضافة إلى إرشادات الكتابة العامة للحصول على اقتراحات حول الهيكل والمحتوى.
  3. كن مستعدًا لمناقشة بقية تمارين الكتابة عندما يزور نيل وليندا في المرة القادمة.

قائمة الكاشف

  • تركيز مخزون DNase هو 2000 وحدة / مل (من New England Biolabs)
  • أعمدة مايكرو بيو سبين
    • الراتنج: Bio-Gel P30 in Tris buffer
    • 40000 ميغاواط قطع
    • RNase مجاني
    • من بيو راد
  • الاختيار العازلة
    • 100 ملم تريس أسيتات
    • 500 ملي خلات الصوديوم
    • 25 ملي K- أسيتات
    • 10 ملي ملغ خلات
    • 5٪ DMSO
    • 0.05٪ تريتون اكس
  • أعمدة كروماتوغرافيا Poly-Prep من Bio-Rad
  • حبات Hemin-agarose
    • متوفر كملاط 2x (جزء واحد من الراتنج: جزء واحد من المحلول)
    • 4 ميكرولتر هيمين لكل مل راتينج
    • من سيجما الدريتش
  • الهيمين النقي
    • مخزون المواد الكيميائية الصلبة من سيجما الدريتش
    • محلول مخزون مركز (~ 10-15 مم) محضر في DMSO
    • مخفف إلى 2.5 ملي مولار في عينة المخزن المؤقت
  • ترسيب الحمض النووي الريبي (حلول المخزون)
    • 5 م خلات الأمونيوم
    • 20 مجم / مل جليكوجين

علامات التقارب لتنقية البروتين

جوزيف ج.فالك ، جون أ.كوربين ، في موسوعة الكيمياء البيولوجية ، 2004

علامات تقارب تفاعل حمض البوليامينو - مصفوفة

يعتبر كروماتوغرافيا تقارب المعدن الثابت (IMAC) تقنية شائعة تستخدم لتنقية البروتينات المؤتلفة المندمجة في علامة تقارب ببتيد قصيرة. تعتمد IMAC ، التي يمكن إجراؤها في ظروف تغيير طبيعة أو عدم تشبع ، على التفاعل بين العديد من الجهات المانحة للإلكترون على علامة التقارب مع أيون معدني انتقالي (Co 2+ ، Ni 2+ ، Cu 2+ ، Zn 2+) دعم المرحلة الصلبة. عادةً ما تكون علامة التقارب متعددة الهيستدين ، وتتراوح طولها من 6 إلى 12 وحدة بنائية مدمجة في الطرف N أو C للهدف ، حيث يكون "6-His" هو الأكثر شيوعًا والمتبرع بالإلكترون هو حلقة الهيستدين إيميدازول. في الآونة الأخيرة ، تم أيضًا استخدام علامة تقارب تعتمد على الببتيد الطبيعي المشتق من الطرف N لنزعة هيدروجين لاكتات الدجاج. تحتوي علامة HAT هذه على 6 بقايا هيستيدين متناثرة داخل عديد ببتيد من 19 بقايا (KDHLI HNVHK EEHAH AHNK) الذي يرتبط على وجه التحديد بـ Co 2+ -carboxymethylaspartate وله صافي شحنة أقل من علامات polyhistidine. أكثر الخالب المعدني استخدامًا هو حمض الخلوي الخلوي (IDA) ، في حين أن حمض النيتريلوترياسيتيك (NTA) وحمض الأسبارتيك الكربوكسي ميثيل (الاسم التجاري TALON) شائعان أيضًا. يقترن المخلب بشكل تساهمي بشكل عام بحبيبات بوليمر ، أو خرزات مغناطيسية حديدية للعزل المغناطيسي. عادةً ما يتم إجراء امتزاز البروتينات الموسومة بـ IMAC عند درجة الحموضة المحايدة إلى القاعدية قليلاً لضمان عدم بروتونات مجموعات الهيستيدين إيميدازول. تشمل ظروف الشطف الخفيف تبادل الترابط مع إيميدازول ، واستخراج أيون المعدن بواسطة مادة مخلبة قوية مثل EDTA ، أو شطف محلل للبروتين. ستتم إزالة درجة الحموضة المنخفضة أيضًا ، ولكنها قد تفسد أحيانًا البروتين المستهدف. لا يوصى باستخدام IMAC للبروتينات المستهدفة التي تمتلك مركزًا معدنيًا ، حيث يمكن تجريد المعدن بواسطة خالب شريك الربط.

Arg-tag هي مثال آخر لعلامة تقارب صغيرة لحمض بولي أمينو ، وهي مصممة في هذه الحالة لرفع النقطة المتساوية الكهربية لبروتين الاندماج لتعزيز ارتباطه بمصفوفة التبادل الكاتيوني. ظروف الشطف الخفيف هي عمومًا تدرج كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة القلوية. ترتبط هذه العلامة أيضًا بأوراق الميكا المسطحة ، والتي قد تتيح مجموعة متنوعة من التطبيقات الجديدة.


استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين: الماضي والحاضر

يعد استخراج الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتين الطريقة الأساسية المستخدمة في علم الأحياء الجزيئي. يمكن عزل هذه الجزيئات الحيوية عن أي مادة بيولوجية لعمليات لاحقة أو تحليلية أو تحضيرية. في الماضي ، كانت عملية استخراج الأحماض النووية وتنقيتها معقدة ، وتستغرق وقتًا طويلاً ، وتتطلب جهدًا كثيفًا ، ومحدودة من حيث الإنتاجية الإجمالية. يوجد حاليًا العديد من الطرق المتخصصة التي يمكن استخدامها لاستخراج الجزيئات الحيوية النقية ، مثل البروتوكولات القائمة على الحلول والبروتوكولات القائمة على الأعمدة. لقد قطعت الطريقة اليدوية شوطًا طويلاً بمرور الوقت مع العديد من العروض التجارية التي تضمنت مجموعات كاملة تحتوي على معظم المكونات اللازمة لعزل الحمض النووي ، ولكن معظمها يتطلب خطوات طرد مركزي متكررة ، تليها إزالة المواد الطافية اعتمادًا على نوع العينة و معالجة ميكانيكية إضافية. تزايد الطلب على الأنظمة الآلية المصممة للمختبرات المتوسطة والكبيرة خلال السنوات الأخيرة. إنه بديل للطرق اليدوية كثيفة العمالة. يجب أن تسمح التكنولوجيا بإنتاجية عالية للعينات ، يجب أن يكون إنتاج الجزيئات الحيوية ونقاوتها وإمكانية استنساخها وقابليتها للتوسع بالإضافة إلى سرعة ودقة وموثوقية الفحص إلى أقصى حد ، مع تقليل مخاطر التلوث المتبادل.

1. إدخال استخراج الجزيئات الحيوية

يعتبر استخلاص الجزيئات الحيوية والحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين من أهم الطرق المستخدمة في علم الأحياء الجزيئي [1]. إنها نقطة البداية للعمليات النهائية وتطوير المنتجات بما في ذلك مجموعات التشخيص. يمكن عزل DNA و RNA والبروتين من أي مادة بيولوجية مثل الأنسجة الحية أو المحفوظة أو الخلايا أو جزيئات الفيروس أو عينات أخرى لأغراض التحليل أو التحضير [1].

تتضمن فئتان تشاركان في تنقية الحمض النووي عزل تراكيب الحمض النووي المؤتلف مثل البلازميدات أو العاثية وعزل الحمض النووي الصبغي أو الجينومي من الكائنات بدائية النواة أو حقيقية النواة [2]. بشكل عام ، تطلبت عملية تنقية الحمض النووي الناجحة أربع خطوات مهمة: التعطيل الفعال للخلايا أو تمسخ الأنسجة لمجمعات البروتين النووي تعطيل النوكلياز ، على سبيل المثال ، RNase لاستخراج الحمض النووي الريبي و DNase لاستخراج الحمض النووي بعيدًا عن التلوث [2]. يجب أن يكون الحمض النووي المستهدف خاليًا من الملوثات بما في ذلك البروتين والكربوهيدرات والدهون أو الأحماض النووية الأخرى ، على سبيل المثال ، الحمض النووي الخالي من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي [3]. ستؤثر جودة وسلامة الحمض النووي المعزول بشكل مباشر على نتائج جميع الأبحاث العلمية الناجحة [4].

من ناحية أخرى ، فإن الحمض النووي الريبي هو جزيء غير مستقر وله نصف عمر قصير جدًا بمجرد استخلاصه من الخلية أو الأنسجة [5]. هناك عدة أنواع من RNA التي تحدث بشكل طبيعي بما في ذلك RNA الريبوسومي (rRNA) (80٪ -90٪) ، رسول RNA (مرنا) (2.5٪ -5٪) ونقل الحمض النووي الريبي (tRNA) [3]. مطلوب رعاية واحتياطات خاصة لعزل الحمض النووي الريبي لأنه عرضة للتدهور [3 ، 6]. الحمض النووي الريبي غير مستقر بشكل خاص بسبب الوجود في كل مكان لـ RNases وهي إنزيمات موجودة في الدم وجميع الأنسجة ، وكذلك معظم البكتيريا والفطريات في البيئة [3 ، 5]. لطالما استُخدمت المُمْكِنات القوية في عزل الحمض النووي الريبي السليم لتثبيط RNases الذاتية [2]. يعتمد استخراج الحمض النووي الريبي على تقنية معملية جيدة وتقنية خالية من الحمض النووي الريبي. RNAse مستقر للحرارة ويعاد تشكيله بعد تمسخ الحرارة. يصعب تعطيلها لأنها لا تتطلب عوامل مساعدة [2]. يمكن تقسيم طرق العزل الأكثر شيوعًا إلى فئتين: استخدام 4 M guanidinium thiocyanate واستخدام الفينول و SDS [2].

يعد تنقية البروتين أحد أهم الأجزاء في أبحاث البروتين لفهم وظيفتها ، حيث يمكن أن يشاركوا جزئيًا أو كليًا في أي نشاط لتخليق الحمض النووي. تنقية البروتين مطلوب لتحديد خصائصه الفريدة ، بما في ذلك الحجم والشحن والشكل والوظيفة [7]. الاستخراج المستند إلى الخلية هو الخطوة الأولى لتنقية البروتين بالكامل تقريبًا. يمكن استخراج البروتين بعدة طرق مثل تحلل المنظفات ، وقوة القص ، والعلاج بملح أيوني منخفض (التمليح) ، والتغيرات السريعة في الضغط ، والتي تهدف إلى إضعاف وكسر الأغشية المحيطة بالخلية للسماح للبروتينات بالهروب [7 ]. يجب مراعاة بعض العوامل عند التعامل مع البروتينات. عادة ، يتم إجراء استخلاص البروتين في درجة حرارة منخفضة جدًا (

) حيث يتم تغيير طبيعة البروتينات بسهولة بمجرد إطلاقها من الخلايا. حالة العازلة هي أحد العوامل الرئيسية التي يجب أخذها في الاعتبار. يوصى بالحفاظ على ظروف عازلة محددة بسبب حساسية البروتينات تجاه التغيرات البيئية في درجة الحموضة [4]. سيؤثر نقاء الماء على محصول المنتجات النهائية حيث تحتوي المياه غير النقية على الكثير من الكائنات الحية الدقيقة أو البروتياز التي ستؤدي إلى تدهور البروتين [4]. مثبطات البروتين ، التي قد توجد في محلول أو مخازن ، تسبب تحلل البروتينات. المنظف ، عامل مهم آخر لا يمكن إهماله في تنقية البروتين ، يتكون من جزء كاره للماء من "ذيل" هيدروكربوني خطي أو متفرع و "رأس" محب للماء [4]. تقوم بإذابة بروتين الغشاء وهي جزيئات برمائية تشكل مذيلات مع رأس البروتينات المحبة للماء [4]. سيتم إضافة عوامل الاختزال إلى المحلول أو المخزن المؤقت لاستخراج البروتين وتنقيته لتجنب فقد نشاط البروتينات أو الإنزيمات التي تسببها الأكسدة. تخزين البروتينات مهم لأن نصف عمر البروتين يعتمد بشكل عام على درجة حرارة التخزين [4].

تتطلب تنقية البروتين مقايسة محددة. يجب أن تكون طريقة الفحص السريعة والسهلة معروفة لتنقية البروتين بحيث يمكن اكتشاف الوزن الجزيئي المعروف ، أو التقارب المحدد ، أو الانجذاب المناعي للبروتين غير الأنزيمي ذي الأهمية باستخدام الطريقة المناسبة [7]. هناك عدة طرق شائعة في تنقية البروتين. وهي كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وترشيح الهلام ، وكروماتوغرافيا التقارب والهلام الكهربائي [4].

2. التاريخ

2.1. استخراج الحمض النووي

تم إجراء أول عزل للحمض النووي من قبل الطبيب السويسري فريدريش ميشر في عام 1869 [8]. كان يأمل في حل المبادئ الأساسية للحياة ، لتحديد التركيب الكيميائي للخلايا. حاول عزل الخلايا من العقد الليمفاوية من أجل تجربته ولكن نقاء الخلايا الليمفاوية كان صعبًا ومن المستحيل الحصول عليها بكميات كافية. لذلك ، تحول إلى كريات الدم البيضاء ، حيث حصل عليها من القيح على الضمادات الجراحية التي تم جمعها.

في البداية ، ركز ميشر على الأنواع المختلفة من البروتين التي تتكون منها الكريات البيض وأظهر أن البروتينات هي المكونات الرئيسية للسيتوبلازم في الخلية. خلال اختباراته ، لاحظ أن مادة تترسب من المحلول عند إضافة الحمض وتذويبه مرة أخرى عند إضافة القلويات. كان هذا ، ولأول مرة يحصل على راسب خام من الحمض النووي.

لفصل الحمض النووي عن البروتينات في مستخلصات خليته ، طور ميشر بروتوكولًا جديدًا لفصل نوى الخلايا عن السيتوبلازم ثم عزل الحمض النووي. ومع ذلك ، فشل بروتوكوله الأول في إنتاج ما يكفي من المواد لمواصلة التحليل الإضافي. كان عليه أن يطور بروتوكولًا ثانيًا للحصول على كميات أكبر من النوكلين المنقى ، والذي تم تسميته لاحقًا باسم "الحمض النووي" من قبل تلميذه ريتشارد التمان [8].

2.2. استخراج البروتين

في القرن الثامن عشر ، عرف أنطوان فوركروي وآخرون البروتينات كفئة مميزة من الجزيئات البيولوجية. ميزوا هذا الجزيء من خلال قدرته على التخثر تحت المعالجة بالحرارة أو الحمض. ومع ذلك ، تم إجراء الوصف الأول للبروتين بواسطة الكيميائي الهولندي جيرهاردوس يوهانس مولدر في عام 1893 [9]. أظهرت دراساته حول تركيبة المواد الحيوانية ، وخاصة الفيبرين والألبومين والجيلاتين ، وجود الكربون والهيدروجين والأكسجين والنيتروجين [9]. علاوة على ذلك ، أدرك أن الكبريت والفوسفور كانا موجودين في بعض الأحيان في المواد الحيوانية التي تتكون من عدد كبير من الذرات وأثبت أن هذه "المواد" كانت جزيئات كبيرة [9].

ركزت معظم الدراسات المبكرة على البروتينات التي يمكن تنقيتها بكميات كبيرة. على سبيل المثال ، الدم ، بياض البيض والسموم المختلفة. يصعب تنقية معظم البروتينات بكميات تزيد عن ملليغرام حتى مع طرق اليوم المتقدمة للغاية. تم تطوير غالبية تقنيات تنقية البروتين في مشروع بقيادة إدوين جوزيف كوهن ، عالم البروتين ، خلال الحرب العالمية الثانية. كان مسؤولاً عن تنقية الدم ووضع تقنيات لعزل جزء الزلال من بلازما الدم ، وهو أمر مهم في الحفاظ على الضغط الاسموزي في الأوعية الدموية ، مما يساعد على بقاء الجندي على قيد الحياة [10].

3. الاتجاه الحالي

بعد الحدث المصيري حيث تمكنت ميشر من الحصول على الحمض النووي من الخلية ، اتبعت العديد من الآخرين حذوها مما أدى إلى مزيد من التقدم في بروتوكول عزل وتنقية الحمض النووي. تم تطوير الإجراءات المخبرية الروتينية الأولية لاستخراج الحمض النووي من استراتيجيات الطرد المركزي المتدرج الكثافة. استخدم ميسلسون وستال هذه الطريقة في عام 1958 لإثبات تكرار شبه محافظ للحمض النووي [3]. استفادت الإجراءات اللاحقة من الاختلافات في قابلية ذوبان الحمض النووي الصبغي الكبير والبلازميدات والبروتينات في المخزن القلوي [3].

يوجد حاليًا العديد من الطرق المتخصصة لاستخراج الحمض النووي النقي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين. بشكل عام ، يتم تقسيمها إلى بروتوكولات قائمة على الحلول أو بروتوكولات قائمة على الأعمدة. تم تطوير معظم هذه البروتوكولات إلى مجموعات تجارية تسهل عمليات استخراج الجزيئات الحيوية.

3.1. نوع استخراج الحمض النووي
3.1.1. المنهج التقليدي

استخراج غوانيدينيوم ثيوسيانات - فينول - كلوروفورم
الملح هو الشوائب الشائعة في عينات الحمض النووي. لقد كان مطلوبًا دائمًا إزالته من عينات الحمض النووي قبل إجراء أي عمليات وتحليلات لاحقة. لذلك ، هناك حاجة إلى خطوات فصل و / أو تنقية مفردة أو متعددة لتحلية العينة المشتملة على الحمض النووي [11]. تشمل الخطوات العامة لتنقية الحمض النووي تحلل الخلية ، الذي يعطل البنية الخلوية لإنشاء محلل ، وتعطيل نوكليازات خلوية مثل DNase و RNase ، وفصل الحمض النووي المطلوب عن حطام الخلية [2]. المذيب العضوي - استخلاص الفينول - الكلوروفورم هو أحد الأمثلة ، والذي يستخدم على نطاق واسع في عزل الحمض النووي.
على الرغم من أن الفينول ، حمض الكربوليك القابل للاشتعال والتآكل والسام يمكن أن يفسد البروتينات بسرعة ، إلا أنه لا يثبط نشاط RNAse تمامًا [12]. يمكن حل هذه المشكلة باستخدام مزيج من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1). تتم إزالة البروتينات ، والدهون ، والكربوهيدرات ، وحطام الخلايا من خلال استخلاص الطور المائي مع الخليط العضوي للفينول والكلوروفورم [12 ، 13]. يتكون مستحلب ثنائي الطور عند إضافة الفينول والكلوروفورم. بعد ذلك يتم ترسيخ الطبقة الكارهة للماء من المستحلب على القاع والطبقة المحبة للماء فوقها بواسطة الطرد المركزي [3]. يتم جمع الطور العلوي الذي يحتوي على الحمض النووي ويمكن ترسيب الحمض النووي من المادة الطافية عن طريق إضافة الإيثانول أو الأيزوبروبانول بنسب 2: 1 أو 1: 1 وتركيز عالٍ من الملح [3]. يتم جمع رواسب الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي ، ويتم شطف الملح الزائد بنسبة 70٪ من الإيثانول وطرده مركزيًا للتخلص من المادة الطافية للإيثانول. يتم بعد ذلك إذابة حبيبات الحمض النووي باستخدام محلول TE أو ماء مقطر معقم [3].
تم ذكر استخدام غوانيدينيوم أيزوثيوسيانات في استخراج الحمض النووي الريبي لأول مرة بواسطة Ulrich et al. (1977). كانت الطريقة شاقة. لذلك ، تم إزاحته عن طريق تقنية الخطوة الواحدة ، والتي تُعرف باسم استخراج Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ، بواسطة Chomczynski و Sacchi (1987) [12] ، حيث يتم استخلاص المتجانس مع الفينول / الكلوروفورم عند انخفاض درجة الحموضة. Guanidinium thiocyanate هو عامل Chaotropic يستخدم في تحلل البروتين. مبدأ هذه التقنية أحادية الخطوة هو فصل الحمض النووي الريبي عن الحمض النووي بعد الاستخلاص بمحلول حمضي يتكون من ثيوسيانات الغوانيدينيوم وخلات الصوديوم والفينول والكلوروفورم [13]. في الظروف الحمضية ، سيبقى إجمالي الحمض النووي الريبي في الطور المائي العلوي للخليط بأكمله ، بينما يظل الحمض النووي والبروتينات في الطور البيني أو الطور العضوي السفلي. ثم يتم استعادة إجمالي الحمض النووي الريبي عن طريق الترسيب باستخدام الأيزوبروبانول [12].

طريقة استخراج القلوية
تم استخدام التحلل القلوي لعزل البلازميد DNA و بكتريا قولونية [12]. يعمل بشكل جيد مع جميع سلالات بكتريا قولونية وتتراوح أحجام المزارع البكتيرية من 1 مل إلى أكثر من 500 مل في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). يعتمد مبدأ الطريقة على تمسخ قلوي انتقائي للحمض النووي الصبغي ذو الوزن الجزيئي المرتفع بينما يظل الحمض النووي الدائري المغلق تساهميًا مزدوج الشريطة [14]. البروتينات البكتيرية ، جدران الخلايا المكسورة ، والحمض النووي الكروموسومي المشوه متشابك في مجمعات كبيرة مغطاة بكبريتات دوديسيل. يمكن استعادة DNA البلازميد من المادة الطافية بعد إزالة المادة المشوهة بالطرد المركزي.

طريقة استخراج CTAB
بالنسبة لاستخراج النبات ، فإن الخطوة الأولى التي يجب القيام بها هي طحن العينة بعد تجميدها بالنيتروجين السائل. الغرض من القيام بهذه الخطوة هو تحطيم مادة جدار الخلية للعينة والسماح بالوصول إلى الحمض النووي بينما تظل الإنزيمات الخلوية والمواد الكيميائية الضارة معطلة. بعد طحن العينة ، يمكن إعادة تعليقها في مخزن مؤقت مناسب مثل CTAB.
بروميد سيتيل ترايميثيل الأمونيوم (CTAB) هو منظف غير أيوني يمكنه ترسيب الأحماض النووية والسكريات الحمضية من المحاليل منخفضة القوة الأيونية [15]. وفي الوقت نفسه ، تبقى البروتينات والسكريات المحايدة في محلول في ظل هذه الظروف. في المحاليل ذات القوة الأيونية العالية ، لن يعجل CTAB الأحماض النووية ويشكل مجمعات بالبروتينات. لذلك فإن CTAB مفيد في تنقية الحمض النووي من الكائنات الحية التي تنتج كميات كبيرة من السكريات مثل النباتات وبعض البكتيريا سالبة الجرام [15].
تستخدم هذه الطريقة أيضًا المذيبات العضوية وترسيب الكحول في خطوات لاحقة [12]. تتم إزالة الجسيمات غير القابلة للذوبان من خلال الطرد المركزي لتنقية الحمض النووي. يتم فصل البروتينات القابلة للذوبان والمواد الأخرى من خلال الخلط مع الكلوروفورم والطرد المركزي. يجب ترسيب الحمض النووي بعد ذلك من المادة الطافية وغسلها جيدًا لإزالة الأملاح الملوثة. ثم يعاد تعليق الحمض النووي المنقى وتخزينه في محلول TE أو ماء مقطر معقم.

) التدرج الطرد المركزي
يعتبر الطرد المركزي المتدرج طريقة معقدة ومكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً مقارنة ببروتوكولات التنقية الأخرى. يتطلب ثقافة بكتيرية واسعة النطاق. لذلك ، فهي غير مناسبة للإعداد المصغر للبلازميد DNA [4]. يمكن تركيز الأحماض النووية بالطرد المركزي في

التدرج بعد ترسيب الكحول وإعادة التعليق. الإقحام يغير كثافة السباحة للجزيء في الضرس العالي

سوف تتراكم الجزيئات الدائرية المغلقة تساهميًا عند كثافات منخفضة في التدرج لأنها تتضمن أقل لكل زوج أساسي مقارنة بالجزيئات الخطية. يتم بعد ذلك إزالة المادة الكارهة للماء بمذيبات كارهة للماء بعد الاستخلاص. سيتم إعادة ترسيب الحمض النووي المنقى بالكحول [1].

الحمض النووي الريبي بواسطة Oligp (dT) - كروماتوغرافيا السليلوز
Poly RNA هو قالب لترجمة البروتين وتحمل معظم جزيئات mRNA حقيقية النواة أجزاء منه في نهاياتها الثلاثة [4 ، 15]. يشكل 1 إلى 2 ٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي ويمكن فصله عن طريق كروماتوغرافيا التقارب على السليلوز oligo (dT). تشكل ذيول Poly (A) هجينة RNA-DNA مستقرة مع سلاسل قصيرة من oligo (dT) التي ترتبط بمصفوفات الدعم المختلفة [4 ، 15]. يجب إضافة نسبة عالية من الملح إلى المخزن المؤقت للكروماتوغرافيا لتثبيت أزواج الحمض النووي المزدوجة حيث يتم تشكيل عدد قليل فقط من أزواج قاعدة dT-A. يتم استخدام عازلة منخفضة الملح بعد غسل RNAs nonpolyadenylated من المصفوفة. يساعد هذا المخزن المؤقت على زعزعة استقرار الهياكل المزدوجة الجديلة وإزالة الحمض النووي الريبي المتعدد من الراتنج [15].
هناك طريقتان تستخدمان بشكل شائع في اختيار Poly RNA - كروماتوغرافيا العمود على أعمدة oligo (dT) والكروماتوغرافيا الدفعية. يستخدم كروماتوغرافيا العمود عادة لتنقية الكميات الكبيرة (& gt25

ز) بولي (A) + RNA غير مشع المعزول من خلايا الثدييات. اللوني الدفعي هو الأسلوب المفضل عند العمل بكميات صغيرة (& lt50 جم) من إجمالي الحمض النووي الريبي للثدييات. يمكن استخدامه عند معالجة العديد من عينات الحمض النووي الريبي ، سواء كانت مشعة أم لا. يتم إجراء الفصل الكروماتوغرافي الدفعي بدرجة جيدة من السليلوز الأوليجو (dT) في درجات الحرارة المثلى للربط والشطف [15].

3.1.2. استخراج الأحماض النووية ذات المرحلة الصلبة

يمكن العثور على تنقية الحمض النووي في المرحلة الصلبة في معظم مجموعات الاستخراج التجارية المتوفرة في السوق. يسمح بتنقية سريعة وفعالة مقارنة بالطرق التقليدية [16]. يمكن منع العديد من المشكلات المرتبطة باستخراج السائل عن السائل مثل فصل الطور غير المكتمل. سوف يمتص نظام المرحلة الصلبة الحمض النووي في عملية الاستخراج اعتمادًا على درجة الحموضة ومحتوى الملح في المخزن المؤقت. تعتمد عملية الامتصاص على المبادئ التالية: التفاعل المرتبط بالهيدروجين مع مصفوفة محبة للماء تحت ظروف تشوتروبيك ، والتبادل الأيوني في ظل الظروف المائية عن طريق مبادل الأنيون ، وآليات استبعاد التقارب والحجم.

عادة ما يتم إجراء تنقية الطور الصلب باستخدام عمود دوران ، يعمل تحت قوة الطرد المركزي [17]. يمكن لهذه الطريقة تنقية الحمض النووي بسرعة مقارنة بالطرق التقليدية. تعتبر مصفوفات السيليكا ، والجسيمات الزجاجية ، والتراب الدياتومي ، وناقلات تبادل الأنيون من الأمثلة التي تم استخدامها في طريقة استخلاص الطور الصلب كدعم صلب. أربع خطوات رئيسية متضمنة في استخلاص المرحلة الصلبة هي تحلل الخلايا ، وامتصاص الأحماض النووية ، والغسيل ، والشطف [6].

تتمثل الخطوة الأولى في عملية استخراج المرحلة الصلبة في تهيئة العمود لامتصاص العينة. يمكن إجراء تكييف العمود باستخدام عازلة عند درجة حموضة معينة لتحويل السطح أو المجموعات الوظيفية على المادة الصلبة إلى شكل كيميائي معين. [17]. بعد ذلك ، يتم تطبيق العينة التي تدهورت باستخدام المخزن المؤقت للتحلل على العمود. سوف يمتص الحمض النووي المطلوب إلى العمود بمساعدة درجة الحموضة العالية وتركيز الملح لمحلول الربط [17]. قد يكون للمركبات الأخرى ، مثل البروتين ، روابط محددة قوية مع سطح العمود أيضًا. يمكن إزالة هذه الملوثات في خطوة الغسيل باستخدام محلول غسيل يحتوي على عامل منافس [17]. لخطوة الشطف ، يتم إدخال محلول TE أو الماء لتحرير الحمض النووي المطلوب من العمود ، بحيث يمكن جمعه في حالة تنقية [17]. عادةً ما يكون الطرد المركزي السريع أو الترشيح الفراغي أو فصل العمود مطلوبًا أثناء خطوات الغسيل والشطف لعملية التنقية.

تم الكشف عن استخلاص الحمض النووي ذو الطبقة الصلبة المختلطة واستخدامه في عزل الحمض النووي [18]. الأطوار الصلبة ذات الطبقة المختلطة لهذا الاختراع هي مخاليط من طورين صلبين مختلفين على الأقل ، يمكن أن تكون صلبة أو شبه صلبة ، مسامية أو غير مسامية. يمكن أن ترتبط كل مرحلة صلبة بالحمض النووي المستهدف تحت ظروف محلول مختلفة وتحرر الحمض النووي في ظل ظروف شطف مماثلة [18].

مصفوفات السيليكا
أساس معظم المنتجات المتعلقة بتنقية الحمض النووي هو الخصائص الفريدة لمصفوفات السيليكا لربط الحمض النووي الانتقائي. أنواع مواد السيليكا بما في ذلك جزيئات الزجاج ، مثل مسحوق الزجاج وجزيئات السيليكا والألياف الزجاجية الدقيقة المحضرة بطحن أوراق الترشيح المصنوعة من الألياف الزجاجية ، بما في ذلك التراب الدياتومي [19]. تم إدخال مصفوفة السيليكا المائية ، التي تم تحضيرها عن طريق إعادة تدفق ثاني أكسيد السيليكون في هيدروكسيد الصوديوم أو هيدروكسيد البوتاسيوم بنسبة مولارية تبلغ حوالي 2: 1 إلى 10: 1 لمدة 48 ساعة على الأقل ، في تنقية الحمض النووي. يرتبط الحمض النووي بالمصفوفة غير العضوية ويتم إطلاقه في الماء الساخن [20].
يعتمد مبدأ تنقية مصفوفات السيليكا على التقارب العالي للعمود الفقري للحمض النووي المشحون سالبًا تجاه جسيمات السيليكا موجبة الشحنة [21]. يلعب الصوديوم دورًا كجسر الكاتيون الذي يجذب الأكسجين سالب الشحنة في العمود الفقري للفوسفات في الحمض النووي [22]. تكسر كاتيونات الصوديوم الروابط الهيدروجينية بين الهيدروجين في الماء وأيونات الأكسجين سالبة الشحنة في السيليكا تحت ظروف الملح العالية (درجة الحموضة ≤7) [22]. الحمض النووي مرتبط بإحكام ، والغسيل الشامل يزيل كل التلوث. يمكن التخلص من جزيئات الحمض النووي المنقى تحت قوة أيونية منخفضة (pH 7) لاحقًا باستخدام محلول TE أو الماء المقطر [21].
إلى جانب مصفوفات السيليكا ، من المعروف أيضًا أن أغشية النيتروسليلوز والبولي أميد مثل مصفوفات النايلون ترتبط بالأحماض النووية ، ولكن بخصوصية أقل. غالبًا ما تستخدم هذه المواد كمصفوفات نقل وتهجين للحمض النووي في المرحلة الصلبة [23]. تعتبر مصفوفات البولي أميد أكثر متانة من النيتروسليلوز ومن المعروف أنها تربط الأحماض النووية بشكل لا رجعة فيه. يمكن تجميد الأحماض النووية على مصفوفات البولي أميد في عازلة منخفضة القوة الأيونية [23].

جسيمات الزجاج
جزيئات الزجاج والمسحوق والخرز مفيدة لتنقية الحمض النووي. على سبيل المثال ، تضمن عزل الحمض النووي من المواد الهلامية agarose استخدام أملاح Chaotropic لتسهيل ربط الحمض النووي بزجاج السيليكات المشترك وزجاج الصوان وزجاج البورسليكات (مرشح الألياف الزجاجية). يحدث امتزاز الحمض النووي على الركيزة الزجاجية على الأرجح بناءً على الآلية والمبدأ الذي يشبه كروماتوغرافيا الامتزاز [24]. يمكن أيضًا إجراء تنقية الحمض النووي على هلام السيليكا ومزيج الزجاج [19]. اكتشف هذا الاختراع أنه يمكن استخدام خليط من هلام السيليكا وجزيئات الزجاج لفصل الحمض النووي عن المواد الأخرى في وجود محلول أملاح تشوتروبيك.

الأرض دياتومي
يحتوي التراب الدياتومي ، المعروف أيضًا باسم kieselguhr أو diatomite ، على نسبة عالية من السيليكا تصل إلى 94٪ [25]. لقد تم استخدامه للترشيح وفي الفصل اللوني وهو مفيد لتنقية البلازميد والحمض النووي الآخر عن طريق تثبيت الحمض النووي على جزيئاته في وجود عامل شوتروبي. يتم بعد ذلك غسل الحمض النووي الدياتومي الناتج عن الأرض باستخدام محلول عازل يحتوي على الكحول. ثم يتم التخلص من المخزن الذي يحتوي على الكحول ويتم التخلص من الحمض النووي في محلول قليل الملح أو في الماء المقطر [25].

تنقية الحمض النووي على أساس حبة مغناطيسية
الفصل المغناطيسي هو طريقة بسيطة وفعالة تستخدم في تنقية الحمض النووي في الوقت الحاضر.العديد من الحاملات المغناطيسية متاحة الآن تجارياً. يمكن إزالة الجسيمات التي تحتوي على شحنة مغناطيسية باستخدام مغناطيس دائم في تطبيق مجال مغناطيسي. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام ناقلات مغناطيسية مع روابط تقارب ثابتة أو محضرة من البوليمر الحيوي الذي يظهر تقاربًا مع الحمض النووي المستهدف لعملية العزل. على سبيل المثال ، الجسيمات المغناطيسية التي يتم إنتاجها من بوليمرات اصطناعية مختلفة أو بوليمرات حيوية أو زجاج مسامي أو جسيمات مغناطيسية تعتمد على مواد مغناطيسية غير عضوية مثل أكسيد الحديد المعدل على السطح. يفضل استخدام المواد ذات المساحة السطحية الكبيرة في ربط الأحماض النووية. يُفضل أن تكون المواد الجسيمية المغناطيسية مثل الخرز داعمًا في عملية العزل نظرًا لقدرتها الكبيرة على الارتباط. قد يتم مساعدة عملية ربط الحمض النووي عن طريق "التفاف" الحمض النووي حول الدعامة. يمكن وضع مغناطيس على جانب الوعاء الذي يحتوي على خليط العينة لتجميع الجزيئات بالقرب من جدار الوعاء وصب ما تبقى من العينة [26].
يتم استخدام الجسيمات ذات الخصائص المغناطيسية أو البارامغناطيسية في اختراع حيث يتم تغليفها في بوليمر مثل السليلوز الممغنط [27]. في وجود تركيزات معينة من الملح والبولي ألكلين جلايكول ، يمكن أن يرتبط السليلوز الممغنط بالأحماض النووية. يتطلب الحمض النووي الصغير تركيزات ملح أعلى للارتباط القوي بجزيئات السليلوز الممغنطة. لذلك ، يمكن معالجة تركيز الملح بشكل انتقائي لإطلاق الحمض النووي المرتبط بالسليلوز الممغنط على أساس الحجم. سيتم غسل السليلوز الممغنط المرتبط بالحمض النووي باستخدام محلول غسيل مناسب قبل أن يتم ملامسته مع محلول شطف مناسب لفصل الحمض النووي المطلوب مع السليلوز. يمكن فصل السليلوز الممغنط عن المادة الطافية خلال جميع خطوات التنقية عن طريق تطبيق مجال مغناطيسي لسحبها أو سحبها إلى جانب الوعاء [27]. يحتوي السليلوز الممغنط المستخدم في هذا الاختراع على محتوى من أكسيد الحديد يصل إلى حوالي 90٪ بالوزن من إجمالي كتلة السليلوز. يمكن أيضًا استبدال المكون المغناطيسي للسليلوز بمركبات مغناطيسية أخرى مثل أكسيد الحديدوز أو أكسيد النيكل [27].
مجموعة الاستخراج القائمة على مبدأ تنقية الحمض النووي باستخدام حبة مغناطيسية متاحة تجارياً في السوق [28]. الجزء الخاص من هذه المجموعة هو أن الكواشف المتوفرة مخصصة للاستخدام مع الأدوات المغناطيسية. يوصى باستخدام هذه الأداة المغناطيسية في حالة العمل بتنسيق أنبوب دقيق. إنه جهاز عملي لإجراء عمليات الفصل بناءً على تقنية الجسيمات المغناطيسية. لا تتطلب المجموعة أي مذيبات عضوية وتلغي الحاجة إلى الطرد المركزي المتكرر أو الترشيح بالفراغ أو فصل العمود. يعتمد البروتوكول على إجراء تحلل قلوي معدل متبوعًا بربط الحمض النووي بالجسيمات المغناطيسية. تُستخدم الأداة المغناطيسية لالتقاط الجسيمات المغناطيسية بالحمض النووي المرتبط وتتم إزالة الملوثات عن طريق الغسل باستخدام محلول الغسيل المزود. ثم يُستخرج الحمض النووي من الجسيمات المغناطيسية باستخدام محلول الشطف [28].
مجموعة استخراج أخرى لها نفس مبدأ الاستخراج الموصوف أعلاه ، والذي يستخدم تقنية الجسيمات المغناطيسية لتنقية الحمض النووي [29]. فهو يجمع بين سرعة وكفاءة تنقية الحمض النووي القائم على السيليكا والتعامل المريح مع الجسيمات المغناطيسية. يتم استخدام قضيب مغناطيسي محمي بغطاء قضيب لالتقاط الجسيمات المغناطيسية. يدخل إلى وعاء يحتوي على العينات ويجذب الجسيمات المغناطيسية. بعد ذلك ، يتم وضع غطاء القضيب المغناطيسي فوق وعاء آخر ويتم إطلاق الجسيمات المغناطيسية [29].
تنقية الحمض النووي باستخدام حبة الزركونيا هو نوع آخر من التنقية القائمة على الخرزة المغناطيسية. هذه الحبيبات المغنطيسية المجهرية لها سطح ربط كبير متاح ويمكن تشتيتها في المحلول. سمحت هذه الخاصية بربط الحمض النووي وغسله وشطفه. تستخدم مجموعة عزل الحمض النووي الكلي ، التي تستخدم هذه التقنية لتنقية الحمض النووي ، التعطيل الميكانيكي للعينات مع حبيبات الزركونيا في محلول يعتمد على ثيوسيانات الغوانيدينيوم الذي لا يطلق الحمض النووي فحسب ، بل يعطل أيضًا نوكلياز في مصفوفة العينة [ 30]. بعد خطوة التحلل ، يتم تخفيف العينات باستخدام الأيزوبروبانول. تضاف الحبيبات الباراماجينية إلى العينات لغرض ربط الحمض النووي. يتم تجميد خليط الحبيبات والحمض النووي على مغناطيس وغسله لإزالة البروتين والملوثات. تتم إزالة محلول الربط المتبقي بمحلول غسيل ثانٍ وأخيراً يتم التخلص من الحمض النووي في محلول منخفض الملح [30].
تم استخدام تقنية الحبيبات الباراماجينية القابلة للانعكاس في المرحلة الصلبة لنظام تنقية PCR لتقديم DNA عالي الجودة. يتطلب بروتوكول بسيط بدون الطرد المركزي والترشيح. ترتبط أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالجسيمات الباراماجينية التي تسحبها من المحلول ، مما يسمح بشطف الملوثات مثل dNTPs والبادئات والأملاح [31].
حبة القلة المغناطيسية (dT) هي بديل لمصفوفات oligo (dT) الأخرى لتنقية بولي RNA من إجمالي عينة الحمض النووي الريبي [4]. يمكن استخلاص بولي RNA عن طريق إدخال حبات مغناطيسية مطلية بالقليل (dT). الحمض النووي الريبي مع ذيل بولي- A يعلق على القلة (dT). سيتم سحب الخرزات بعد ذلك إلى قاع الأنبوب الذي يزيل الرنا المرسال مباشرةً من إجمالي الحمض النووي الريبي. الحبيبات المغناطيسية التي تمت معالجتها بشكل خاص تقلل من الارتباط غير المحدد للأحماض النووية الأخرى وتضمن نقاء الرنا المرسال [32].

أنيون تبادل المواد
راتنج التبادل الأنيون هو أحد الأمثلة الشائعة التي استخدمت مبدأ تبادل الأنيون [33]. يعتمد على التفاعل بين مجموعات ثنائي إيثيل أمين إيثيل السليلوز موجب الشحنة (DEAE) على سطح الراتنج والفوسفات سالب الشحنة في العمود الفقري للحمض النووي. يتكون راتينج تبادل الأنيون من حبيبات سيليكا محددة ذات حجم مسام كبير وطلاء سطح محب للماء وله كثافة شحنة عالية [34]. تسمح مساحة السطح الكبيرة للراتنج بالاقتران الكثيف لمجموعات DEAE. يعمل الراتينج على نطاق واسع من ظروف الأس الهيدروجيني (الأس الهيدروجيني 6-9) و / أو تركيز الملح (0.1-1.6 م) والتي يمكن أن تحسن فصل الحمض النووي عن الحمض النووي الريبي والشوائب الأخرى [34]. لذلك ، فإن تركيز الملح وظروف الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة هي أحد العوامل الرئيسية التي تحدد ما إذا كان الحمض النووي مرتبطًا أو مزالً من العمود. يمكن أن يرتبط الحمض النووي بمجموعة DEAE على مدى واسع من تركيز الملح. يتم غسل الشوائب مثل البروتين والحمض النووي الريبي من الراتينج باستخدام مخازن متوسطة الملح ، بينما يظل الحمض النووي مرتبطًا حتى يتم التخلص منه بمحلول عازل عالي الملح [34].
تم الكشف عن طريقة استخدام مواد تبادل الأنيون لعزل الحمض النووي في الاختراع [35] ، حيث تم استخدام مواد مبادل الأنيون القوية أو الضعيفة الشحنة الموجبة المتوفرة تجارياً مع محاليل مختارة ذات قوة أيونية معروفة للامتصاص والشطف. يمكن غسل معظم المكونات القابلة للذوبان في الماء مثل البروتين من خلال العمود عن طريق استخدام محلول ذو قوة أيونية معروفة لربط الأحماض النووية بمواد عمود التبادل الأنيوني. يتم إنشاء القوة الأيونية للشطف باستخدام تركيز الملح المعروف ، والذي يتم مزجه مع محلول منظم للتحكم في قوة الأس الهيدروجيني ، والذي يتوافق بشكل مثالي مع أدنى قوة أيونية يتم فيها التخلص من الأحماض النووية تمامًا [35].

3.2 نوع طريقة استخلاص البروتين

الخطوة الأولى في تنقية البروتين هي تحلل الخلايا. من أجل تنقية البروتين وتحليله بكفاءة ، يجب أولاً إطلاقه من الخلية المضيفة في شكل قابل للذوبان. من السهل تعطيل الغشاء البلازمي لخلايا الثدييات المكون من الدهون الفسفورية والبروتينات [36]. بالمقارنة ، يبدو استخراج البروتين من الفطريات والبكتيريا أكثر صعوبة بسبب جدار الخلية المستقر الأقوى من غشاء البلازما.

تحتوي الأنسجة النباتية على مجموعة واسعة من البروتينات التي تختلف في خصائصها. يجب أن تؤخذ بعض العوامل المحددة في الاعتبار عند تطوير بروتوكول استخراج البروتين للنبات [37]. على سبيل المثال ، يجب قص وجود جدار خلية سليلوز صلب من أجل تحرير محتويات الخلية. قد تؤدي المركبات الملوثة المحددة مثل الفينولات ومجموعة من البروتينات إلى تدهور البروتين أو تعديله. لذلك ، هناك حاجة لشروط محددة لاستخراج البروتين وتنقيته من النبات [38].

تُستخدم تقنيات التعطيل الميكانيكي ، مثل الصحافة الفرنسية أو الخرز الزجاجي لإزالة جدار الخلية ، متبوعًا باستخلاص البروتين الكلي باستخدام المنظفات [39].

3.2.1. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني

تفصل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني البروتينات بناءً على شحنتها الأيونية السطحية باستخدام الراتنج الذي يتم تعديله إما بمجموعات كيميائية موجبة الشحنة أو سالبة الشحنة [4 ، 7]. تحتوي معظم البروتينات على شحنة موجبة أو سالبة إجمالية اعتمادًا على نقطة تساوي الكهرباء (pI) عند درجة حموضة معينة ، مما يجعلها ممكنة للتفاعل مع مصفوفة كروماتوغرافية مشحونة معاكسة [7]. إذا كانت الشحنة الصافية للبروتين موجبة عند درجة حموضة أقل من قيمة pI ، سيرتبط البروتين بمبادل كاتيون عند درجة حموضة أعلى من قيمة pI ، فإن صافي شحنة البروتين سالب وسيرتبط البروتين بمبادل الأنيون [38 ].

البروتينات التي تتفاعل بشكل ضعيف مع الراتنجات ، على سبيل المثال بروتين ضعيف موجب الشحنة يمر فوق الراتنج المعدل بمجموعة سالبة الشحنة ، يتم التخلص منها في مخزن مؤقت منخفض الملح. من ناحية أخرى ، تتطلب البروتينات التي تتفاعل بشدة مزيدًا من الملح ليتم التخلص منها. يمكن فصل البروتينات التي لها خصائص شحنة متشابهة جدًا إلى أجزاء مختلفة حيث يتم استخلاصها من العمود عن طريق زيادة تركيز الملح في محلول الشطف [7].

عمود التبادل الأيوني هو أحد التقنيات التي استخدمت مبدأ كروماتوغرافيا التبادل الأيوني [33]. يستخدم تقنية امتصاص الغشاء كمصفوفة كروماتوغرافية لفصل البروتينات. المواد الماصة للأغشية الموجودة في الأعمدة هي مادة سليلوز مستقرة ذات هيكل مسامي للغاية يوفر وصول البروتينات إلى السطح المشحون بسهولة. حدثت التفاعلات بين الجزيئات والمواقع النشطة على الغشاء في الحمل الحراري عبر المسام. لذلك ، فإن الأغشية الممتصة لديها القدرة على الحفاظ على كفاءة عالية عند تنقية الجزيئات الحيوية الكبيرة مع انتشار منخفض [33].

3.2.2. كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي

كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، والتي تسمى أيضًا كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو كروماتوغرافيا الهلام ، تفصل البروتينات وفقًا للأحجام الجزيئية والشكل ولا ترتبط الجزيئات بالوسط الكروماتوغرافي [39]. إنها عملية تمر فيها الجزيئات الكبيرة عبر العمود بشكل أسرع من الجزيئات الصغيرة. يمكن للجزيئات الصغيرة أن تدخل جميع الثقوب الصغيرة للمصفوفة وتصل إلى المزيد من العمود. ستمر البروتينات صغيرة الحجم عبر تلك الثقوب وتستغرق وقتًا أطول لتنفد من العمود مقارنة بالبروتينات كبيرة الحجم التي لا يمكنها الوصول إلى تلك الثقوب ولكنها تنفد مباشرةً من العمود عبر الفراغ في العمود [4 ، 7].

يطبق طقم الكروماتوغرافيا بالترشيح الهلامي مبدأ كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي [40]. يتم تطبيق العينة المستهدفة أعلى العمود الذي يحتوي على خرز مسامي ، مثال على مصفوفة في العمود. تنفصل الجزيئات عندما تمر الجزيئات عبر عمود الخرز المسامي. يمكن تقسيم فصل الجزيئات إلى ثلاثة أنواع رئيسية: الاستبعاد الكلي ، والتغلغل الانتقائي ، وحد التخلل الكلي. الاستبعاد التام هو الجزء الذي لا تستطيع الجزيئات الكبيرة دخول المسام والتخلص منه بسرعة. بالنسبة لمنطقة التخلل الانتقائي ، قد تدخل الجزيئات الوسيطة المسام وقد يكون لها متوسط ​​وقت مكوث في الجسيمات اعتمادًا على حجمها وشكلها. بالنسبة لحد التخلل الكلي ، تتمتع الجزيئات الصغيرة بأطول مدة بقاء بمجرد دخولها المسام في العمود [40]. من مزايا الكروماتوغرافيا المعتمدة على ترشيح الهلام أنها مناسبة للجزيئات الحيوية التي قد تكون حساسة لتغيرات الأس الهيدروجيني وتركيز أيونات المعادن والظروف البيئية القاسية [39].

3.2.3. اللوني تقارب

يعتمد كروماتوغرافيا التقارب على تفاعل محدد بين البروتين والمرحلة الصلبة للتأثير على الانفصال عن الملوثات. وهو يتألف من نفس خطوات كروماتوغرافيا التبادل الأيوني [38]. تمكن من تنقية البروتين على أساس وظيفته البيولوجية أو التركيب الكيميائي الفردي [41]. البروتينات التي لها صلة كبيرة بمجموعات كيميائية معينة مثل الروابط سوف تلتصق تساهميًا وترتبط بمصفوفة العمود بينما تمر البروتينات الأخرى عبر العمود [38]. التفاعلات الكهروستاتيكية أو الكارهة للماء وقوى فان دير فال والرابط الهيدروجينى هي التفاعلات البيولوجية بين الروابط والبروتينات المستهدفة [41]. سيتم التخلص من البروتينات المرتبطة من العمود بواسطة محلول يحتوي على تركيز عالٍ من الشكل القابل للذوبان من الليجند [36].

يُعد الرابط الترابطي المحدد حيويًا والذي يمكن أن يرتبط بمصفوفة كروماتوغرافيا تساهميًا أحد متطلبات تنقية التقارب الناجحة. يجب أن يكون الارتباط بين الليجند وجزيئات البروتين المستهدفة قابلاً للانعكاس للسماح بإزالة البروتينات في شكل نشط [41]. بعد غسل الملوثات ، يجب أن يحتفظ الترابط المقترن بألفة ارتباط محددة للبروتينات المستهدفة. بعض الأمثلة على التفاعلات البيولوجية التي تستخدم عادة في كروماتوغرافيا التقارب مذكورة في الجدول 1 (انظر [41]).

يعتبر الفصل الكروماتوغرافي عن طريق التقارب التفاضلي مع الروابط المثبتة على راتينج مسامي مطرز أمرًا أساسيًا لأبحاث البروتين [42]. تم تقديم مجموعة كاملة تحتوي على أعمدة راتنج متقارب مخرز على أساس مبدأ كروماتوغرافيا التقارب إلى السوق [42]. يمكن استخدام راتينج التقارب في شكل عمود دوران على شكل دفعات أو جهاز طرد مركزي وفقًا لمقياس ونوع التجربة التي سيتم تنفيذها. علاوة على ذلك ، يمكن تعبئتها في نوع من عمود تدفق الجاذبية الأكبر أيضًا [42].

3.2.4. هلام الكهربائي

الرحلان الكهربائي للهلام هو طريقة لفصل البروتين وفقًا لحجمه وخصائص شحنته. يمكن تنقية البروتين المنقى جزئيًا من الفصل الكروماتوجرافي بشكل إضافي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد غير المشبع (PAGE) ، أو الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي [4]. في PAGE ، يتم تحريك البروتينات بواسطة تيار مطبق من خلال مصفوفة هلامية [43]. تعتمد حركة البروتين عبر هذا الهلام على كثافة الشحنة (الشحنة لكل وحدة كتلة) للجزيئات. تهاجر الجزيئات ذات الشحنة عالية الكثافة بسرعة. حجم وشكل البروتين عاملان مهمان آخران يؤثران على تجزئة الصفحة [43]. يلعب حجم مسام الأكريلاميد دورًا كمنخل جزيئي لفصل أحجام مختلفة من البروتينات [4]. كلما زاد حجم البروتين ، كانت تهاجره أبطأ حيث يصبح أكثر تشابكًا في الهلام [43]. الشكل هو أيضًا أحد العوامل لأن البروتينات الكروية المدمجة تتحرك أسرع من البروتينات الليفية الممدودة ذات الكتلة الجزيئية المماثلة [43].

يتم تنفيذ PAGE عادة في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) [44]. عادةً ما يقضي البروتين المعالج بـ SDS على البنية الثانوية والثالثية والرباعية للبروتين [4 ، 7]. تتكشف البروتينات في شكل مشابه للقضيب بسبب التنافر الكهروستاتيكي بين جزيئات SDS المرتبطة. يتناسب عدد جزيئات SDS التي ترتبط بالبروتين تقريبًا مع الكتلة الجزيئية للبروتين (حوالي 1.4 جم بروتين SDS / جم) [43]. كل نوع من أنواع البروتين له كثافة شحنة مكافئة ويتم دفعه من خلال الهلام بنفس القوة [43]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ PAGE تقليل تمسخ البروتينات. لا تزال العديد من البروتينات تحتفظ بأنشطتها البيولوجية بعد تشغيل PAGE [7]. ومع ذلك ، يتم الاحتفاظ بالبروتينات الأكبر بدرجة أكبر من البروتينات الأصغر لأن بولي أكريلاميد شديد الارتباط [43]. وبالتالي ، يتم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE على أساس كتلتها الجزيئية. يمكن استخدام SDS-PAGE لتحديد الكتلة الجزيئية لمزيج البروتينات من خلال مقارنة مواضع العصابات بتلك التي تنتجها بروتينات ذات حجم معروف [43]. يستخدم SDS في الرحلان الكهربائي لحل خليط البروتينات وفقًا لطول سلاسل البولي ببتيد الفردية [7].

تم تطوير تقنية تسمى الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد من قبل باتريك أوفاريل في عام 1975. وهي تستخدم لتجزئة خليط معقدة من البروتينات باستخدام طريقتين مختلفتين - التركيز الكهربي المتساوي و SDS-PAGE [43]. أولاً ، يتم فصل البروتينات وفقًا لنقطة تساوي الكهرباء في هلام أنبوبي. بعد هذا الفصل ، تتم إزالة الجل ووضعه فوق لوح من البولي أكريلاميد المشبع بـ SDS. تنتقل البروتينات إلى هلام اللوح ويتم فصلها وفقًا لكتلتها الجزيئية [43]. يعتبر الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد مناسبًا لاكتشاف التغيرات في البروتينات الموجودة في الخلية في ظل ظروف مختلفة ، أو في مراحل مختلفة من التطور أو دورة الخلية ، أو في الكائنات الحية المختلفة [43].

3.2.5. النشاف الجنوبي الغربي (التجلط المناعي)

النشاف الجنوبي الغربي هو طريقة تُستخدم لعزل وتحديد وتوصيف البروتينات المرتبطة بالحمض النووي من خلال قدرتها على الارتباط بمسبار معين قليل النوكليوتيد [44 ، 45]. يجب عزل العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي في الخلية بشكل فردي وتمييزها لتحديد وظيفة الجين [44]. يتم تضمين ثلاث خطوات في هذه الطريقة. أولاً ، يتم فصل مستخلصات البروتين النووي عن طريق الرحلان الكهربائي SDS-PAGE. بعد ذلك ، يتم نقل البروتينات المنفصلة إلى مرشح نيتروسليلوز ، بولي فينيلدين ديفلورايد (PVDF) أو غشاء نايلون كاتيوني [12]. ثم يتم تحضين المرشح باستخدام مجسات قليلة النوكليوتيد لتحليل البروتينات الممتصة [44 ، 45]. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تكتنفها مشاكل مثل الكميات الكبيرة من البروتينات النووية (عادة 50-100 مجم) ، وتدهور البروتين أثناء العزل ، ومواجهة صعوبات في تحقيق الفصل الكهربي الفعال ونقل نطاق جزيئي واسع من البروتينات [45] .

3.3 استخراج الجزيئات الحيوية الكل في واحد

بشكل عام ، يمكن لتقنيات أو مجموعات الاستخراج أو التنقية المتوفرة في السوق أن تسمح فقط باستخراج نوع واحد من الحمض النووي ، إما DNA أو RNA ، أو بروتين من كائن حي مستهدف. عندما تكون المادة الخلوية محدودة ، فمن المستحسن استخراج DNA و RNA والبروتين من نفس المصدر.

هناك تباين في طريقة العزل ذات الخطوة الواحدة لـ Chomczynski و Sacchi (1987) ، حيث يتم استخلاص متجانسة guanidinium thyicyanate مع الفينول: الكلوروفورم عند درجة حموضة منخفضة ، يسمح بتحضير DNA و RNA والبروتين من الأنسجة أو الخلايا.تتضمن هذه الطريقة تحلل الخلايا بإيزوثيوسيانات الغوانيدين والفينول في محلول أحادي الطور. تتكون المرحلة الثانية بعد إضافة الكلوروفورم حيث يتم استخلاص الحمض النووي والبروتينات ، تاركًا الحمض النووي الريبي في المادة الطافية المائية. يمكن عزل الحمض النووي والبروتينات من المرحلة العضوية عن طريق الترسيب باستخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول والحمض النووي الريبي المترسب من الطور المائي باستخدام الأيزوبروبانول [15].

تم تقديم العديد من مجموعات الاستخراج الكل في واحد في السوق في الوقت الحاضر. على سبيل المثال ، مجموعة الاستخراج القائمة على العمود والتي تم تصميمها لتنقية الحمض النووي الجيني والحمض النووي الريبي الكلي والبروتين الكلي من عينة بيولوجية واحدة في وقت واحد ، دون استخدام المواد السامة مثل الفينول أو الكلوروفورم وترسيب الكحول [46]. إنه متوافق مع كميات صغيرة من مجموعة واسعة من الخلايا المزروعة والأنسجة المحصودة من أصل حيواني وبشري. لا يلزم فصل العينة المستهدفة إلى 3 أجزاء قبل تنقية DNA و RNA والبروتين [46].

تعد مجموعة الاستخراج 3 في 1 القائمة على المحلول والمتوفرة في السوق مثالًا آخر على مجموعة الحلول غير العضوية التي يمكنها استخراج وتنقية الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين ، من كائنات مختلفة بأي أنواع وأحجام [47]. يوفر بروتوكول الخطوات الثلاث البسيطة ، والذي يستغرق حوالي 15 إلى 30 دقيقة ، طريقة سريعة وسهلة لاستخراج الجزيئات الحيوية المختلفة. لذلك ، يمكن توقع عائد أعلى حيث تؤدي خطوات أقل إلى خسارة أقل [47].

3.4. نظام الاستخراج الآلي

ساعد نظام الاستخراج الآلي ، وهو جهاز كبير ومكلف ومعقد مصمم لمعالجة العينات عالية الإنتاجية ، في تبسيط عزل الأحماض النووية [48]. تم تصميم هذا النظام للمختبرات المتوسطة إلى الكبيرة التي نمت في الوجود خلال السنوات الأخيرة [49]. من المحتمل أن تكون أتمتة عملية استخراج الحمض النووي مفيدة لعدد من الأسباب بما في ذلك تقليل وقت العمل ، وخفض تكاليف العمالة ، وزيادة سلامة العمال وفي الوسط توفر فرصة في زيادة إمكانية التكاثر وجودة النتائج [50]. إلى جانب ذلك ، فهو حل رئيسي لزيادة كفاءة المختبر [48].

في المختبرات السريرية ، سيتم استخدام تنقية الجزيئات الحيوية عالية الجودة مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين من مجموعة متنوعة من المواد الأولية في تطبيقات الاختبار النهائية. من الأهمية بمكان الحصول على عينات منقى بجودة ونقاء كافيين [48]. لذلك ، يجب أن تكون عمليات الاستخراج الآلية أكثر اتساقًا وقابلية للتكرار. يجب أن تكون سرعة ودقة وموثوقية عملية الاستخراج بأكملها قصوى وفي نفس الوقت تقلل من مخاطر التلوث المتبادل [49]. يجب تقديم حل لزيادة كفاءة تحضير العينات دون التضحية بالجودة. يجب تقليل احتمالية انتقال التلوث وأن تكون الأنظمة قابلة لتتبع العينات ذات الرموز الشريطية [51].

يلبي نظام الاستخراج المتوفر في السوق المتطلبات المذكورة أعلاه. وهو يوفر لمختبرات الطب الشرعي معالجة سريعة وموثوقة للعينات إلى جانب تنقية آلية عالية الجودة للحمض النووي [52]. إنه نظام معالجة الجسيمات المغناطيسية لمعالجة العينة وتوفير إنتاجية ونقاء متسقين حيث لا يوجد تلوث متبادل يمكن اكتشافه بين العينات. تستغرق عملية الاستخراج بأكملها حوالي 20 دقيقة من البداية إلى النهاية لأنه لا يلزم سوى ثلاث خطوات بسيطة: إضافة عينات سائلة إلى خرطوشة الكاشف ضع خراطيش الكاشف في الماكينة ، اضغط على زر البدء. يتم استخلاص الحمض النووي في المخزن المؤقت في نهاية العملية [52].

تم تقديم مثال آخر للنظام الآلي المرن والفعال لاستخراج الأحماض النووية والبروتينات [53]. يمكن معالجة مواد البدء المختلفة باستخدام هذا النظام ، المصمم لإنتاج العينات الصغيرة والمتوسطة. استخدم جسيمات بارامغناطيسية وظيفية سطحية لامتصاص الحمض النووي المعزول [53]. تسمح مرونة هذا النظام باستخراج الحمض النووي من ما يصل إلى اثني عشر عينة في وقت واحد. تستغرق عملية الاستخراج حوالي 20 إلى 40 دقيقة حسب التطبيق. يمكن للمجموعات التي تم تحسينها لهذا النظام استخراج الحمض النووي الجيني ، والحمض النووي الريبي الخلوي ، والأحماض النووية الفيروسية أو البكتيرية [53].

4. الاتجاه المستقبلي المحتمل

استخلاص الجزيئات الحيوية هو الخطوة الأولى التي يجب إجراؤها من أجل عملية التحليل أو المعالجة التالية. تعد متطلبات معالجة السوائل هي الجانب الأكثر تحديًا. لذلك ، يجب ألا يشتمل أي نظام آلي على معدات أوتوماتيكية لكل خطوة من خطوات الاستخراج فحسب ، بل يجب أن يشتمل أيضًا على معدات لأتمتة نقل السائل بين الآلات. ساعدت الأتمتة في زيادة الإنتاجية وتحسين موثوقية العملية ، ولكن هذه الأنظمة لا تزال مصممة للاستخدام في بيئة معملية فقط. بعض أنظمة استخلاص الحمض النووي المتوفرة في السوق كبيرة وتتطلب مراحل معالجة مسبقة يدويًا بواسطة طاقم عمل في المختبر يتمتع بخبرة فنية [54]. لذلك ، يجب أن تحقق محطات العمل الروبوتية لاستخراج الحمض النووي أتمتة "سريعة" ، مما يعني عملية مؤتمتة بالكامل [49]. يمكن أن يكون الجمع بين محلول وطريقة استخلاص الجزيئات الحيوية الكل في واحد مع نظام الاستخراج المؤتمت بالكامل اختراعًا مستقبليًا. يمكن إجراء تنقية DNA أو RNA أو البروتين من كائنات مختلفة في وقت واحد باستخدام هذا النوع من نظام الاستخراج بطريقة استخراج واحدة فقط.

غالبًا ما يكون من غير الملائم إرسال عينة الجزيئات الحيوية المستهدفة من حيوان أو نبات أو حتى عينة سريرية إلى المختبر لاستخراجها وتحليلها [54]. يجب تبريد العينات ، وخاصة العينة السريرية مثل الدم ، ونقلها إلى أقرب مختبر لاستخراجها وتحليلها. ومن ثم ، فإن نظام استخلاص الجزيئات الحيوية المحمولة ، والذي يجلب العديد من المزايا مثل تقليل العمالة وتقليل النفايات وزيادة سرعة عملية الاستخراج ، يمكن أن يكون تطورًا محتملاً في المستقبل [54]. يمكن الجمع بين نظام الاستخراج المحمول مع DNA أو RNA أو محلل البروتين في المستقبل لمساعدة الباحثين في تقليل وقت العمل وزيادة كفاءة العمل.

سيكون التحسين المستمر في التصغير هو الاتجاه المستقبلي للأتمتة الروبوتية في المختبر [28]. تقوم العديد من المختبرات السريرية بإجراء تحليل لسير العمل وتجد أن الأنظمة الأصغر ذات الإنتاجية المنخفضة أكثر اتساقًا مع عبء العمل في المختبرات السريرية. إلى جانب ذلك ، يمكن تنفيذ نظام الأتمتة هذا بتكلفة منخفضة نسبيًا ، مما يحسن أوقات التسليم ويقلل أيضًا من تكاليف العمالة [55].

5. الخلاصة

منذ أن تم إجراء أول عزل للحمض النووي بنجاح بواسطة فريدريش ميشر في عام 1869 وتم تطوير الاستخراج الأولي للحمض النووي من استراتيجيات الطرد المركزي المتدرجة الكثافة بواسطة ميسيلسون وستال في عام 1958 ، تم تطوير العديد من تقنيات تنقية الجزيئات الحيوية. من استخراج غوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم إلى تقنية العمود المستخدمة على نطاق واسع في استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، وطريقة تنقية الكروماتوجرافيا إلى التكتل المناعي الذي يستخدم لاستخراج البروتينات ، ساعد استخراج الجزيئات الحيوية الباحثين والعلماء في معالجة تحليل البيولوجيا الجزيئية اللاحقة بالترتيب للحصول على فهم أفضل للمواد البيولوجية للأرض.

تم تطوير نظام استخلاص الحمض النووي الآلي نتيجة لتأثير النمو السريع لتكنولوجيا الأتمتة في الوقت الحاضر. من المحتمل أن تكون أتمتة عملية استخراج الحمض النووي مفيدة لعدد من الأسباب بما في ذلك تقليل وقت العمل ، وخفض تكاليف العمالة ، وزيادة سلامة العمال ، وفي نفس الوقت توفر فرصة لزيادة إمكانية التكاثر وجودة النتائج. ومع ذلك ، يجب إجراء تحسين في نقاط الضعف لبعض الأدوات طوال الوقت. في غضون ذلك ، يمكن أن يصبح نظام استخراج الجزيئات الحيوية الكل في واحد ، أو اختراع نظام الاستخراج المصغر والمحمول تطورًا مستقبليًا.

مراجع

  1. إم. وينك ، مقدمة في التكنولوجيا الحيوية الجزيئية: الأساسيات الجزيئية وطرقها وتطبيقها في التكنولوجيا الحيوية الحديثة، Wiley-VCH، Weinheim، ألمانيا، 2006.
  2. K. دويل ، مصدر الاكتشاف: دليل البروتوكولات والتطبيقات، PROMEGA ، ماديسون ، ويس ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 1996.
  3. باكنغهام و إم إل فلوز ، التشخيص الجزيئي: الأساسيات والطرق والتطبيقات السريرية، FA Davis ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2007.
  4. L.J Cseke ، و P.B. Kaufman ، و G. K. Podila ، و C.-J. تساي ، كتيب الطرق الجزيئية والخلوية في علم الأحياء والطب، مطبعة سي آر سي ، بوكا راتون ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الثانية ، 2004.
  5. بروكس ، التكنولوجيا الحيوية في الرعاية الصحية: مقدمة في المستحضرات الصيدلانية الحيوية، مطبعة أدوية ، لندن ، المملكة المتحدة ، 1998.
  6. كوجيما وس. أوزاوا ، "طريقة عزل وتنقية الأحماض النووية ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 2002/0192667 A1 ، ديسمبر 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  7. جيه دي واتسون ، تي إيه بيكر ، إس بي بيل ، إيه جان ، إم ليسين ، آر لوسيك ، البيولوجيا الجزيئية للجين، بنجامين كامينغز ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الخامسة ، 2004.
  8. ر. دهم ، فريدريش ميشر واكتشاف الحمض النووي، إلسفير ، أمستردام ، هولندا ، 2004.
  9. د. ويتفورد ، البروتينات: التركيب والوظيفة، John Wiley & # x26 Sons ، لندن ، المملكة المتحدة ، 2005.
  10. جي تي إدسال ، "إدوين جوزيف كوهن (1892 & # x20131953) ،" في مذكرات السيرة الذاتية، المجلد. 35، pp. 47–83، National Academy of Sciences، Washington، DC، USA، 1961. View at: Google Scholar
  11. S. V. Smarason and A. V. Smith، "Method for desalting nucleic acids،" United Stateحه براءة اختراع US 2003/0186247 A1، deCODE genetics ehf.، October 2003. View at: Google Scholar
  12. سامبروك ود. راسل ، الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل، المجلد. 3 ، مطبعة كولد سبرينغ هاربور ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الثالثة ، 2001.
  13. P. Chomczynski و N. Sacchi ، "الطريقة أحادية الخطوة لعزل الحمض النووي الريبي عن طريق استخراج حمض الغوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم: عشرون عامًا بعد ذلك ،" بروتوكولات الطبيعة، المجلد. 1 ، لا. 2 ، ص 581-585 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  14. H.C.Birnboim and J. Doly ، "إجراء استخراج قلوي سريع لفحص DNA البلازميد المؤتلف ،" بحوث الأحماض النووية، المجلد. 7 ، لا. 6، pp. 1513–1523، 1979. View at: Google Scholar
  15. سامبروك ود. راسل ، الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل، المجلد. 1 ، مطبعة كولد سبرينغ هاربور ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الطبعة الثالثة ، 2001.
  16. K.-H. Esser و W. H. Marx و T. Lisowsky ، "مصفوفة خالية من الحمض النووي: تجديد أعمدة ربط الحمض النووي ،" التقنيات الحيوية، المجلد. 39 ، لا. 2، pp.270–271، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  17. دي تي جيرس ، إل هوانج ، دي هورنبي ، تنقية وتحليل الحمض النووي الريبي (RNA): تحضير العينة ، الاستخراج ، اللوني، Wiley-VCH ، Weinheim ، ألمانيا ، الطبعة الأولى ، 2009.
  18. CE Smith و DL Holmes و DJ Simpson و J. Kayzhendler و RH Bitner و JC Groseh ، "المرحلة الصلبة المختلطة واستخدامها في عزل الأحماض النووية" ، براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 2002/0001812 A1 ، شركة Promega ، يناير 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  19. في. في بادي ، سي يورك ، وأ. بوركيفيز ، "تنقية الحمض النووي على هلام السيليكا ومزيج الزجاج" ، براءة اختراع الولايات المتحدة 5658548 ، شركة Promega ، آب (أغسطس) 1997. عرض على: الباحث العلمي من Google
  20. D. L. Woodard ، A. J. Howard ، and J. A. Down ، "عملية تنقية الحمض النووي على السيليكا المائية ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 5342931 ، بيكتون ، ديكنسون وشركاه ، آب (أغسطس) 1994. عرض على: الباحث العلمي من Google
  21. K.-H. Esser و W. H. Marx و T. Lisowsky ، "MaxXbond: أول نظام تجديد لمصفوفات السيليكا الملزمة للحمض النووي ،" طرق الطبيعة، المجلد. 3 ، لا. 1، pp.1–2، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  22. قسم الأحياء ، كلية ديفيدسون ، "Geneclean & # xAE ،" http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring99/lauren/geneclean.html. عرض على: الباحث العلمي من Google
  23. T. E. Arnold، M. T.Meyering، and R. S. Chesterson، "Nucleic acid bond matrix،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 6869532 B2، CUNO Incorporated ، مارس 2005. عرض على: الباحث العلمي من Google
  24. D.A Dederich ، G. Okwuonu ، T. Garner et al. ، "تنقية حبة الزجاج من الحمض النووي لقالب البلازميد من أجل التسلسل عالي الإنتاجية لجينومات الثدييات ،" بحوث الأحماض النووية، المجلد. 30 ، لا. 7 ، مقالة e32 ، 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  25. إم سي ليتل ، "عملية تنقية الحمض النووي على التراب الدياتومي ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 5075430 ، شركة مختبرات Bio-Rad ، ديسمبر 1991. عرض على: الباحث العلمي من Google
  26. S. Berensmeier ، "الجسيمات المغناطيسية لفصل الأحماض النووية وتنقيتها ،" علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والتكنولوجيا الحيوية، المجلد. 73 ، لا. 3، pp.495–504، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  27. R. D. Nargessi ، "العزل المغناطيسي وتنقية الأحماض النووية" ، براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 6855499 B1 ، Cortex Biochem، Inc. ، فبراير 2005. عرض على: الباحث العلمي من Google
  28. بيو نوبيل أوي ، QuickPick TM DNA البلازميد، بيو نوبيل أوي ، توركو ، فيندلاند ، 2003.
  29. شركة QIAGEN Inc. ، Q Asymphony & # xAE كتيب الحمض النووي، QIAGEN ، ألاميدا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  30. النظم الحيوية التطبيقية ، طقم عزل الحمض النووي الكلي MagMAX TM، أبلايد بيوسيستمز ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  31. بيكمان كولتر ، إنك ، أجينكورت & # xAE امبيور & # xAE النظام: نظام تنقية PCR، بيكمان كولتر ، شاسكا ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2009.
  32. BIOMOL GmbH ، دليل مستخدم ArrayGrade mRNA Purification Kit، BIOMOL GmbH ، هامبورغ ، ألمانيا ، 2004.
  33. شركة Thermo Scientific Inc. بيرس أعمدة تبادل الأيونات القوية، Thermo Scientific، New Hampshire، NH، USA، 2007.
  34. شركة QIAGEN Inc. ، QIAGEN دليل DNA الجينومي، QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2001.
  35. D. B. Selingson and E.J Shrawder ، "طريقة عزل وتنقية الأحماض النووية من العينات البيولوجية ،" براءة اختراع الولايات المتحدة الأمريكية 4935342 ، Syngene Inc. ، يونيو 1990. عرض على: الباحث العلمي من Google
  36. شركة QIAGEN Inc. ، كتيب تحضير بروتين Qproteome TM Mammalian، QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2006.
  37. R.J.Fido و E.N Mills و N.M Rigby و P.R Shewry ، "استخراج البروتين من الأنسجة النباتية ،" طرق في علم الأحياء الجزيئي، المجلد. 244، pp.21–27، 2004. View at: Google Scholar
  38. إس إم ويلرايت ، تنقية البروتين: تصميم وتوسيع نطاق المعالجة النهائية، كارل هانسر ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 1991.
  39. مختبر أبحاث الجينات ، مجموعة عازلة الترشيح الهلامي، مختبر أبحاث الجينات ، تايبيه ، تايوان ، 2007.
  40. بنغالور جيني ، دليل مجموعة أدوات التدريس اللوني لترشيح الجل من GeNei TM، بنغالور جيني ، بنغالور ، الهند ، 2007.
  41. أميرشام للعلوم البيولوجية ، مبادئ وطرق كروماتوغرافيا التقارب، أميرشام للعلوم البيولوجية ، أوبسالا ، السويد ، 2002.
  42. شركة Thermo Scientific Inc. حزمة راتنج تقارب مطرز في أعمدة، Thermo Scientific ، نيو هامبشاير ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  43. كارب ، البيولوجيا الخلوية والجزيئية: المفاهيم والمعدات، John Wiley & # x26 Sons ، لندن ، المملكة المتحدة ، الطبعة الخامسة ، 2008.
  44. B. Bowen ، J. Steinberg ، U.K Laemmli ، و H. Weintraub ، "الكشف عن البروتينات المرتبطة بالحمض النووي عن طريق النشاف البروتين" ، بحوث الأحماض النووية، المجلد. 8 ، لا. 1، pp. 1–20، 1980. View at: Google Scholar
  45. J. S. Handen and H. F. Rosenberg ، "طريقة محسنة للنشاف الجنوبي الغربي ،" Frountiers في العلوم البيولوجية، المجلد. 2، pp.9-11، 1997. View at: Google Scholar
  46. شركة QIAGEN Inc. ، الكل & # xAE كتيب DNA / RNA / Protein Mini، QIAGEN ، فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2007.
  47. "DeRiPRO، DNA، RNA and Proteins Extract Technology،" PCT / MY2008 / 000059 ، http://terra-ju.com/TLS.htm. عرض على: الباحث العلمي من Google
  48. شركة Promega ، TM Personal Automation لتحسين سير العمل في المختبر السريري [كتيب]، بروميغا ، سان لويس أوبيسبو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2008.
  49. J. Loeffler و K. D. Schmidt و H. Hebart و H. Einsele ، "Automated nucleic extraction،" موسوعة علم الجينوم والبروتيوميات، الصفحات 93-96 ، 2004. عرض على: الباحث العلمي من Google
  50. جيه بويد ، "أتمتة المختبرات الروبوتية ،" علم، المجلد. 295 ، لا. 5554 ، ص 517-518 ، 2002. عرض على: الباحث العلمي من Google
  51. واتكينز ، "الاستخراج الآلي للحمض النووي ،" http://www.ngrl.org.uk/Wessex/extraction.htm. عرض على: الباحث العلمي من Google
  52. شركة Promega ، ماكسويل & # xAE 16: الأتمتة الشخصية TM من Promega، بروميغا ، سان لويس أوبيسبو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، 2006.
  53. أناليتيك جينا إيه جي ، نظام استخراج InnuPure C12، Analytik Jena AG، Jena، Germany، 2007.
  54. سادارانجاني ، ب. ماكدونالد ، إيه جي رودريجو ، ودي.سول ، "تحليل الحمض النووي باستخدام أداة روبوتية محمولة ،" dsbmards.pdf. عرض على: الباحث العلمي من Google
  55. أ. Thomsin ، "Insights into lab automation & # x27s future،" IVD Technology، January 2007. View at: Google Scholar

حقوق النشر

حقوق النشر & # xa9 2009 سيون تشي تان وبيو تشين ياب. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.


مراجع

ميليجان ، جيه إف ، جروبي ، د. & amp Uhlenbeck، O.C. تخليق قليل النوكليوتيدات باستخدام T7 RNA polymerase وقوالب DNA الاصطناعية. الدقة الأحماض النووية. 15, 8783–8798 (1987).

Puglisi ، J.D. & amp Wyatt ، J.R. دراسات الكيمياء الحيوية والرنين المغناطيسي النووي لتشكل الحمض النووي الريبي مع التركيز على العقد الكاذبة للحمض النووي الريبي. طرق الانزيم. 261, 323–350 (1995).

Kim، I.، McKenna، SA، Puglisi، E. & amp Puglisi، J.D. تنقية سريعة للـ RNAs باستخدام كروماتوجرافيا سائلة سريعة الأداء (FPLC). RNA 13, 289–294 (2007).

لوكافسكي ، P. RNA 10, 889–893 (2004).

Kim، I.، Lukavsky، P.J. & amp Puglisi، J.D. NMR study of 100 kDa HCV IRES RNA باستخدام وسم النظائر القطعية. جيه. تشيم. شركة 124, 9338–9339 (2002).

Lukavsky ، P.J. ، Kim ، I. ، Otto ، GA & amp Puglisi ، J.D. هيكل HCV IRES domain II الذي يحدده NMR. نات. هيكل. بيول. 10, 1033–1038 (2003).

Lukavsky ، P.J. ، Otto ، GA ، Lancaster ، AM ، Sarnow ، P. & amp Puglisi ، J.D. هياكل لاثنين من مجالات الحمض النووي الريبي الضروري لوظيفة موقع دخول الريبوسوم الداخلي لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي. نات. هيكل. بيول. 7, 1105–1110 (2000).

Egger، D.، Bolten، R.، Rahner، C. & amp Bienz، K. فى الموقع تهجين. هيستوكيم. خلية بيول. 111, 319–324 (1999).

Hanna، M.M.، Yuriev، E.، Zhang، J. & amp Riggs، D.L. فحص بيئة الحمض النووي الريبي الوليدة في الإشريكية القولونية معقدات استطالة النسخ باستخدام نظير ريبونوكليوتيد جديد. الدقة الأحماض النووية. 27, 1369–1376 (1999).

Srivatsan ، S.G. & amp Tor ، Y. فلورسنت بيريميدين ريبونوكليوتيد: التوليف ، التضمين الإنزيمي ، والاستخدام. جيه. تشيم. شركة 129, 2044–2053 (2007).

Gong، P. & amp Martin، CT. آلية عدم الاستقرار في ركوب الدراجات الفاشلة بواسطة T7 RNA polymerase. J. بيول. تشيم. 281, 23533–23544 (2006).

شينبورن ، إي. & amp Mierendorf، R.C. الابن.خاصية نسخ جديدة لبوليميراز SP6 و T7 RNA: الاعتماد على بنية القالب. الدقة الأحماض النووية. 13, 6223–6236 (1985).

وايت ، جي آر ، شاستين ، إم آند بوغليسي ، جي دي توليف وتنقية كميات كبيرة من أليغنوكليوتيدات الحمض النووي الريبي. التقنيات الحيوية 11, 764–769 (1991).

تشيونغ ، إتش كيه ، هوانغ ، إي ، لي ، سي ، تشوي ، بي إس. & amp Cheong، C. التحضير السريع لعينات الحمض النووي الريبي لمطياف الرنين المغناطيسي النووي وتصوير البلورات بالأشعة السينية. الدقة الأحماض النووية. 32، e84 (2004).

كيفت ، ج. & أمبير باتي ، ر. طريقة عامة للتنقية السريعة وغير المشبعة للـ RNAs. RNA 10, 988–995 (2004).

ماكينا ، سا وآخرون. الإطار الجزيئي لنشاط PKR 282, 11474–11486 (2007).

McKenna ، S.A. ، Lindhout ، DA ، Shimoike ، T. ، Aitken ، CE & amp Puglisi ، مثبطات JD Viral dsRNA تمنع الارتباط الذاتي والفسفرة الذاتية لـ PKR. جيه مول. بيول. 372, 103–113 (2007).

McKenna ، S.A. ، Kim ، I. ، Liu ، CW & amp Puglisi ، J.D. فك اقتران ربط RNA وتفعيل PKR كيناز بواسطة RNAs المانع الفيروسي. جيه مول. بيول. 358, 1270–1285 (2006).

Kim ، I. ، Liu ، CW & amp Puglisi ، J.D. الاعتراف المحدد بـ HIV TAR RNA بواسطة مجالات ربط dsRNA (dsRBD1-dsRBD2) من PKR. جيه مول. بيول. 358, 430–442 (2006).

Draper ، D.E. ، White ، S.A & amp Kean ، J.M. إعداد أجزاء معينة من الحمض النووي الريبوزي. طرق الانزيم. 164, 221–237 (1988).

Pleiss ، J.A. ، Derrick ، ​​M.L. & amp Uhlenbeck، O.C. ينتج بوليميراز T7 RNA عدم تجانس خلال 5 نهايات في المختبر النسخ من قوالب معينة. RNA 4, 1313–1317 (1998).

Ferre-D'Amare، A.R. & amp Doudna، J.A. استخدام رابطة الدول المستقلة- و عبر- الريبوزيمات لإزالة 5 ′ و 3 من عدم التجانس من ملليغرام من في المختبر نسخ RNA. الدقة الأحماض النووية. 24, 977–978 (1996).

Price، S.R.، Ito، N.، Oubridge، C.، Avis، J.M. & amp Nagai، K. طرق لتحضير الحمض النووي الريبي على نطاق واسع مناسبة لدراسات علم البلورات. جيه مول. بيول. 249, 398–408 (1995).

Tzakos ، A.G. ، إيستون ، L.E. & أمبير لوكافسكي ، P. نات. بروتوك. 2, 2139–2147 (2007).

Gallo، S.، Furler، M. & amp Sigel، R. في المختبر نسخ وتنقية الحمض النووي الريبي ذات الأحجام المختلفة. شيميا 59, 812–816 (2005).

Walker ، S.C ، Avis ، J.M. & amp Conn ، GL Plasmids لإنتاج الحمض النووي الريبي في المختبر النصوص ذات النهايات المتجانسة. الدقة الأحماض النووية. 31، e82 (2003).

كولينز ، ر. ريبوزيم القمر الصناعي نيوروسبورا فاركود. بيوتشيم. شركة عبر. 30, 1122–1126 (2002).

دافانلو ، P. ، روزنبرغ ، إيه.إتش ، دن ، ج. & amp Studier، FW الاستنساخ والتعبير عن الجين لعاثيات البكتيريا T7 RNA polymerase. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 81, 2035–2039 (1984).

حميس ، ب. & أمبير ؛ ريكوود ، د. (محرران). الرحلان الكهربائي للهلام للبروتينات. مطبعة جامعة أكسفورد ، نيويورك (1981).

Puglisi ، J.D. & amp Tinoco ، I. Jr. منحنيات ذوبان الامتصاص من الحمض النووي الريبي. طرق الانزيم. 180, 304–325 (1989).

Pohl، T. تركيز البروتينات وإزالة المواد المذابة. طرق الانزيم. 182, 68–83 (1990).


4. البروتوكول

4.1 مدة

4.2 تحضير

تنمو البكتيريا وتحفز على التعبير عن بروتين الانصهار MBP وفقًا لنظام التعبير المستخدم (انظر التعبير صغير الحجم عن البروتينات في E. coli). حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتجميد بيليه الخلية في & # x0221280 & # x000b0C (اختياري). أعد تعليق بيليه الخلية في حوالي 10 مل من المخزن المؤقت للربط لكل جرام من الخلايا ، ثم قم بإعادة تعليق الخلايا (على سبيل المثال ، عن طريق الصوتنة أو الصحافة الفرنسية) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 9000 & # x000d7 جم لإزالة حطام الخلية. ضع في اعتبارك أن سعات الربط النموذجية لأعمدة أميلوز agarose هي 3 ملغ من البروتين لكل مليلتر من راتنج العمود.

تحديد معدلات التدفق القصوى والأمثل للعمود و FPLC.

قم بإعداد أنابيب التجميع لحفظ الكسور من الخطوتين 2 & # x020134 لمزيد من التحليل.

انظر الشكل 2 للحصول على مخطط انسيابي للبروتوكول الكامل.

مخطط انسيابي للبروتوكول الكامل ، بما في ذلك الإعداد.


تنقية مجموع الحمض النووي الريبي

تنقية الحمض النووي الريبي الخلوي مطلوب لدراسات التعبير الجيني أو الوظائف الخلوية الأخرى التي ينظمها الحمض النووي الريبي. إجمالي الحمض النووي الريبي هو الحمض النووي الريبي الذي يتم نسخه من الحمض النووي الخلوي (gDNA والحمض النووي للميتوكوندريا ، mtDNA) ويشير عمومًا إلى عينة تحتوي على: RNA الريبوزومي ، الناقل والرسول (rRNA ، tRNA و mRNA) ولا يتضمن microRNA (miRNA) أو أصغر الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNA). إجمالي الحمض النووي الريبي هو جزء الاهتمام المعزول لتحليل التعبير الجيني.

يعتبر عزل الحمض النووي الريبي (RNA) أمرًا صعبًا نظرًا لوجود إنزيمات الريبونوكلياز (RNases) في كل مكان في الخلايا والأنسجة ، والتي تؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي بسرعة. لذلك ، يتم تضمين مثبطات RNase أثناء عملية التنقية. الطريقة الأكثر شيوعًا للتنقية هي استخراج جوانيدينيوم ثيوسياناتيفينول / كلوروفورم. هذا هو المبدأ الكامن وراء TRI Reagent ® ، وهو محلول أحادي الطور يحتوي على الفينول وجوانيدين ثيوسيانات. يتم تجانس عينة الأنسجة أو الخلية أو تعطيلها في كاشف TRI ، ويتم خلط الكلوروفورم بالمحلول ثم يتم فصل الخليط إلى ثلاث مراحل عن طريق الطرد المركزي. تتم إزالة المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي (RNA) ويتم ترسيب الحمض النووي الريبي باستخدام الأيزوبروبانول. مجموعات عزل RNA GenElute القبض على الحمض النووي الريبي على راتنج السيليكا بعد تحلل الخلية. تستخدم مجموعات GenElute ثيوسيانات الجوانيدين و 2-مركابتويثانول لتعطيل RNases عند عزل الحمض النووي الريبي النووي والهيولي الكلي. في وجود ثيوسيانات الغوانيدين ، تذوب البروتينات بسهولة ، وتتفكك الهياكل الخلوية وتنفصل البروتينات النووية عن الأحماض النووية حيث يتم فقد البنية الثانوية للبروتين. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن غوانيدين ثيوسيانات أكثر فعالية من غوانيدين HCL ، يتم تغيير طبيعة RNases بشكل دائم. يتم نسج Lysates من خلال عمود ترشيح لإزالة الحطام الخلوي وقص الحمض النووي. ثم يتم تطبيق المرشح على عمود سيليكا عالي السعة لربط الحمض النووي الريبي الكلي ، متبوعًا بالغسيل والتصفية بماء خالٍ من RNase أو محلول منظم.

من إجمالي عينة الحمض النووي الريبي ، فإن الغالبية هي الرنا الريباسي (

80٪) بينما جزء mRNA هو 2-5٪ فقط. بالنسبة لبعض الإجراءات ، قد يكون من المرغوب فيه تنقية الرنا المرسال من الرنا الريباسي الأكثر وفرة و الرنا المرسال. توفر مجموعات GenElute mRNA إجراءات ملائمة لعزل مرنا متعدد الأدينيلات من الحمض النووي الريبي الكلي المُعد مسبقًا أو مباشرة من خلايا وأنسجة الثدييات. لإعداد mRNA مباشرة ، تتعطل الخلايا أو الأنسجة بهضم SDS / proteinase K لإطلاق الحمض النووي الريبي والقضاء على RNases. Oligo dT30 ثم يتم استخدام مرتبط تساهميًا بـ 1 ميكرومتر من حبات البوليسترين لالتقاط مرنا متعدد الأدينيلات عن طريق التهجين. تظل حبيبات البوليسترين معلقة أثناء التهجين ، مما يلغي الحاجة إلى الخلط أو التأرجح. يتم غسل معقدات مرنا-حبة على مرشح دوران دقيق الطرد المركزي ثم يتم التصفية من مرنا المنقى.

العديد من طرق الاستخراج المستخدمة لتنقية "الحمض النووي الريبي الكلي" تختار جزيئات أكبر على وجه التحديد وبالتالي فهي غير مناسبة لعزل ncRNAs الأصغر ، بما في ذلك miRNAs. هناك مجموعات مصممة خصيصًا لتنقية أجزاء من أنواع الحمض النووي الريبي الأصغر ، والتي يمكن اختيارها عندما تكون هذه هي قالب الاهتمام.

تنقية Micro RNA (miRNA) و RNA غير المشفر (ncRNA)

يعد تنقية ميرنا وجزيئات ncRNA الأصغر الأخرى أكثر صعوبة نظرًا لقصر أطوالها. من المهم تحديد طريقة عزل RNA مناسبة تحتفظ بـ RNA صغير وتجنب استخدام مجموعة تنقية RNA كاملة ما لم تنص الشركة المصنعة على وجه التحديد على أن إجمالي RNA يشتمل على قواعد RNA صغيرة و lt100. طرق الاستخراج لاختلافات الهدف ncRNA بين جزيئات الحمض النووي الريبي وأي عوامل تلوث أخرى ، باستخدام ربط العمود المحدد أو الترسيب. RNAzol ® هو خليط حمض غوانيدين ثيوسيانات-فينول الذي يعطل الخلايا والأنسجة ، مع إضافة الكلوروفورم أو البروموكلوروبروبان ، يفصل جميع أنواع الحمض النووي الريبي عن البروتينات والحمض النووي. تسمح طرق التنقية بعد ذلك بإعداد منفصل لعينات RNA صغيرة أو mRNA أو مجموع عينات RNA بحيث يمكن تحليل كل جزء من هذه الكسور بالتوازي في تطبيقات المصب. مجموعات miRPremier ® microRNA Isolation هي مجموعات تعتمد على السيليكا ، وهي عبارة عن مجموعات ربط وغسل وتصفية ومصممة خصيصًا لاستعادة الحمض النووي الريبي الصغير. تستخدم مجموعة miRPremier طريقة التمليح لإزالة الجزيئات الكبيرة قبل ربط الحمض النووي الريبي الصغير بالعمود ، لأن كمية الإيثانول اللازمة لربط الحمض النووي الريبي الصغير بالسيليكا (ثاني أكسيد السيليكون) ستؤدي أيضًا إلى تعجيل البروتينات والجزيئات الكبيرة الأخرى ، مما ينتج عنه تعليق لزج يمكنه تسد الأعمدة وتمنع الاسترداد الفعال للحمض النووي الريبي. تتمثل الطريقة البديلة للتحايل على هذه المشكلة في استخدام خطوة التخليص المسبق لإزالة الجزيئات الكبيرة ، مثل الاستخراج باستخدام RNAzol أو عمود الربط المسبق ، بحيث يمكن إضافة كمية كافية من الكحول لربط RNA الصغير دون انسداد عمود ربط RNA.


محتويات

شهد تطور تخليق قليل النوكليوتيدات أربع طرق رئيسية لتشكيل الروابط بين النوكليوزيد وتمت مراجعتها في الأدبيات بتفصيل كبير. [2] [3] [4]

تحرير العمل المبكر والتوليف المعاصر H- فوسفونات

في أوائل الخمسينيات من القرن الماضي ، ابتكرت مجموعة ألكسندر تود أساليب H-phosphonate والفوسفات الثلاثية لتخليق قليل النوكليوتيد. [5] [6] تفاعل المركبات 1 و 2 لتشكيل ديستر H- فوسفونات 3 هو اقتران H-phosphonate في محلول بينما المركبات 4 و 5 لكي أعطي 6 هو اقتران phosphotriester (انظر تركيب phosphotriester أدناه).

بعد ثلاثين عامًا ، ألهم هذا العمل ، بشكل مستقل ، مجموعتين بحثيتين لتبني كيمياء H-phosphonate في تخليق المرحلة الصلبة باستخدام النيوكليوزيد H-phosphonate monoesters 7 ككتل بناء وكلوريد pivaloyl ، 2،4،6-triisopropylbenzenesulfonyl chloride (TPS-Cl) ، ومركبات أخرى كمنشطات. [7] [8] أدى التطبيق العملي لطريقة H-phosphonate إلى دورة تركيبية قصيرة جدًا وبسيطة تتكون من خطوتين فقط ، الانحدار والاقتران (المخطط 2). أكسدة روابط دايستر H-phosphonate داخل النواة في 8 إلى روابط phosphodiester في 9 بمحلول اليود في بيريدين مائي يتم تنفيذه في نهاية تجميع السلسلة وليس كخطوة في الدورة التركيبية. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إجراء الأكسدة تحت ظروف اللامائية. [9] أو بدلاً من ذلك ، 8 يمكن تحويلها إلى فوسفوروثيوات 10 [10] [11] [12] [13] أو فسفوروسلينوات 11 (X = Se) ، [14] أو يتأكسد بواسطة CCl4 في وجود الأمينات الأولية أو الثانوية لنظائر الفوسفوراميدات 12. [15] [16] الطريقة مريحة للغاية حيث يمكن إدخال أنواع مختلفة من تعديلات الفوسفات (الفوسفات / الفوسفوروثيوات / الفوسفوراميدات) إلى قليل النوكليوتيد نفسه لتعديل خصائصه. [17] [18] [19]

في أغلب الأحيان ، يتم حماية كتل البناء H-phosphonate في مجموعة 5-hydroxy وفي المجموعة الأمينية للقواعد النووية A و C و G بنفس طريقة كتل بناء الفوسفوراميد (انظر أدناه). ومع ذلك ، فإن الحماية في المجموعة الأمينية ليست إلزامية. [9] [20]

تحرير التوليف Phosphodiester

في الخمسينيات من القرن الماضي ، طور Har Gobind Khorana وزملاؤه طريقة phosphodiester حيث 3’-ا-اسيتيل نوكليوسيد -5'-ا-فوسفات 2 (المخطط 3) تم تنشيطه باستخدام ن,ن ' -ديسيكلوهيكسيل كاربودييميد (DCC) أو 4-تولوين سلفونيل كلوريد (Ts-Cl). تم تفاعل الأنواع المنشطة بـ 5’-ا- النوكليوزيد المحمي 1 لإعطاء أحادي الفوسفات ثنائي النوكليوزيد المحمي 3. [21] عند إزالة 3’-ا- مجموعة الأسيتيل باستخدام التحلل المائي المحفز بالقاعدة ، وتم إجراء المزيد من استطالة السلسلة. باتباع هذه المنهجية ، تم تصنيع مجموعات من ثلاثي ورباعي أوكسي ريبونوكليوتيدات وتم تحويلها إنزيميًا إلى قليل النوكليوتيدات الأطول ، مما سمح بتوضيح الشفرة الجينية. يتمثل القيد الرئيسي لطريقة الفوسفوديستر في تكوين أوليغومرات بيروفوسفات وأوليغنوكليوتيدات المتفرعة في فوسفات النيوكليوسيد. يبدو أن هذه الطريقة هي خطوة إلى الوراء عن الكيمياء الأكثر انتقائية الموصوفة سابقًا ، ومع ذلك ، في ذلك الوقت ، لم يتم تقديم معظم مجموعات حماية الفوسفات المتوفرة الآن. استلزم الافتقار إلى استراتيجية الحماية الملائمة التراجع إلى كيمياء أبطأ وأقل انتقائية لتحقيق الهدف النهائي للدراسة. [2]

تحرير التوليف Phosphotriester

في الستينيات ، طورت المجموعات بقيادة R. Letsinger [22] و C. Reese [23] نهج phosphotriester. كان الاختلاف المحدد عن نهج الفوسفوديستر هو حماية جزء الفوسفات في لبنة البناء 1 (مخطط 4) وفي المنتج 3 مع مجموعة 2-cyanoethyl. هذا حال دون تكوين قليل النوكليوتيدات المتفرعة في الفوسفات داخل النوكليوزيد. سمحت الانتقائية الأعلى للطريقة باستخدام عوامل اقتران ومحفزات أكثر كفاءة ، [24] [25] مما قلل بشكل كبير من طول التخليق. الطريقة ، التي تم تطويرها مبدئيًا لتركيب طور المحلول ، تم تنفيذها أيضًا على البوليسترين "الفشار" منخفض الارتباط ، [26] ولاحقًا على الزجاج المسام المتحكم فيه (CPG ، انظر "مادة الدعم الصلبة" أدناه) ، والتي بدأت جهود بحثية ضخمة في تخليق قليل النوكليوتيدات في المرحلة الصلبة وأدى في النهاية إلى أتمتة تجميع سلسلة قليل النوكليوتيد.

تحرير التوليف ثلاثي الفوسفيت

في السبعينيات من القرن الماضي ، كانت مشتقات P (III) الأكثر تفاعلية من النيوكليوسيدات ، 3'-ا-الكلوروفوسفيت ، بنجاح لتشكيل الروابط بين النوكليوزيدية. [27] أدى ذلك إلى اكتشاف منهجية الفوسفيت الثلاثي. استفادت المجموعة التي يقودها م.كاروثرز من كونها أقل عدوانية وأكثر انتقائية 1ح-تترازوليدوفوسفيت وطريقة تنفيذها على الطور الصلب. [28] وبعد فترة وجيزة ، قام العاملون من نفس المجموعة بتحسين الطريقة بشكل أكبر باستخدام نيوكليوزيد فوسفوراميديت أكثر استقرارًا ككتل بناء. [29] أدى استخدام مجموعة حماية 2-cyanoethyl phosphite [30] بدلاً من مجموعة الميثيل الأقل سهولة في الاستخدام [31] [32] إلى استخدام الفوسفوراميدات النوكليوزيدية المستخدمة حاليًا في تخليق قليل النوكليوتيد (انظر لبنات بناء الفوسفوراميديت أدناه). جعلت العديد من التحسينات اللاحقة على تصنيع اللبنات الأساسية ، ومُصنِّع قليل النوكليوتيد ، والبروتوكولات التركيبية من كيمياء الفوسفوراميديت طريقة اختيار موثوقة للغاية وسريعة لتحضير قليلات النوكليوتيدات الاصطناعية. [1]

اللبنات الأساسية تحرير

تحرير الفوسفوراميديت النيوكليوزيدية

كما ذكرنا سابقًا ، فإن النيوكليوتيدات التي تحدث بشكل طبيعي (نيوكليوسيد -3 أو 5-فوسفات) ونظائرها الفوسفوديستر ليست متفاعلة بشكل كافٍ لتحضير اصطناعي سريع للقليل النوكليوتيدات في غلات عالية. تم تحسين الانتقائية ومعدل تكوين الروابط الداخلية النواة بشكل كبير باستخدام 3'-ا-(ن,ن-ديزوبروبيل فوسفوراميديت) مشتقات نيوكليوسيدات (نيوكليوزيد فوسفوراميديت) التي تعمل بمثابة لبنات بناء في منهجية ثلاثي الفوسفيت. لمنع التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها ، يجب جعل جميع المجموعات الوظيفية الأخرى الموجودة في النيوكليوزيدات غير تفاعلية (محمية) عن طريق ربط مجموعات الحماية. عند الانتهاء من تجميع سلسلة قليل النوكليوتيد ، تتم إزالة جميع مجموعات الحماية لإنتاج قليلات النوكليوتيدات المطلوبة. أدناه ، مجموعات الحماية المستخدمة حاليًا في [33] [34] [35] [36] وكتل البناء الأكثر شيوعًا للنيوكليوزيد الفوسفوراميديت تتم مراجعتها بإيجاز:

  • مجموعة 5'-hydroxyl محمية بواسطة مجموعة DMT (4،4'-dimethoxytrityl) حامضية. و uracil ، القواعد النووية للثيميدين واليوريدين ، على التوالي ، لا تحتوي على مجموعات أمينية خارجية ، وبالتالي لا تتطلب أي حماية.
  • على الرغم من أن القاعدة النووية للغوانوزين و 2'-deoxyguanosine تحتوي على مجموعة أمينية خارجية الحلقة ، إلا أن قاعدتها منخفضة إلى حد أنها لا تتفاعل مع الفوسفوراميدات تحت ظروف تفاعل الاقتران. ومع ذلك ، فإن الفوسفوراميديت المشتق من N2 غير المحمي 5'-ا-DMT-2'-deoxyguanosine قابل للذوبان بشكل ضعيف في الأسيتونيتريل ، المذيب الذي يشيع استخدامه في تخليق قليل النوكليوتيد. [37] في المقابل ، تذوب الإصدارات المحمية من N2 لنفس المركب في بئر الأسيتونيتريل ، وبالتالي فهي مستخدمة على نطاق واسع. تحمل القواعد النووية الأدينين والسيتوزين المجموعات الأمينية غير الحلقية المتفاعلة مع الفوسفوراميدات المنشطة تحت ظروف تفاعل الاقتران. من خلال استخدام خطوات إضافية في الدورة الاصطناعية [38] [39] أو عوامل اقتران بديلة وأنظمة مذيبات ، [37] يمكن تنفيذ تجميع سلسلة قليل النوكليوتيد باستخدام فوسفوراميديت dA و dC مع مجموعات أمينية غير محمية. ومع ذلك ، لا تزال هذه الأساليب حاليا في مرحلة البحث. في التخليق الروتيني قليل النوكليوتيد ، يتم الاحتفاظ بالمجموعات الأمينية الحلقية الخارجية في النيوكليوزيدات بشكل دائم على كامل طول مجموعة سلسلة قليل النوكليوتيد.

يجب أن تكون حماية المجموعات الأمينية الحلقية الخارجية متعامدة مع مجموعة 5'-hydroxy لأن الأخيرة تتم إزالتها في نهاية كل دورة اصطناعية. إن أبسط إستراتيجيات التنفيذ ، وبالتالي الأكثر استخدامًا ، هي تثبيت مجموعة حماية أساسية قابلة للتغير على المجموعات الأمينية الحلقية الخارجية. في أغلب الأحيان ، يتم استخدام مخططين للحماية.

  • في الأول ، يتم استخدام النظام القياسي والأكثر قوة (الشكل) وحماية Bz (benzoyl) من أجل A و dA و C و dC ، بينما يتم حماية G و dG بمجموعة isobutyryl. في الآونة الأخيرة ، يتم استخدام مجموعة Ac (acetyl) لحماية C و dC كما هو موضح في الشكل. [40]
  • في مخطط الحماية الثاني ، يتم حماية A و dA بواسطة isobutyryl [41] أو مجموعات الفينوكسي أسيتيل (PAC). [42] حماية الأسيتيل C و dC ، [40] و G و dG محمية بـ 4-isopropylphenoxyacetyl (أنامجموعة Pr-PAC) [43] أو ثنائي ميثيل فورمامدينو (dmf) [44]. تتم إزالة مجموعات الحماية المعتدلة بسهولة أكبر من مجموعات الحماية القياسية. ومع ذلك ، فإن الفوسفوراميدات التي تحمل هذه المجموعات تكون أقل استقرارًا عند تخزينها في المحلول.
  • مجموعة الفوسفيت محمية بمجموعة 2-cyanoethyl. [30] بمجرد اقتران الفوسفوراميد مع قليل النوكليوتيد المرتبط بالدعم الصلب وتحويل شقوق الفوسفيت إلى الأنواع P (V) ، فإن وجود حماية الفوسفات ليس إلزاميًا لإجراء ناجح لتفاعلات اقتران أخرى. [45]
  • في تخليق الحمض النووي الريبي ، فإن مجموعة 2'-hydroxy محمية بـ TBDMS (ر-butyldimethylsilyl) المجموعة. [46] [47] [48] [49] أو مع TOM (ثلاثي-ايزو-propylsilyloxymethyl) ، [50] [51] كلاهما قابل للإزالة عن طريق المعالجة بأيون الفلورايد.
  • يحمل جزء الفوسفيت أيضًا ثنائي إيزوبروبيل أمين (أناالعلاقات العامة2ن) المجموعة المتفاعلة تحت الظروف الحمضية. عند التنشيط ، تترك مجموعة diisopropylamino لتحل محلها مجموعة 5'-hydroxy من oligonucleotide المرتبط بالدعم (انظر "الخطوة 2: اقتران" أدناه).

تحرير الفوسفوراميديت غير النوكليوزيد

الفوسفوراميديت غير النوكليوزيد عبارة عن كواشف فوسفوراميديت مصممة لإدخال وظائف مختلفة في نهاية قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية أو بين بقايا النوكليوتيدات في منتصف التسلسل. لكي يتم إدخاله داخل التسلسل ، يجب أن يمتلك المعدل غير النووي مجموعتين هيدروكسي على الأقل ، واحدة منهما غالبًا ما تكون محمية بمجموعة DMT بينما تحمل الأخرى مجموعة الفوسفوراميديت التفاعلية.

تُستخدم الفوسفوراميديت غير النوكليوزيدية لإدخال المجموعات المرغوبة غير المتوفرة في النيوكليوسيدات الطبيعية أو التي يمكن إدخالها بسهولة أكبر باستخدام تصميمات كيميائية أبسط. يتم عرض مجموعة قصيرة جدًا من الكواشف التجارية للفوسفوراميديت في المخطط لإثبات التنوع الهيكلي والوظيفي المتاح. تعمل هذه الكواشف على ربط 5'- محطة فوسفات (1) ، [52] نيو هامبشاير2 (2) ، [53] ش (3) ، [54] ألدهيد (4) ، [55] والمجموعات الكربوكسيلية (5) ، [56] سندات CC ثلاثية (6) ، [57] الملصقات والمخمدات غير المشعة (على سبيل المثال 6-FAM أميدايت 7 [58] لربط الفلورسين ودابسيل الأميدت 8، [59] على التوالي) ، المعدلات المحبة للماء والطارئة للماء (على سبيل المثال من خلال hexaethyleneglycol amidite 9 [60] [61] وكولسترول أميدايت 10، [62] على التوالي) ، والبيوتين أميدايت 11. [63]

دورة التوليف تحرير

يتم إجراء تخليق قليل النوكليوتيد عن طريق إضافة تدريجية لبقايا النوكليوتيدات إلى الطرف 5'من سلسلة النمو حتى يتم تجميع التسلسل المطلوب. يشار إلى كل إضافة على أنها دورة تركيب (مخطط 5) وتتكون من أربعة تفاعلات كيميائية:

الخطوة 1: تحرير إلغاء الحظر (ديتريتيليشن)

تتم إزالة مجموعة DMT بمحلول حمض ، مثل 2٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) أو 3٪ حمض ثنائي كلورو أسيتيك (DCA) ، في مذيب خامل (ثنائي كلورو ميثان أو تولوين). يتم غسل الكاتيون البرتقالي اللون الذي يتكون من DMT ، مما يؤدي إلى نتائج الخطوة في سلائف قليل النوكليوتيد المرتبط بالدعم الصلب والذي يحمل مجموعة هيدروكسيل حرة 5'-terminal. تجدر الإشارة إلى أن إجراء عملية إزالة الترسبات لفترة طويلة أو باستخدام محاليل أحماض أقوى من الموصى بها يؤدي إلى تنقية قليل النوكليوتيد المرتبط بالدعم الصلب وبالتالي يقلل من إنتاج المنتج كامل الطول المطلوب.

الخطوة 2: تحرير اقتران

يتم تنشيط محلول 0.02–0.2 مولار من نيوكليوزيد فوسفوراميديت (أو خليط من عدة فوسفوراميديت) في أسيتونيتريل بمحلول 0.2-0.7 مولار من محفز آزول حمضي ، 1ح-تترازول ، 5-إيثيلثيو -1H- تترازول ، [64] 2-بنزيل ثيوتيترازول ، [65] [66] 4،5-ديسيانو إيميدازول ، [67] أو عدد من المركبات المماثلة. يمكن العثور على معلومات أكثر شمولاً حول استخدام عوامل اقتران مختلفة في تخليق قليل النوكليوتيد في مراجعة حديثة. [68] عادة ما يكون الخلط قصيرًا جدًا ويحدث في خطوط سائلة لمُصنِّعات قليلة النوكليوتيد (انظر أدناه) بينما يتم تسليم المكونات إلى المفاعلات التي تحتوي على دعامة صلبة. يتم بعد ذلك إحضار الفوسفوراميديت المنشط في 1.5 - 20 ضعفًا زائدًا على المادة المرتبطة بالدعم مع دعامة البداية الصلبة (اقتران أول) أو سلائف قليل النوكليوتيد المرتبط بالدعم (أدوات التوصيل التالية) التي تتفاعل مجموعتها 5-هيدروكسي مع جزء الفسفوراميديت المنشط للنيوكليوزيد الوارد فوسفوراميديت لتشكيل رابط ثلاثي الفوسفيت. إن اقتران 2'-deoxynucleoside phosphoramidites سريع للغاية ويتطلب ، على نطاق صغير ، حوالي 20 ثانية لإكماله. في المقابل ، إعاقة معقمة 2'-ا- تتطلب فوسفوراميديت الريبونوكليوزيد المحمي 5-15 دقيقة ليُقترن بإنتاجية عالية. [47] [69] [70] [71] يكون التفاعل أيضًا شديد الحساسية لوجود الماء ، خاصة عند استخدام المحاليل المخففة من الفوسفوراميدات ، وعادة ما يتم إجراؤه في الأسيتونتريل اللامائي. بشكل عام ، كلما كان حجم التخليق أكبر ، كلما انخفض الفائض وزاد تركيز الفوسفوراميديت. في المقابل ، يتم تحديد تركيز المنشط بشكل أساسي من خلال قابليته للذوبان في الأسيتونيتريل وبغض النظر عن حجم التوليف. عند الانتهاء من أداة التوصيل ، تتم إزالة أي كواشف ومنتجات ثانوية غير مرتبطة بالغسيل.

الخطوة 3: وضع حد للتحرير

يتم تنفيذ خطوة السد عن طريق معالجة المادة الصلبة المرتبطة بالدعم بمزيج من أنهيدريد الخل و 1-ميثيلميدازول أو ، في كثير من الأحيان ، DMAP كمحفزات ، وفي طريقة الفوسفوراميديت ، يخدم غرضين.

  • بعد الانتهاء من تفاعل الاقتران ، تظل نسبة صغيرة من مجموعات 5'-OH المرتبطة بالدعم الصلب (0.1 إلى 1٪) غير متفاعلة وتحتاج إلى منعها بشكل دائم من استطالة السلسلة الأخرى لمنع تكوين أليغنوكليوتيدات بقاعدة داخلية يشار إلى الحذف عادة باسم (n-1) shortmers. مجموعات 5-هيدروكسي غير المتفاعلة ، إلى حد كبير ، أسيتيل بواسطة خليط السد.
  • تم الإبلاغ أيضًا عن تنشيط الفوسفوراميديت مع 1ح- يتفاعل تيترازول ، إلى حدٍ ما ، مع موضع O 6 في الغوانوزين. [72] عند الأكسدة مع أنا2 / الماء ، هذا المنتج الجانبي ، ربما عن طريق الهجرة O 6 -N7 ، يخضع للتنقية. يتم شق مواقع الأبورين المتكونة على هذا النحو بسهولة في سياق نزع الحماية النهائي للأوليغنوكليوتيد في ظل الظروف الأساسية (انظر أدناه) لإعطاء اثنين من قليل النيوكليوتيدات أقصر مما يقلل من محصول المنتج كامل الطول. تتم إزالة تعديلات O 6 بسرعة عن طريق المعالجة بكاشف السد طالما يتم تنفيذ خطوة السد قبل للأكسدة مع أنا2/ماء.
  • لا ينطوي تخليق فوسفوروثيوات قليل النوكليوتيد (OPS ، انظر أدناه) على الأكسدة مع I2/ الماء ، وعلى التوالي ، لا يعاني من التفاعل الجانبي الموصوف أعلاه. من ناحية أخرى ، إذا تم تنفيذ خطوة السد قبل الكبريت ، فقد تحتوي الدعامة الصلبة على أنهيدريد الخل المتبقي و N-methylimidazole المتبقي بعد خطوة السد. يتداخل خليط السد مع تفاعل نقل الكبريت ، مما يؤدي إلى تكوين واسع النطاق للروابط الداخلية النوكليوزيدية ثلاثية الفوسفات بدلاً من مواد اختبار PS المرغوبة. لذلك ، من أجل تخليق OPS ، من المستحسن إجراء خطوة الكبريت قبل إلى خطوة السد. [73]

الخطوة 4: تحرير الأكسدة

الارتباط الثلاثي الفوسفيت الذي تم تكوينه حديثًا ليس طبيعيًا وذو ثبات محدود في ظل ظروف تخليق قليل النوكليوتيد. تؤدي معالجة المادة المرتبطة بالدعم مع اليود والماء في وجود قاعدة ضعيفة (بيريدين ، أو لوتيدين ، أو كوليدين) إلى أكسدة ثلاثي الفوسفات إلى ثلاثي فوسفات رباعي التنسيق ، وهو مقدمة محمية لوصلة فوسفات دايستر داخلية النوكليوزيد التي تحدث بشكل طبيعي. يمكن إجراء الأكسدة تحت ظروف اللامائية باستخدام ثلاثي بوتيل هيدرو بيروكسيد [74] أو ، بشكل أكثر كفاءة ، (1S) - (+) - (10-camphorsulfonyl) -oxaziridine (CSO). [75] [76] [77] يمكن استبدال خطوة الأكسدة بخطوة كبريت للحصول على فوسفوروثيوات قليل النوكليوتيد (انظر فوسفوروثيوات قليل النوكليوتيد وتخليقها أدناه). في الحالة الأخيرة ، من الأفضل تنفيذ خطوة الكبريت قبل السد.

يدعم تحرير الصلبة

في تخليق الطور الصلب ، يرتبط قليل النوكليوتيد الذي يتم تجميعه تساهميًا ، عبر مجموعة هيدروكسي 3'-terminal الخاصة به ، بمادة دعم صلبة ويظل مرتبطًا بها طوال الدورة الكاملة لتجميع السلسلة. يتم احتواء الدعامة الصلبة في أعمدة تعتمد أبعادها على مقياس التوليف وقد تختلف بين 0.05 مل وعدة لترات. يتم تصنيع الغالبية العظمى من قليل النوكليوتيدات على نطاق صغير يتراوح من 10 نانومول إلى 1 ميكرولتر. في الآونة الأخيرة ، أصبح تخليق قليل النوكليوتيد عالي الإنتاجية حيث يتم احتواء الدعم الصلب في آبار الصفائح متعددة الآبار (في أغلب الأحيان ، 96 أو 384 بئراً لكل لوح) طريقة مفضلة للتوليف المتوازي للقليل النوكليوتيدات على نطاق صغير. [78] في نهاية تجميع السلسلة ، يتم تحرير أليغنوكليوتيد من الدعامة الصلبة ويتم التصفية من العمود أو البئر.

تحرير مواد الدعم الصلبة

على النقيض من تخليق الطور الصلب العضوي وتخليق الببتيد ، فإن تخليق قليل النوكليوتيدات يستمر بشكل أفضل على دعامات صلبة غير قابلة للانتفاخ أو منخفضة الانتفاخ. أكثر المواد الصلبة استخدامًا هما الزجاج المسامي المتحكم به (CPG) والبوليسترين الكبير المسام (MPPS). [79]

  • يتم تعريف CPG بشكل عام من خلال حجم المسام. في كيمياء قليل النوكليوتيدات ، تُستخدم أحجام المسام 500 ، 1000 ، 1500 ، 2000 ، 3000 للسماح بتحضير حوالي 50 ، 80 ، 100 ، 150 ، و 200 مير ، على التوالي. لجعل CPG الأصلي مناسبًا لمزيد من المعالجة ، تتم معالجة سطح المادة بـ (3-aminopropyl) triethoxysilane لإعطاء aminopropyl CPG. قد يتم تمديد ذراع aminopropyl بشكل أكبر لينتج عن سلسلة طويلة aminoalkyl (LCAA) CPG. ثم يتم استخدام المجموعة الأمينية كنقطة تثبيت للروابط المناسبة لتخليق قليل النوكليوتيد (انظر أدناه).
  • MPPS المناسب لتخليق قليل النوكليوتيد عبارة عن بوليسترين منخفض الانتفاخ شديد الارتباط يتم الحصول عليه عن طريق بلمرة ديفينيل بنزين (60٪ على الأقل) والستايرين و 4-كلورو ميثيل ستيرين في وجود عامل بوروجيني. يتم تحويل MPPS الكلوروميثيل الكبير الذي تم الحصول عليه إلى aminomethyl MPPS.

رابط تحرير الكيمياء

لجعل مادة الدعم الصلبة مناسبة لتخليق قليل النوكليوتيد ، يتم ربط روابط غير نيوكليوسيدية أو سكسينات نيوكليوزيد تساهميًا في المجموعات الأمينية التفاعلية في أمينوبروبيل CPG أو LCAA CPG أو أمينوميثيل MPPS. يتم توج المجموعات الأمينية المتبقية غير المتفاعلة مع أنهيدريد الخل. عادة ، يتم استخدام ثلاث مجموعات مختلفة من الناحية المفاهيمية من الدعامات الصلبة.

  • يدعم العالمي. في طريقة أحدث وأكثر ملاءمة وأكثر استخدامًا ، يبدأ التوليف بالدعم العالمي حيث يتم توصيل رابط غير نيوكليوسيدي بمواد الدعم الصلبة (المركبات 1 و 2). يقترن الفوسفوراميديت المرتبط ببقايا النوكليوزيد 3'-terminal بالدعم الصلب الشامل في الدورة الاصطناعية الأولى لتجميع سلسلة قليل النوكليوتيد باستخدام البروتوكولات القياسية. ثم تستمر عملية تجميع السلسلة حتى اكتمالها ، وبعد ذلك يتم نزع حماية قليل النوكليوتيد المرتبط بالدعم الصلب. السمة المميزة للدعامات الصلبة العامة هي أن إطلاق قليل النوكليوتيدات يحدث عن طريق الانقسام المائي لرابطة P-O التي تربط 3’-ا من بقايا النوكليوتيدات 3’- الطرفية للرابط العالمي كما هو موضح في المخطط 6. تتمثل الميزة الحاسمة لهذا النهج في استخدام نفس الدعم الصلب بصرف النظر عن تسلسل قليل النوكليوتيد المراد تصنيعه. للإزالة الكاملة للرابط والفوسفات 3'-terminal من قليل النوكليوتيد المُجمَّع ، الدعامة الصلبة 1 والعديد من المواد الصلبة المماثلة [80] تتطلب أمونيا غازية ، [81] هيدروكسيد أمونيوم مائي ، ميثيل أمين مائي ، [82] أو خليط منها [83] وهي متوفرة تجارياً. [84] [85] الدعم القوي 2[86] يتطلب محلول أمونيا في ميثانول لا مائي وهو متوفر أيضًا تجاريًا. [87] [88]
  • دعامات صلبة نوكليوسيدية. في نهج تاريخي لا يزال شائعًا ، يتم إرفاق مجموعة 3'-hydroxy من بقايا النوكليوزيد 3'- الطرفية بالدعم الصلب عبر 3’-ا-الذراع succinyl كما هو الحال في مجمع 3. يبدأ تجميع سلسلة قليل النوكليوتيد باقتران لبنة بناء فوسفوراميديت خاصة ببقايا النوكليوتيد الثانية من الطرف 3'-. مجموعة هيدروكسي 3-الطرفية في قليل النوكليوتيدات المركبة على دعامات صلبة نيوكليوزيدية محرومة في ظل ظروف أكثر اعتدالًا إلى حد ما من تلك المطبقة على دعامات صلبة عالمية. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن الدعامة الصلبة للنيوكليوزيد يجب أن يتم اختيارها بطريقة محددة التسلسل تقلل من إنتاجية العملية التركيبية بأكملها وتزيد من احتمال حدوث خطأ بشري.
  • دعامات صلبة خاصة تستخدم لربط المجموعات الوظيفية أو المراسلات المرغوبة عند الطرف الثالث لأوليغنوكليوتيدات الاصطناعية. على سبيل المثال ، [89] دعما قويا التجارية 4[90] يسمح بتحضير قليل النوكليوتيدات الذي يحمل رابط 3'-terminal 3-aminopropyl. على غرار الفوسفوراميديت غير النووية ، هناك العديد من الدعامات الصلبة الخاصة الأخرى المصممة لربط المجموعات الوظيفية التفاعلية ، ومجموعات المراسلين غير المشعة ، والمعدلات الطرفية (ه.الكوليسترول أو غيره من الحبال الكارهة للماء) ومناسبة للتطبيقات المختلفة متوفرة تجارياً. يمكن العثور على معلومات أكثر تفصيلاً حول مختلف أنواع الدعامات الصلبة لتخليق قليل النوكليوتيد في مراجعة حديثة. [78]

تحرير فوسفوروثيوات قليل النوكليوتيد وتوليفها

فوسفوروثيوات قليل النوكليوتيد (OPS) عبارة عن أليغنوكليوتيدات معدلة حيث يتم استبدال إحدى ذرات الأكسجين في جزء الفوسفات بالكبريت. يتم استخدام الفوسفوروثيوات فقط التي تحتوي على الكبريت في وضع غير جسر كما هو موضح في الشكل على نطاق واسع ومتاحة تجاريًا. يؤدي استبدال الأكسجين غير الجسور بالكبريت إلى إنشاء مركز جديد من chirality في الفوسفور. في حالة بسيطة من ثنائي النوكليوتيد ، ينتج عن هذا تكوين زوج دياستيريومري من S.ص- و R.ص-دينوكلوزيد أحادي الفوسفوروثيوات التي تظهر هياكلها في الشكل. في ن- أليغنوكليوتيد أصلية حيث كل (ن - 1) الروابط بين النيوكليوسيدية هي روابط فوسفوروثيوات ، عدد دياستيريومرات م يحسب على أنه م = 2 (ن - 1). نظرًا لكونه نظيرًا غير طبيعي للأحماض النووية ، فإن OPS أكثر استقرارًا بشكل كبير تجاه التحلل المائي بواسطة النيوكلييز ، وهي فئة الإنزيمات التي تدمر الأحماض النووية عن طريق كسر رابطة P-O الجسور لشق phosphodiester. تحدد هذه الخاصية استخدام OPS كأوليغنوكليوتيدات مضادة للحساسية في في المختبر و في الجسم الحي التطبيقات التي يكون فيها التعرض المكثف للنوكلياز أمرًا لا مفر منه. وبالمثل ، لتحسين استقرار siRNA ، غالبًا ما يتم إدخال ارتباط فوسفوروثيوات واحد على الأقل عند الطرف 3'- لكل من خيوط المعنى ومضادات المعنى. في OPS النقي chirally ، تكون جميع الدياستيريومرات ثنائية الاتجاه أكثر ثباتًا للتحلل الأنزيمي من نظائرها الكاملة Rp. [91] ومع ذلك ، لا يزال تحضير OPS النقي chirally يمثل تحديًا اصطناعيًا. [13] [92] في الممارسة المختبرية ، يتم استخدام خليط من دياستيريومرات OPS بشكل شائع.

تخليق OPS مشابه جدًا لتركيب قليل النوكليوتيدات الطبيعي. الفرق هو أن خطوة الأكسدة يتم استبدالها بتفاعل نقل الكبريت (الكبريت) وأن خطوة السد يتم تنفيذها بعد الكبريت. من بين العديد من الكواشف التي تم الإبلاغ عنها والقادرة على النقل الفعال للكبريت ، يتوفر ثلاثة فقط تجارياً:

  • 3- (ديميثيلامينوميثيليدين) أمينو -3 H-1،2،4-ديثيازول-3-ثيون ، DDTT (3) يوفر حركية سريعة للكبريت وثباتًا عاليًا في المحلول. [73] [93] [94] الكاشف متاح من عدة مصادر. [95] [96]
  • 3ح-1،2-بنزوديثيول-3-واحد 1،1-ثاني أكسيد (4) [97] [98] المعروف أيضًا باسم كاشف Beaucage يعرض قابلية ذوبان أفضل في الأسيتونيتريل وأوقات تفاعل قصيرة. ومع ذلك ، فإن الكاشف له ثبات محدود في المحلول وأقل كفاءة في كبريت روابط الحمض النووي الريبي. [93] [94] (TETD) قابل للذوبان في الأسيتونتريل ومتوفر تجاريًا. [99] ومع ذلك ، فإن تفاعل الكبريت لوصلة DNA داخل النواة مع TETD يتطلب 15 دقيقة ، [100] وهو أكثر من 10 مرات أبطأ من ذلك مع المركبات 3 و 4.

تحرير الأتمتة

في الماضي ، كان تخليق قليل النوكليوتيد يُجرى يدويًا في محلول أو على طور صلب. تم تنفيذ تركيب الطور الصلب باستخدام أعمدة زجاجية مصغرة تشبه في شكلها أعمدة الكروماتوغرافيا منخفضة الضغط أو المحاقن المجهزة بمرشحات مسامية ، كحاويات للمرحلة الصلبة. [101] في الوقت الحالي ، يتم إجراء تخليق قليل النوكليوتيد في المرحلة الصلبة تلقائيًا باستخدام أدوات يتحكم فيها الكمبيوتر (مُصنِّع قليل النوكليوتيد) ويتم تنفيذه تقنيًا في تنسيقات العمود واللوح متعدد الآبار والمصفوفة. يعتبر تنسيق العمود هو الأنسب للبحث والتطبيقات واسعة النطاق التي لا تتطلب إنتاجية عالية. [102] تم تصميم تنسيق الألواح المتعددة الآبار خصيصًا للتوليف عالي الإنتاجية على نطاق صغير لتلبية الطلب المتزايد في الصناعة والأوساط الأكاديمية على قليلات النوكليوتيدات الاصطناعية. [103] يتوفر عدد من مركبات قليل النوكليوتيد للتخليق على نطاق صغير [104] [105] [106] [107] [108] [109] والتوليف متوسط ​​إلى كبير الحجم [110] متاحًا تجاريًا.

تحرير أول مركب قليل النوكليوتيدات متوفر تجارياً

في مارس 1982 ، استضاف قسم الكيمياء الحيوية ، Technische Hochschule Darmstadt ، ألمانيا ، دورة عملية. م. حضر كاروثرز ، إم جيه جيت ، إتش جي جاسين ، إتش كوستر ، ك إيتاكورا ، سي بير من بين آخرين. تضمن البرنامج عملاً عمليًا ومحاضرات وندوات حول التركيب الكيميائي للطور الصلب لأوليغنوكليوتيدات. حضرت مجموعة مختارة من 15 طالبًا وأتيحت لهم فرصة غير مسبوقة لتلقي التعليمات من قبل أعضاء هيئة التدريس المحترمين.

إلى جانب التدريبات اليدوية ، حضرت الدورة العديد من شركات الأتمتة البارزة. كانت شركة Biosearch of Novato ، CA ، Genetic Design of Watertown ، MA ، شركتين من بين العديد من الشركات التي عرضت أجهزة توليف مؤتمتة في الدورة. قدمت Biosearch مُركِّب SAM I الجديد الخاص بهم. طور التصميم الوراثي جهاز المزج الخاص بهم من تصميم الشركات الشقيقة (Sequemat) جهاز تسلسل الببتيد ذو المرحلة الصلبة. تم ترتيب التصميم الجيني مع الدكتور كريستيان بير (معهد ماكس بلانك للأبحاث الطبية) [1] قبل أسبوع من الحدث لتحويل منظم المرحلة الصلبة الخاص به إلى جهاز المزج شبه الآلي. قام الفريق بقيادة الدكتور أليكس بونر وريك نيفز بتحويل الوحدة ونقلها إلى دارمشتات لحضور الحدث وتثبيتها في مختبر الكيمياء الحيوية في Technische Hochschule. نظرًا لأن النظام كان شبه آلي ، قام المستخدم بحقن القاعدة التالية لإضافتها إلى تسلسل النمو خلال كل دورة. عمل النظام بشكل جيد وأنتج سلسلة من أنابيب الاختبار مملوءة بلون أحمر ثلاثي فاتح مما يشير إلى اقتران كامل في كل خطوة. تم أتمتة هذا النظام لاحقًا بالكامل من خلال تضمين حاقن تلقائي وتم تعيينه على الطراز 25A.

تاريخ تخليق قليل النوكليوتيدات على نطاق متوسط ​​إلى كبير

غالبًا ما تم تطوير مُصنِّعات قليلة النوكليوتيد على نطاق واسع عن طريق زيادة قدرات منصة أجهزة موجودة مسبقًا. ظهرت واحدة من أول أجهزة المزج متوسطة الحجم في أواخر الثمانينيات ، صنعتها شركة Biosearch في نوفاتو ، كاليفورنيا (8800). تم تصميم هذه المنصة في الأصل كمركب ببتيد واستخدمت مفاعل الطبقة المميعة الضروري لاستيعاب خصائص الانتفاخ لدعامات البوليسترين المستخدمة في منهجية ميريفيلد. تضمن تخليق قليل النوكليوتيد استخدام CPG (زجاج مسامي متحكم به) وهو دعامة صلبة وأكثر ملاءمة لمفاعلات العمود كما هو موصوف أعلاه. اقتصر مقياس 8800 على معدل التدفق المطلوب لتسييل الدعم. مكنت بعض تصميمات المفاعلات الجديدة بالإضافة إلى الضغوط الأعلى من المعتاد جهاز 8800 من تحقيق مقاييس من شأنها تحضير 1 مليمول من قليل النوكليوتيد. في منتصف التسعينيات ، طورت العديد من الشركات منصات تعتمد على كروماتوغرافيا سائلة شبه تحضيرية وتحضيرية. كانت هذه الأنظمة مناسبة تمامًا لنهج مفاعل العمود. في معظم الحالات ، كان كل ما هو مطلوب هو زيادة عدد السوائل التي يمكن توصيلها إلى العمود. يتطلب تخليق Oligo 10 كحد أدنى وتستوعب أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة عادة 4. كانت هذه مهمة تصميم سهلة وعملت بعض الاستراتيجيات شبه الأوتوماتيكية دون أي تعديلات على معدات LC الموجودة مسبقًا.كانت كل من PerSeptive Biosystems و Pharmacia (GE) شركتين من بين العديد من الشركات التي طورت أجهزة توليف من الكروماتوغرافيا السائلة. كانت شركة Genomic Technologies، Inc. [111] واحدة من الشركات القليلة التي طورت مُركبًا واسع النطاق للقليل النوكليوتيد والذي كان ، من الألف إلى الياء ، مُصنِّع قليل النوكليوتيد. المنصة الأولية التي تسمى VLSS للمركب واسع النطاق جدًا تستخدم أعمدة كروماتوجراف سائل فارماسيا كبيرة كمفاعلات ويمكنها تصنيع ما يصل إلى 75 مليمول من المواد. العديد من مصانع تخليق قليل النوكليوتيد صممت وصنعت منصاتها المخصصة ولا يُعرف إلا القليل نظرًا لأن التصميمات هي ملكية خاصة. استمر تحسين تصميم VLSS واستمر في جهاز المزج QMaster [112] وهو عبارة عن منصة مصغرة توفر كميات من المليغرام إلى الجرام من الأوليغنوكليوتيد الاصطناعي.

تمت مراجعة الممارسات الحالية لتخليق قليل النوكليوتيدات المعدلة كيميائيًا على نطاق واسع مؤخرًا. [113]

توليف المصفوفات الدقيقة قليلة النوكليوتيد تحرير

يمكن للمرء أن يتخيل ميكروأري قليل النوكليوتيد كصفيحة مصغرة متعددة الآبار حيث يتم إزالة الفواصل المادية بين الآبار (الجدران البلاستيكية) عن قصد. فيما يتعلق بالكيمياء ، يختلف تركيب المصفوفات الدقيقة قليلة النوكليوتيد عن تخليق قليل النوكليوتيد التقليدي في ناحيتين:

  • تظل قليل النوكليوتيدات مرتبطة بشكل دائم بالطور الصلب ، الأمر الذي يتطلب استخدام روابط مستقرة في ظل ظروف إجراء نزع الحماية النهائي.
  • عدم وجود فواصل مادية بين المواقع التي يشغلها قليل النوكليوتيدات الفردية ، ومساحة محدودة جدًا على سطح المصفوفة الدقيقة (يحتل تسلسل قليل النوكليوتيد مربع 25 × 25 ميكرومتر) [114] ومتطلبات الدقة العالية لتخليق قليل النوكليوتيدات تملي الاستخدام من تقنيات الموقع الانتقائي 5'- الحرمان. في نهج واحد ، إزالة 5'-ا- تتأثر مجموعة DMT بالتوليد الكهروكيميائي للحمض في الموقع (المواقع) المطلوبة. [115] نهج آخر يستخدم 5'-ا- مجموعة الحماية (α-methyl-6-nitropiperonyloxycarbonyl) (MeNPOC) ، والتي يمكن إزالتها عن طريق التشعيع باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 365 نانومتر. [114]

بعد الانتهاء من تجميع السلسلة ، يتم حماية قليل النوكليوتيد الصلب المرتبط بالدعم بشكل كامل:

  • مجموعة هيدروكسي 5'-terminal 5'-hydroxy محمية بمجموعة DMT
  • تتم حماية شقوق الفوسفات أو شقوق الفوسفوروثيوات ثنائية النواة بمجموعات 2-cyanoethyl
  • المجموعات الأمينية غير الحلقية في جميع القواعد النووية باستثناء T و U محمية بمجموعات حماية الأسيل.

لتزويد قليل النوكليوتيد الوظيفي ، يجب إزالة جميع مجموعات الحماية. قد يتم إزالة حماية قاعدة N-acyl وحماية 2-cyanoethyl phosphate ، وغالبًا ما يتم إزالتها في وقت واحد عن طريق المعالجة بقواعد غير عضوية أو الأمينات. ومع ذلك ، فإن قابلية تطبيق هذه الطريقة محدودة بحقيقة أن انقسام حماية 2-cyanoethyl phosphate يؤدي إلى الأكريلونيتريل كمنتج جانبي. في ظل الظروف الأساسية القوية المطلوبة لإزالة حماية N-acyl ، فإن مادة الأكريلونيتريل قادرة على ألكلة القواعد النووية ، بشكل أساسي ، في الموضع N3 من ثايمين وبقايا اليوراسيل لإعطاء N3- (2-cyanoethyl) التقريب عبر مايكل تفاعل. يمكن تجنب تكوين هذه المنتجات الجانبية عن طريق معالجة أليغنوكليوتيدات مرتبطة بالدعم الصلب مع محاليل القواعد في مذيب عضوي ، على سبيل المثال ، مع 50٪ ثلاثي إيثيل أمين في أسيتونتريل [116] أو 10٪ ثنائي إيثيل أمين في أسيتونيتريل. [117] يوصى بهذا العلاج بشدة للمستحضرات متوسطة وكبيرة الحجم وهو اختياري للتركيبات على نطاق صغير حيث يكون تركيز الأكريلونيتريل المتولد في خليط نزع الحماية منخفضًا.

بصرف النظر عما إذا كانت مجموعات حماية الفوسفات قد تمت إزالتها أولاً ، فإن قليلات النوكليوتيدات المرتبطة بالدعم الصلب يتم إزالتها باستخدام أحد الطريقتين العامتين.


تنقية من الدرجة الصيدلانية قبل miR-29 باستخدام دعامة متجانسة أغماتين

عززت التطبيقات العلاجية القائمة على MicroRNA اهتمامًا متزايدًا بتطوير عمليات تنقية microRNAs من أجل الحصول على المنتج النهائي بدرجة نقاء عالية ونوعية جيدة ونشط بيولوجيًا. ارتبط نقص ما قبل miR-29 أو الإفراط في التعبير بعدد من الأمراض المهمة سريريًا ، ويمكن النظر في تطبيقه العلاجي. ظهرت الأعمدة المتجانسة كفئة جديدة من الدعامات الكروماتوغرافية المستخدمة في منصات تنقية DNA البلازميد ، كونها بديلاً مثيرًا للاهتمام للأعمدة التقليدية القائمة على الجسيمات. وهكذا ، يصف العمل الحالي ، لأول مرة ، طريقة كروماتوغرافيا تقارب جديدة تجمع بين الانتقائية العالية لروابط أغماتين مع تعدد استخدامات الأحاديات لتنقية ما قبل miR-29 بشكل خاص وفعال من أنواع RNA صغيرة أخرى وشوائب Rhodovulum sulfidophilum. تم أيضًا تقييم تأثير معدلات التدفق المختلفة على الفصل قبل miR-29. علاوة على ذلك ، تم تصميم تجارب اختراق لدراسة تأثير تركيزات مختلفة من الحمض النووي الريبي على قدرة ربط الدعم المتجانسة المعدلة ، والتحقق من أن قدرة الارتباط الديناميكي لجزيئات الحمض النووي الريبي تعتمد على تركيز التغذية. من أجل تحقيق كفاءة وانتقائية أعلى ، تم وصف ثلاث استراتيجيات مختلفة للربط والشطف على أساس زيادة كلوريد الصوديوم (1.75-3M) أو الأرجينين (100 ملم) وانخفاض كبريتات الأمونيوم (2.4-0M) للتدرجات المتدرجة لتنقية ما قبل miR-29 . في واقع الأمر ، من خلال استخدام استراتيجيات الشطف باستخدام كلوريد الصوديوم أو أرجينين ، تم الحصول على تحسن في الغلة النهائية لما قبل miR-29 (97.33 و 94.88 ٪ على التوالي) وكذلك نقاء (75.21 و 90.11 ٪ ، على التوالي). علاوة على ذلك ، أظهر تحليل مراقبة الجودة أن مستوى الشوائب (البروتينات ، السموم الداخلية ، الحمض النووي الريبي) في العينة النهائية لما قبل miR-29 كان ضئيلًا. في الواقع ، ظهر هذا الدعم المتجانس الجديد كأداة قوية لتنقية microRNA لاستخدامه في تطبيقات إكلينيكية أخرى ، مما يوفر منصة تنقية أسرع واقتصادية.

الكلمات الدالة: كروماتوغرافيا تقارب Agmatine monolith تنقية MicroRNA صغير الحمض النووي الريبي pre-miR-29.


أسئلة الاختيار من متعدد حول طرق تنقية البروتين

1. لدراسة البروتين بالتفصيل ، عادة ما يتم بذل جهد أولاً:
أ) يقترن البروتين بجزيء معروف.
ب) تحديد تركيبته من الأحماض الأمينية.
ج) تحديد تسلسل الأحماض الأمينية.
د) تحديد وزنها الجزيئي.
هـ) تنقية البروتين.

2. في خليط من البروتينات الخمسة المذكورة أدناه ، أي منها يجب أن يحتل المرتبة الثانية في كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (الترشيح الهلامي)؟

أ) السيتوكروم ج مص = 13,000
ب) الغلوبولين المناعي G مص = 145,000
ج) الريبونوكلياز أ مص = 13,700
د) بوليميراز الحمض النووي الريبي مص = 450,000
هـ) ألبومين المصل مص = 68,500

3 عن طريق إضافة SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم) أثناء الفصل الكهربائي للبروتينات ، من الممكن:
أ) تحديد نقطة تساوي البروتين & # 8217s.
ب) تحديد نشاط إنزيم & # 8217s محدد.
ج) تحديد تكوين الأحماض الأمينية للبروتين.
د) الحفاظ على البنية الأصلية للبروتين والنشاط البيولوجي.
ه) تفصل البروتينات حصريًا على أساس الوزن الجزيئي.


4. لتحديد نقطة تساوي الكهرباء للبروتين ، تأكد أولاً من أن مادة هلامية:
أ) يحتوي على منظف مفسد للطبيعة يمكنه توزيع الشحنات السالبة المنتظمة على سطح البروتين & # 8217s.
ب) يُظهر تدرجًا ثابتًا للأس الهيدروجيني عندما يتم توزيع الأمفولات في مجال كهربائي.
ج) يتم غسلها بجسم مضاد خاص بالبروتين المعني.
د) يحيد جميع المجموعات الأيونية على البروتين بمعايرتها بقواعد قوية.
هـ) يربط البروتين غير المعروف بسلسلة من واسمات البروتين ذات الأوزان الجزيئية المعروفة ، مص.

أ) يتم فصل البروتينات ذات النقاط المتساوية الكهربية المماثلة بشكل أكبر وفقًا لأوزانها الجزيئية.
ب) تصبح العصابات الفردية ملطخة بحيث يمكن تصور نمط التركيز الكهروضوئي.
ج) تصبح العصابات الفردية مرئية من خلال التفاعل مع الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين في الهلام الثاني.
د) تخضع النطاقات الفردية لتركيز كهربي ثاني أكثر كثافة.
هـ) تنفصل البروتينات في النطاقات بشكل كامل لأن التيار الكهربائي الثاني يقع في قطبية معاكسة للتيار الأول.

6. المصطلح محدد نشاط يختلف عن المصطلح نشاط في هذا النشاط المحدد:
أ) يقاس فقط في ظل الظروف المثلى.
ب) هو النشاط (وحدات الإنزيم) في مليغرام من البروتين.
ج) هو نشاط (وحدات إنزيمية) لبروتين معين.
د) يشير فقط إلى البروتين النقي.
هـ) يشير إلى بروتينات أخرى غير الإنزيمات.

7. في التركيز الكهربي ، يعتمد فصل البروتينات على
أ) المحتوى النسبي للمجموعات المشحونة إيجابياً
ب) المحتوى النسبي للمجموعات سالبة الشحنة
ج) كلا من أ و ب
د) الرقم الهيدروجيني
ه) لا شيء من هؤلاء


شاهد الفيديو: علم الأحياء تحت المجهر: ما الحمض النووي والحمض النووي الريبي (شهر نوفمبر 2021).