معلومة

ماذا يفعل NaOH لطلاء العصوية الرقيقة؟


كتاب يسمى الطرق البيولوجية الجزيئية للعصيات دعا للطلاء العصوية الرقيقة خلايا على لوحات LB-agar مع المكونات التالية:

وسيط متعدد الأغراض يحتوي على كل لتر:

باكتو تريبتون 10 جم

خلاصة الخميرة باكتو 5 جم

كلوريد الصوديوم 10 جم

1 م هيدروكسيد الصوديوم 1.0 مل

الأوتوكلاف (151 ب / في ^ 2 ، 30 دقيقة). لألواح أجار LB تتصلب بنسبة 1.5 ٪ (وزن / حجم) أجار ؛ لتراكب LB استخدم 0.7٪ أجار.

المكونات الثلاثة الأولى والكميات المقابلة لها هي نفسها التي أعمل بها عادةً ، لكنني عادةً ما أضيف الماء المقطر لطلاء الإشريكية القولونية بدلاً من هيدروكسيد الصوديوم. وفقًا لإدخال Wikipedia في مرق lysogeny ، يمكن إضافة NaOH لضبط درجة الحموضة في LB. لكن البروتوكول هنا لا يذكر شيئًا من هذا القبيل. في البروتوكولات الأخرى للكتاب ، على الأقل سيقول "التكيف مع الرقم الهيدروجيني - مع 10 M NaOH" أو 1 M NaOH ، وما إلى ذلك ، لذلك إذا لم يكن لضبط الرقم الهيدروجيني لنمو العصوية الرقيقة، ما الغرض الآخر الذي يقوم به NaOH للبكتيريا؟

أيضًا ، عادةً ما أقوم بتعقيم LB أو LB-agar لمدة ساعتين بدلاً من 30 دقيقة. هل سيؤثر التعقيم بالبخار لمدة ساعتين بدلاً من 30 دقيقة على هيدروكسيد الصوديوم؟


أعتقد أن هيدروكسيد الصوديوم يضاف لإحضار الرقم الهيدروجيني حتى لا يصبح حامضيًا جدًا. أشعر أن تعقيم LB أو LB-agar لمدة ساعتين طويل جدًا. أثناء التعقيم ، تتحلل بعض المكونات تدريجياً.


ربط الحمض النووي على الأحماض الدبالية: التأثير على تحول العصوية الرقيقة ومقاومة الدناز

امتزاز التوازن وربط الحمض النووي من العصوية الرقيقة على الأحماض الدبالية (HA) المستخرجة من تربة الغابة ، قدرة الحمض النووي المرتبط على التحول B. الرقيقة، وتم الإبلاغ عن مقاومة الحمض النووي المرتبط للتدهور بواسطة DNase I. كان امتزاز الحمض النووي على HA قصوى بعد 2 و 4 ساعات عند درجة الحموضة 3.0 و 4.0 ، على التوالي. امتزاز كمية ثابتة من الحمض النووي (50 ميكرومترز) عند زيادة تركيزات HA وصلت إلى هضبة مع 2 و 3 ملغ من HA عند درجة الحموضة 3.0 و 4.0 ، على التوالي. لم يلاحظ أي هضبة عند زيادة كميات الحمض النووي حيث يتم امتصاصه على كمية ثابتة من HA (2 مجم). تم ربط 70 إلى 80 ٪ من الحمض النووي الممتص بإحكام بعد غسلين باستخدام 0.1 مولار كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.4) ، أو الماء المقطر المزدوج (درجة الحموضة 5.5) ، أو محلول الحمض النووي (درجة الحموضة 4.0). كان الحمض النووي المرتبط قادرًا على تحويل الخلايا المغذية والخلايا الحساسة للكلورامفينيكول B. الرقيقة، وإن كان بتردد أقل من الحمض النووي الحر. تمت حماية الحمض النووي المرتبط بـ HA من التحلل بواسطة DNase I أكثر من الحمض النووي الحر: كان تركيز DNase المطلوب لمنع التحول بواسطة الحمض النووي المرتبط أعلى بحوالي 100 مرة من ذلك المطلوب لمنع التحول بكميات مماثلة من الحمض النووي الحر.


ماذا يفعل NaOH لطلاء العصوية الرقيقة؟ - مادة الاحياء

يعد تحلل السكر أحد أهم مسارات التمثيل الغذائي في الكائنات غيرية التغذية. تعد العديد من الجينات التي تشفر إنزيمات حال السكر ضرورية في العديد من البكتيريا حتى في ظل الظروف التي لا تتطلب أنشطة تحلل السكر أو نشاط الجلوكوز. في هذه الدراسة ، يتم فحص في الجسم الحي شركاء التفاعل من إنزيمات حال السكر في بكتيريا التربة العصوية الرقيقة تم استخدامه لتوفير سبب منطقي لأهمية الإنزيمات المحللة للجلوكوز. أثبتت إنزيمات حال السكر على اتصال وثيق بالعديد من البروتينات الأخرى ، من بينها نسبة عالية من البروتينات الأساسية. من بين شركاء التفاعل الأساسيين ، كانت إنزيمات حال السكر الأخرى الأكثر بروزًا. أكدت الدراسات ثنائية الهجين تفاعلات فسفوفركتوكيناز مع فسفوغليسيروموتاز وإينولاز. قد يسمح مثل هذا المركب من الإنزيمات المحللة للجليكولتية بتوجيه مباشر للركيزة للوسيطات المحللة للجلوكوز. علاوة على ذلك ، وجدنا ارتباطًا بالإنزيمات المحللة للجلوكوز مع العديد من البروتينات المعروفة أو المشتبه في مشاركتها في معالجة الحمض النووي الريبي وتدهوره. أحد هذه البروتينات ، Rny (YmdA) ، الذي لم يتم توصيفه وظيفيًا حتى الآن ، مطلوب لمعالجة mRNA لمحلل السكر. فجوة أوبرون. أكدت التحليلات ثنائية الهجين التفاعلات بين الإنزيمات المحللة للجلوكوز فسفوفركتوكيناز وإنزيمات الإنزيمات المشاركة في معالجة الحمض النووي الريبي ، RNase J1 ، Rny ، وفوسفوريلاز متعدد النوكليوتيد. علاوة على ذلك ، يتفاعل RNase J1 مع نظيره RNase J2. نقترح أن هذا المركب من معالجة الرنا المرسال والإنزيمات المحللة للجلوكوز هو B. الرقيقة ما يعادل تحلل الحمض النووي الريبي. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن التفاعل الوظيفي بين الإنزيمات المحللة للجلوكوز والبروتينات الأساسية قد يكون السبب في أنها لا غنى عنها.

تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال المنح المقدمة من مؤسسة Deutsche Forschungsgemeinschaft والوزارة الفيدرالية للتعليم وأنظمة بيولوجيا الكائنات الدقيقة (SYSMO) (منح PtJ-BIO / 0313978D و 0313978A) (إلى J. S. و U. V.).


النتائج

رد جيرد الجراثيم للمغذيات.

كما وجد سابقًا مع جراثيم من السلالات مع طفرات نقطة أو إدخال في جيرد، معدلات إنبات الجراثيم مع طفرة حذف في جيرد كانت أقل بكثير من جراثيم النوع البري التي تستخدم إما AGFK أو l -alanine لتحفيز إنبات البوغ (الجدول & # x200B (الجدول 2) 2) (14 ، 18 ، 19 ، 35). معدل إنبات جيرد كانت الأبواغ في وسط LB منخفضة أيضًا (الجدول & # x200B (الجدول 2). 2). الإنبات البطيء لـ & # x00394جيرد تمت ملاحظة الجراثيم التي تحتوي على L -alanine أو AGFK ليس فقط عند مراقبة إنبات البوغ عن طريق قياس OD600 للثقافة ولكن أيضًا عن طريق قياس إطلاق DPA (الشكل & # x200B (الشكل 2). 2). لفحص إنبات البوغ على فترات أطول في وسط LB بالإضافة إلى الألانين ، قمنا بمراقبة إنبات البوغ بواسطة الفحص المجهري الطوري. مرة أخرى ، بينما نبتت جراثيم من النوع البري تمامًا في غضون ساعات قليلة في ظل هذه الظروف ، & # x00394جيرد نبتت الجراثيم بشكل أبطأ (الشكل & # x200 ب (الشكل 3 3).

معدلات إنبات النوع البري و & # x00394جيرد جراثيم. Wild-type (PS832) و & # x00394جيرد (FB62) نبتت جراثيم إما بـ l -alanine أو AGFK ، وتم تقييم الإنبات عن طريق قياس إطلاق DPA كما هو موضح في المواد والطرق. & # x025cb ، جراثيم من النوع البري مع L -alanine & # x025b5 ، جراثيم من النوع البري مع AGFK & # x025b4 ، & # x00394جيرد جراثيم مع L -alanine & # x02022 ، & # x00394جيرد الجراثيم مع AGFK.

معدلات الإنبات من النوع البري و جيرد يتم قياس الأبواغ بالمجهر. Wild-type (PS832) و & # x00394جيرد (FB62) تم رصد جراثيم على شرائح أجار متوسطة LB مع l -alanine و kanamycin ، وتم تقييم إنبات البوغ من خلال فحص & # x0223c100 جراثيم بواسطة الفحص المجهري على النقيض من الطور كما هو موضح في المواد والطرق. & # x025cb ، جراثيم من النوع البري & # x02022 ، & # x00394جيرد جراثيم.

الجدول 2.

إنبات جيرد جراثيم ذات خلفيات وراثية مختلفة أ

الخلفية الجينية (سلالات ب )إنباتمعدل الإنبات (٪ / ساعة)
مع جيردبدون جيرد
النوع البري (PS832 / FB62)علاء110& # x0003c5
النوع البري (PS832 / FB62)AGFK60& # x0003c5
النوع البري (PS832 / FB62)متوسط ​​رطل87& # x0003c5
& # x00394جيرا (PS3609 / PS3926)علاء& # x0003c5& # x0003c5
& # x00394جيرا (PS3609 / PS3926)AGFK616
& # x00394جيرا (PS3609 / PS3926)متوسط ​​رطل& # x0003c12& # x0003c5
& # x00394جيرك & # x00394جرب (FB87 / PS3927)علاء1056
& # x00394جيرك & # x00394جرب (FB87 / PS3927)AGFK6& # x0003c5
& # x00394جيرك & # x00394جرب (FB87 / PS3927)متوسط ​​رطل7312
جرب& # x0002a (FB10 / PS3929)علاء23915
جرب& # x0002a (FB10 / PS3929)AGFK21910
جرب& # x0002a & # x00394جيرا (PS3521 / PS3931)علاء835
جرب& # x0002a & # x00394جيرا (PS3521 / PS3931)AGFK27114
جرب& # x0002a & # x00394جيرا & # x00394جيرك (PS3665 / PS3932)علاء1047
جرب& # x0002a & # x00394جيرا & # x00394جيرك (PS3665 / PS3932)AGFK787
صsspd-غير (PS3476 / PS3940)علاء20023
صsspd-غير (PS3476 / PS3940)AGFK285
صsspd-gerB& # x0002a (PS3946 / PS3947)علاء2476
صsspd-gerB& # x0002a (PS3946 / PS3947)AGFK257& # x0003c5

تشكيل مستعمرة بواسطة & # x00394جيرد جراثيم.

الإنبات البطيء لـ & # x00394جيرد أشارت الأبواغ المذكورة أعلاه إلى أن هذه الجراثيم قد يكون لها كفاءة أقل في تكوين المستعمرة من جراثيم النوع البري. ومع ذلك ، لم يكن هذا هو الحال ، مثل النوع البري و & # x00394جيرد كان للجراثيم المحضرة في العديد من الوسائط المختلفة كفاءات متشابهة جدًا في تكوين المستعمرات ، عندما تم حساب المستعمرات بعد 48 ساعة (الجدول & # x200 ب (الجدول 3). 3). ومع ذلك ، كان من الواضح في هذه التجربة أن المستعمرات من & # x00394جيرد نشأت الجراثيم بشكل أبطأ من الجراثيم البرية. تم تحديد معدل ظهور المستعمرات من الأبواغ التي يتم تنشيطها بالحرارة من خلال عد المستعمرات التي ظهرت في أوقات مختلفة من أعداد متطابقة تقريبًا من الأبواغ ، وكلاهما & # x00394جيرد والنوع البري ، الذي تم نشره على أطباق أجار وحضنت عند 37 & # x000b0C. بينما كان عدد المستعمرات من الجراثيم البرية الحد الأقصى تقريبًا بعد & # x0226416 ساعة من الحضانة ، فإن معدل ظهور المستعمرات من & # x00394جيرد كانت الأبواغ أقل بكثير (الشكل & # x200 ب (الشكل 4) .4). معدلات ظهور المستعمرات من & # x00394جيرد كانت الأبواغ متشابهة سواء تم تطبيق خطوة تنشيط الحرارة أم لا ، وكان هذا هو الحال أيضًا مع جراثيم من النوع البري (البيانات غير معروضة).

معدلات ظهور المستعمرات من النوع البري و & # x00394جيرد جراثيم. مائتان وخمسون إلى 300 جراثيم من السلالات PS832 (النوع البري) أو FB62 (& # x00394جيرد) على صفيحة أجار متوسطة LB بدون مضادات حيوية ، وحضنت الصفائح عند 37 & # x000b0C ، وتم عد المستعمرات بعد أوقات مختلفة من الحضانة. & # x025cb ، جراثيم من النوع البري & # x02022 ، & # x00394جيرد جراثيم.

الجدول 3.

كفاءة تكوين مستعمرة من النوع البري و & # x00394جيرد جراثيم أ

وسط التبخرمتوسط ​​لا. من المستعمرات
النوع البري& # x00394جيرد
2 & # x000d7 SG2.1 & # x000d7 10 8 1.9 & # x000d7 10 8
SMM زائد 0.1٪ أحماض كازامينية1.5 & # x000d7 10 8 1.2 & # x000d7 10 8
RM6 & # x000d7 10 7 6.9 & # x000d7 10 7

إنبات & # x00394جيرد الجراثيم التي تفتقر أو تحتوي على مستويات مرتفعة من مستقبلات المغذيات الجرثومية.

ال جيرد خفضت الطفرة من معدل إنبات المغذيات ليس فقط للجراثيم ذات الخلفية البرية ولكن أيضًا في الجراثيم التي تفتقر إلى مستقبلات المغذيات GerA ، أو كلا من مستقبلات المغذيات GerB و GerK (الجدول & # x200B (الجدول 2). 2). ال جيرد خفضت الطفرة أيضًا من معدل إنبات الجراثيم التي تحمل طفرة نقطية في جرب سيسترون جرب أوبرون ، الذي يطلق عليه gerBB & # x0002a طفره. تولد هذه الطفرة مستقبلًا للمغذيات GerB & # x0002a يعمل حتى في حالة عدم وجود مستقبلات المغذيات GerK لتحفيز إنبات البوغ استجابةً إما لـ L -alanine أو L -asparagine وحده (2 ، 25).

منذ أ جيرد أدت الطفرة إلى انخفاض إنبات البوغ الناجم عن أي من مستقبلات المغذيات في البوغ ، ومن الآليات المحتملة لعمل GerD أن هذا البروتين إما ينظم بشكل إيجابي تكوين مستقبلات المغذيات أو يزيد من وظيفة مستقبلات المغذيات الفردية. إذا كان أي من هذه التفسيرات صحيحًا ، فإن زيادة مستويات مستقبلات المغذيات في الجراثيم قد تكبح تأثيرات جيرد طفره. في العمل السابق ، قمنا ببناء سلالات تحتوي على مستويات أعلى من 10 إلى 20 ضعفًا من مستقبلات GerA أو GerB & # x0002a في الأبواغ عن طريق وضع جيرا و gerB & # x0002a عوامل التشغيل الخاضعة لسيطرة المروج القوي إلى حد ما للأجهزة المحددة مسبقًا لـ sspd الجين (6). على الرغم من أن الإفراط في التعبير عن هذه المستقبلات أدى إلى زيادة معدلات إنبات البوغ بالمغذيات المناسبة ، كما هو موضح سابقًا (6) ، إلا أن هذا لم يقمع آثار جيرد طفرة على إنبات البوغ (الجدول & # x200B (الجدول 2). 2). وبالتالي فمن غير المحتمل أن يعمل GerD عن طريق زيادة وظيفة أو مستوى مستقبلات المغذيات الفردية.

لا تستجيب الأبواغ التي تفتقر إلى مستقبلات المغذيات الوظيفية الثلاثة للمغذيات (26). ومع ذلك ، يطلق على جراثيم هذه السلالات ger3 تظهر الجراثيم معدل إنبات تلقائي منخفض جدًا (0.01 إلى 0.1٪ / يوم) ، ويستمر هذا المعدل المنخفض للإنبات لمدة أسبوع على الأقل (26). وبالتالي كان من المهم دراسة تأثير أ جيرد طفرة في إنبات البوغ العفوي. مشابهة للنتائج التي تم العثور عليها سابقًا (26) ، & # x0223c0.03٪ من جراثيم أ ger3 سلالة (PS3945) نبتت يوميًا عند 37 & # x000b0 درجة مئوية ، بينما تفتقر أيضًا نفس النسبة المئوية (0.06٪) من جراثيم السلالة المتجانسة جيرد (PS3928 ger3 & # x00394جيرد) نبت في اليوم تحت نفس الظروف (البيانات غير معروضة). وهكذا أ جيرد الطفرة لم تبطئ معدل الإنبات التلقائي للجراثيم التي تفتقر إلى جميع مستقبلات المغذيات الوظيفية.

إنبات & # x00394جيرد أعدت الجراثيم في وسائط مختلفة أو تحت ظروف مختلفة.

أشارت الدراسات السابقة إلى أن ظروف التبويض قد تؤثر على قدرة جيرد الجراثيم الطافرة لتنبت ، مثل الأبواغ جيرد تنتج المسوخات النقطية في RM جراثيم تنبت بـ l -alanine بمعدلات أقرب بكثير من تلك الموجودة في الأبواغ البرية (35 ، 37). ومع ذلك ، لاحظنا وجود عيب إنبات حاد في l -alanine مع & # x00394جيرد الأبواغ التي تم تحضيرها في RM (الجدول & # x200B (الجدول 4). 4). كان هذا ينطبق أيضًا على & # x00394جيرد تم تحضير الأبواغ في SMM مع 0.1 ٪ من أحماض Casamino ، وسيط آخر أقل حدًا (الجدول & # x200B (الجدول 4). 4). بينما التجارب الأولية مع الجراثيم المحضرة في RM قياس إنبات البوغ عن طريق مراقبة OD600 من الثقافات (الجدول & # x200B (الجدول 4) ، 4) ، قمنا أيضًا بفحص إنبات المغذيات لهذه الجراثيم على مدى فترة زمنية أطول باستخدام الفحص المجهري الطوري مرة أخرى ، كان هناك إنبات بطيء فقط لـ & # x00394جيرد أعدت الأبواغ في RM (الشكل & # x200B (الشكل 5) 5). بالإضافة إلى التعديلات في وسط التبويض ، قمنا أيضًا بفحص تأثيرات تحضير & # x00394جيرد الأبواغ في السائل 2 & # x000d7 SG المتوسطة أو SMM بالإضافة إلى 0.1٪ من أحماض الكازامينو ، وكذلك على متوسط ​​2 & # x000d7 SG في درجات حرارة من 23 إلى 44 & # x000b0C ، حيث تم العثور على هذه التغييرات لتؤثر على خصائص الجراثيم ، بما في ذلك معدلات البوغ إنبات (17 ، 29). ومع ذلك ، مرة أخرى ، لم تقم هذه التغييرات بإخماد الخلل في إنبات & # x00394جيرد جراثيم مع العناصر الغذائية (البيانات غير معروضة).

معدلات إنبات النوع البري و & # x00394جيرد أعدت الأبواغ في RM. Wild-type (PS832) و & # x00394جيرد (FB62) تم رصد جراثيم محضرة في RM على شرائح أجار مع كاناميسين وإما l -alanine أو AGFK ، وتم تقييم إنبات البوغ من خلال فحص & # x0223c100 جراثيم تحت المجهر على النقيض من الطور كما هو موضح في المواد والطرق. & # x025cb ، جراثيم من النوع البري مع L -alanine & # x025b5 ، جراثيم من النوع البري مع AGFK & # x02022 ، & # x00394جيرد جراثيم مع L -alanine & # x025b4 ، & # x00394جيرد الجراثيم مع AGFK.

الجدول 4.

إنبات & # x00394جيرد والجراثيم البرية التي يتم تحضيرها وإنباتها في وسائط مختلفة أ

إنباتمعدل إنبات البوغ (٪ / ساعة) للسلالة المشار إليها ب في:
2 & # x000d7 SG RM SMM & # x0002b CAA
PS832FB62PS832FB62PS832FB62
متوسط ​​رطل87& # x0003c5اختصار الثاني جاختصار الثانياختصار الثانياختصار الثاني
علاءاختصار الثانياختصار الثاني34& # x0003c5اختصار الثانياختصار الثاني
AGFKاختصار الثانياختصار الثاني56& # x0003c5اختصار الثانياختصار الثاني
SMM زائد علاءاختصار الثانياختصار الثانياختصار الثانياختصار الثاني64& # x0003c5
SMM plus AGFKاختصار الثانياختصار الثانياختصار الثانياختصار الثاني90& # x0003c5

تأثيرات الكاتيونات أحادية التكافؤ ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة على & # x00394جيرد إنبات البوغ.

اقترح أحد النماذج لإنبات البوغ أن الأبواغ تتطلب مجموعة من أيونات K & # x0002b قبل حدوث الإنبات (35). تعمل بالفعل باستخدام الأبواغ ذات الطفرات النقطية في جيرد وجد أن إضافة الكاتيونات أحادية التكافؤ إلى وسط الإنبات يثبط جيرد عيب إنبات الأبواغ الطافرة (35 ، 37). ولكن مع & # x00394جيرد إضافة الأبواغ لكل من KCl أو NaCl أو LiCl أو NH4لم يقم Cl بتركيزات تصل إلى 250 ملي مولار بقمع عيب الإنبات مع أي من L -alanine أو AGFK (البيانات غير معروضة). لقد فحصنا أيضًا ما إذا كانت التغييرات الأخرى في ظروف الإنبات قد تغير متطلبات GerD لإنبات البوغ السريع بالمغذيات. ومع ذلك ، فإن تغيير درجة حموضة الإنبات من 6 إلى 9 أو درجة الحرارة من 23 إلى 44 & # x000b0C لم يقمع عيب إنبات & # x00394جيرد الجراثيم (البيانات غير معروضة). زيادة تركيز l -alanine من 10 إلى 100 ملي مولار لتحديد ما إذا كان & # x00394جيرد قللت الأبواغ من الحساسية للمغذيات أو أزلت طبقات البوغ لتحديد ما إذا كان & # x00394جيرد الجراثيم معيبة في تغلغل العناصر النابتة للمغذيات (3) كما أنها لم تقمع عيب إنبات المغذيات & # x00394جيرد الجراثيم (البيانات غير معروضة). في ظل كل هذه الظروف ، تكون معدلات إنبات & # x00394جيرد بقيت الأبواغ التي تحتوي على الألانين أو AGFK عند & # x0226410٪ من الجراثيم البرية (البيانات غير معروضة).

إنبات & # x00394جيرد الجراثيم التي تحتوي على مواد جرثومية غير مغذية.

في حين أن أ جيرد أدت طفرة الحذف إلى إبطاء إنبات البوغ الناجم عن المغذيات ، وهناك العديد من العوامل غير المغذية التي يمكن أن تؤدي إلى إنبات البوغ ، بما في ذلك المواد الخافضة للتوتر السطحي الموجبة مثل الدوديسيلامين ، والليزوزيم ، والكالسيوم 2 & # x0002b -DPA ، والضغوط العالية (4 ، 5 ، 23 ، 24 ، 26 ، 27 ، 29 ، 30). تؤدي العديد من هذه العوامل (الدوديسيلامين والليزوزيم والكالسيوم 2 & # x0002b -DPA) إلى إنبات الجراثيم بمسارات مختلفة عن تلك الخاصة بإنبات المغذيات. أظهر فحص تأثيرات هذه المجموعة من الجراثيم غير المغذية أن معدلات إنبات الأبواغ باستخدام الدوديسيلامين كما تم قياسها بإطلاق DPA كانت متطابقة تقريبًا لكل من النوع البري و & # x00394جيرد الأبواغ (الشكل & # x200B (الشكل 6 أ) .6 أ). كان هذا أيضًا هو الحال بالنسبة للإنبات في وسط مفرط التوتر باستخدام الليزوزيم (البيانات غير معروضة) وكذلك مع Ca 2 & # x0002b -DPA (الشكل & # x200B (الشكل 6 ب 6 ب).

معدلات إنبات النوع البري و & # x00394جيرد الأبواغ التي تحتوي على (أ) دوديسيلامين أو (ب) Ca 2 & # x0002b -DPA. من النوع البري (PS832) و & # x00394جيرد (FB62) نبتت الأبواغ باستخدام 1 ملي دوديسيلامين (A) أو مع Ca 2 & # x0002b -DPA (B) ، وتم قياس إنبات البوغ إما باتباع إطلاق DPA (إنبات dodecylamine) أو قياس التدفق الخلوي بعد التلوين باستخدام Syto 16 (Ca 2 & # x0002b -DPA إنبات) ، كما هو موضح في المواد والطرق. & # x025cb ، جراثيم من النوع البري & # x02022 ، & # x00394جيرد جراثيم.

أثبت العمل السابق أن الضغوط العالية المختلفة تؤدي إلى إنبات البوغ عبر مسارات مختلفة (4 ، 5 ، 24 ، 36). تحفز الضغوط التي تبلغ حوالي 150 ميجا باسكال الإنبات بشكل أساسي عبر المسار بوساطة مستقبلات المغذيات ، بينما تحفز الضغوط البالغة حوالي 500 ميجا باسكال الإنبات بشكل أساسي عبر آليات مستقلة عن مستقبلات المغذيات. منذ & # x00394جيرد تتباطأ الأبواغ في إنبات مستقبلات المغذيات بوساطة ، نتوقع إنبات & # x00394جيرد ستكون الجراثيم عند 150 ميجا باسكال من الضغط بطيئة أيضًا ، وهو ما تم العثور عليه (الشكل & # x200B (الشكل 7) .7). في المقابل ، نظرًا لأن إنبات البوغ بضغط 500 ميجا باسكال لا ينتقل عبر مستقبلات المغذيات ، نتوقع أن نرى معدلات إنبات بوغ من النوع البري تقريبًا مع & # x00394جيرد في ظل هذه الظروف ، وهذا مرة أخرى ما لوحظ (الشكل & # x200B (الشكل 7) .7). تتوافق هذه النتائج مع دراسة سابقة عن إنبات الضغط مع جراثيم أ جيرد نقطة متحولة (36).

إنبات من النوع البري و & # x00394جيرد الجراثيم بسبب الضغوط العالية. من النوع البري (PS832) و & # x00394جيرد (FB62) نبتت جراثيم بالضغط ، وتم تقييم إنبات البوغ عن طريق قياس إطلاق DPA كما هو موضح في المواد والطرق. & # x025cb ، جراثيم من النوع البري نبتت بضغط 150 ميجا باسكال & # x02022 ، جراثيم من النوع البري نبتت بضغط 500 ميجا باسكال & # x025b5 ، & # x00394جيرد نبتت الأبواغ بضغط 150 ميجا باسكال & # x025b4 ، & # x00394جيرد نبتت الجراثيم بضغط 500 ميجا باسكال.

آثار التعديلات في مستوى GerD أو تسلسل الأحماض الأمينية على إنبات البوغ.

كما هو مذكور أعلاه ، يحتوي GerD على SP محتمل متبوعًا بموقع التعرف المفترض لإضافة diacylglycerol ، بما في ذلك بقايا السيستين التي يضاف إليها diacylglycerol. تحتوي إحدى الوحدات الفرعية لمستقبلات المغذيات في البوغ أيضًا على كل من ميزات التسلسل هذه ، كما أن تغيير السيستين diacylglycerylated إلى ألانين يلغي وظيفة مستقبلات المغذيات GerA ويقلل بشكل كبير من وظيفة مستقبل المغذيات GerB (10). وبالتالي كان من المهم تحديد أهمية ميزات تسلسل GerD هذه. ربما ليس من المستغرب أن حذف GerD احتمال وجود SP أو تغيير السيستين المفترَض diacylglycerylated إلى ألانين دمر وظيفة GerD في إنبات الأبواغ إما باستخدام L -alanine أو AGFK (الجدول & # x200B (الجدول 5). 5). ومع ذلك ، عندما كانت الجينات الطافرة الأخيرة في جيرد locus ، تعبير عن GerD من النوع البري من ايمي استعاد locus وظيفة GerD ، كما فعل التعبير عن جيرد من عند ايمي في سلالة مع أ جيرد الحذف في جيرد موضع (جدول & # x200B (جدول 5). 5). كما هو متوقع ، التعبير عن المتغير جيرد الجينات من ايمي لم يتدخل الموضع في إنبات الجراثيم ذات النوع البري جيرد في ال جيرد locus (جدول & # x200B (جدول 5 5).

الجدول 5.

إنبات جراثيم سلالات مختلفة جيرد الجينات في مواقع مختلفة أ

أضنىالتركيب الجيني ذي الصلة بالمعدل النسبي لإنبات البوغ ج مع:
L- ألانينAGFK
PS3980& # x00394جيرد& # x022648& # x022648
PS3981النوع البري100100
PS3982جيرد C20A & # x022648& # x022644
PS3983جيرد & # x00394SP & # x022648& # x022644
PS3987& # x00394gerD ايمي::جيرد10585
PS3988& # x00394gerD ايمي:: صsspB-gerD10585
PS3989ايمي::جيرد9595
PS3990ايمي:: صsspB-gerD10095
PS3991ايمي::جيرد ج 20 105110
PS3992ايمي::جيرد & # x003947-15 100110
PS3993جيرد C20A ايمي::جيرد105105
PS3994جيرد C20A ايمي:: صsspB-gerD100110
PS3995جيرد & # x00394SP ايمي::جيرد10095
PS3996جيرد & # x00394SP ايمي:: صsspB-gerD10580

حقيقة أن البرية من النوع جيرد أعرب في ايمي يمكن استعادة وظيفة GerD التي تم التعبير عنها من GerD الوظيفية جيرد في ايمي. أظهر العمل السابق أن الإفراط في التعبير عن مستقبلات المغذيات المختلفة يمكن أن يكون له تأثيرات كبيرة على كل من الأبواغ وإنبات البوغ (6 ، 11). رغم ذلك، متى جيرد تم التعبير عنه في ايمي تحت سيطرة أي من جيرد المروّج أو القوي جدًا الخاص بالمتطلبات المحددة sspB المروج ، السلالات الناتجة بشكل طبيعي (لا تظهر البيانات) وأظهرت جراثيم هذه السلالات معدلات إنبات مشابهة جدًا لتلك الخاصة بالجراثيم من النوع البري (الجدول & # x200B (الجدول 5). 5). بينما لا نعرف الدرجة التي تم فيها الإفراط في التعبير عن GerD في جراثيم السلالة جيرد تحت PsspB السيطرة ، وجد العمل السابق أن وضع جرب أوبرون تحت P.sspB نتائج السيطرة في زيادة 200 ضعف في مستويات GerBA (27).


النتائج

قتل الأبواغ بواسطة Sterilox

كما هو متوقع، B. الرقيقة تم قتل الأبواغ بواسطة Sterilox ، حيث كان هناك أكثر من 5 سجلات لقتل الجراثيم في 5 دقائق باستخدام Sterilox غير المخفف (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، كان هذا سريعًا جدًا بالنسبة للقياس الدقيق لمعدلات القتل ، لذلك استخدم المزيد من العمل ستريلوكس المخفف. مع تخفيف 1/10 من Sterilox ، حصلنا على ما يقرب من سجلي قتل في 11 دقيقة وأظهرت كل من الجراثيم من النوع البري و α - β - حساسية متطابقة بشكل أساسي لهذا العامل (الشكل 1). أظهر تحليل الناجين من علاج Sterilox للجراثيم أنه لم يكن هناك طفرات مصاحبة لقتل Sterilox من النوع البري أو جراثيم ألفا - β (الجدول 1). ومع ذلك ، كما هو مذكور سابقًا (10) ، تحتوي جراثيم ألفا - β - غير المعالجة على مستوى أساسي كبير من الطفرات التي ربما تراكمت أثناء التبويض وتنظيف الجراثيم وتخزينها. يشير عدم وجود الطفرات المصاحبة لقتل الأبواغ بواسطة Sterilox وحساسية Sterilox المماثلة من النوع البري وجراثيم α - β - بقوة إلى أن هذا العامل لا يقتل الجراثيم عن طريق التسبب في تلف الحمض النووي. كان هذا الاقتراح مدعومًا بالنتائج التي توصلت إليها مقدمة أ recA الطفرة في سلالات من النوع البري أو سلالات α - لم تزيد من حساسية الجراثيم لعقار Sterilox بالفعل ، recA كانت الأبواغ في الواقع أكثر مقاومة للستيرلوكس من تلك recA + نظرائهم (الشكل 1). الأسباب الدقيقة للنتيجة الأخيرة غير معروفة ، ولكن لوحظت هذه الظاهرة سابقًا مع العديد من العوامل الكيميائية الأخرى ، وقد اقترح أن تكون بسبب الاختلافات في تكوّن الأبواغ من النوع البري و recA سلالات تؤدي إلى اختلافات في خصائص الجراثيم الناتجة (27 31). تم دعم عدم قتل الجراثيم بواسطة Sterilox من خلال تلف الحمض النووي من خلال التحليلات التي أظهرت أنه لا توجد زيادة كبيرة في فواصل الخيط الفردي أو المزدوج في الحمض النووي من جراثيم سلالة PS533 التي تم قتلها (& gt 99٪) بواسطة Sterilox (البيانات غير معروضة).

مقاومة جراثيم السلالات المختلفة لعقار ستريلوكس. أبواغ السلالات PS533 (النوع البري) (○) ، PS578 (α - β -) (▵) ، PS2318 (recA) (●) و PS2319 (α - β - recA) (▴) تم تحضينها بـ 1/10 Sterilox ، وفي أوقات مختلفة ، تم تخفيف قسامات ومعايرتها من أجل جراثيم قابلة للحياة

أظهر العمل السابق أن طبقة البوغ هي عامل رئيسي في مقاومة الأبواغ لبعض المواد الكيميائية (5 8 26) وكان هذا صحيحًا أيضًا لمقاومة Sterilox ، حيث أعطى 1/10 Sterilox أكثر من 4 سجلات لقتل النوع البري المرقق أو α - β - الأبواغ في 30 ثانية (البيانات غير معروضة) ، بينما أعطى التخفيف 1/100 من Sterilox أكثر من سجلي قتل من النوع البري منزوع الطلاء أو جراثيم α - β في 3 دقائق (الشكل 2 والبيانات لا معروض). قد تكون الهضبة في قتل الأبواغ المغلية (الشكل 2) ناتجة عن نسبة صغيرة من الأبواغ التي لم يتم فكها بالكامل ، لكننا لم ندرس هذا الأمر بمزيد من التفصيل. في المقابل ، لم يتم قتل الجراثيم من النوع البري السليم والجراثيم α - - بتخفيف 1/100 من Sterilox في 6 دقائق (الشكل 2 والبيانات غير معروضة). تم توضيح أهمية طبقة البوغ في حساسية ستريلوكس من خلال زيادة حساسية Sterilox للأبواغ التي تحمل طفرة في سرير الجين (الشكل 3) ، الذي يشفر بروتينًا ضروريًا لتشكيل غلاف البوغ المناسب (8). أظهرت الخلايا الخضرية من النوع البري حساسية تجاه مادة Sterilox الوسيطة بين الجراثيم غير المعالجة والمغلفة ، حيث تم قتل الخلايا النامية بنسبة 80 ٪ في 11 دقيقة بواسطة تخفيف 1/100 من Sterilox.

مقاومة الجراثيم السليمة والمغلفة للستيرلوكس. تم تحضين جراثيم السلالة PS533 (النوع البري) (، ●) أو سلالة PS578 (α - β -) (▵ ، ▴) بدون (○ ، ▵) أو مع (● ، ▴) معالجة إزالة طلاء سابقة مع 1/100 تم تخفيف Sterilox ، وفي أوقات مختلفة ، ومقايسة من أجل جراثيم قابلة للحياة

مقاومة البرية من النوع و سرير الجراثيم إلى Sterilox. أبواغ السلالات PS533 (النوع البري) (○) و PS3328 (سرير) (●) حضنت بـ 1/10 Sterilox ، وفي أوقات مختلفة ، تم تخفيف قسامات ومعايرتها من أجل جراثيم قابلة للحياة

إنبات وصلاحية الجراثيم المعالجة بـ Sterilox

أدى قتل الجراثيم السليمة (95٪) بواسطة Sterilox إلى إطلاق أقل من 5٪ من DPA (البيانات غير معروضة). يشير هذا إلى أن Sterilox لا يقتل الجراثيم عن طريق التلف الجسيم للطبقات الخارجية للجراثيم مع انهيار مصاحب في حواجز نفاذية البوغ. نظرًا لأنه تم أيضًا استبعاد تلف الحمض النووي كآلية يتم من خلالها قتل الجراثيم بواسطة Sterilox ، فإن هذا يترك ضررًا لجهاز الإنبات كآلية محتملة لقتل الجراثيم بواسطة هذا العامل. ومع ذلك ، لم تتم زيادة قابلية بقاء الجراثيم المقتولة بـ Sterilox عن طريق العلاج باستخدام النابتة غير المغذية Ca 2+ -DPA (البيانات غير معروضة) ، وبالتالي استبعاد تدمير المستقبلات الجرثومية كآلية وحيدة لقتل ستريلوكس للجراثيم (18) . لم يتم أيضًا زيادة قابلية بقاء الجراثيم المقتولة بـ Sterilox عن طريق إزالة الطلاء اللاحق متبوعًا بمعالجة الليزوزيم في وسط مفرط التوتر (البيانات غير معروضة) ، واستبعد أيضًا تعطيل الإنزيمات المحللة في قشرة البوغ كآلية لقتل الجراثيم بواسطة Sterilox (21).

دعماً للاستنتاجات التي تفيد بأن قتل الأبواغ بواسطة Sterilox لا يتم من خلال تعطيل أي من المستقبلات الجرثومية أو الإنزيمات المحللة في القشرة ، فإن الجراثيم المقتولة بـ Sterilox قد نبتت كما تم قياسها بتحويل الأبواغ من الضوء إلى الظلام تحت مجهر تباين الطور ، على الرغم من أن هذه العملية كانت أبطأ في الجراثيم المقتولة بـ Sterilox ولم تتضخم الأبواغ المقتولة بـ Sterilox أبدًا (الجدول 2 والشكل 4). في حين أن الجراثيم النابتة المقتولة بـ Sterilox لم تتضخم أبدًا ، إلا أنها أطلقت DPA وتسبب أيضًا في تدهور قشرة الببتيدوجليكان ، كما تم قياسه بإطلاق الهكسوزامين في وسط الإنبات (الجدول 2) في الواقع ، يبدو أن الجراثيم المقتولة تتحلل أكثر من الببتيدوغليكان أكثر من الجراثيم غير المعالجة. وبالتالي ، لا يسبب علاج Sterilox أي عيب مطلق في الخطوات الأولية لإنبات البوغ. عندما تم قياس بدء التمثيل الغذائي أثناء إنبات البوغ عن طريق إنتاج الضوء من الجراثيم التي تحمل لوكساب الجينات من V. harveyii (13) ، أظهرت الأبواغ غير المعالجة انفجارًا سريعًا في إنتاج الضوء عند خلط الجراثيم مع إنتاج الإنبات والضوء ثم انخفض (الشكل 5) ، كما رأينا سابقًا (6). تأخر إنتاج الضوء أثناء إنبات الجراثيم المقتولة (90-99٪) بواسطة Sterilox مقارنةً بالجراثيم غير المعالجة (الشكل 5) ، بسبب التأخير في بدء إنبات الأبواغ في الجراثيم المقتولة بـ Sterilox (الشكل 4). ). في حين أن مستوى الذروة من الضوء الناتج أثناء إنبات جراثيم ستريلوكس المقتولة كان أقل من ذلك من الجراثيم غير المعالجة ، كان هذا المستوى أعلى بكثير مما كان متوقعًا إذا لم تبدأ جراثيم Steriloxed أي عملية التمثيل الغذائي أثناء الإنبات اللاحق ، حيث قتلت الجراثيم 85 و 99 · 8٪ بواسطة أعطى Sterilox 65 و 10 ٪ ، على التوالي ، من ذروة إنتاج الضوء بواسطة الجراثيم غير المعالجة (الشكل 5) ، وقد يكون ارتفاع الذروة المنخفض من الجراثيم المعالجة بـ Sterilox أيضًا ناتجًا جزئيًا عن عدم التزامن الأكبر في إنبات هذه الجراثيم (الشكل 5). 4). لذلك ، على الرغم من أن العلاج المطول بـ Sterilox قد يجعل الجراثيم في النهاية غير قادرة على بدء التمثيل الغذائي أثناء الإنبات ، لا يبدو أن هذا هو الآلية الأساسية لقتل الأبواغ ، حيث يمكن للجراثيم المقتولة بـ Sterilox أن تبدأ عملية التمثيل الغذائي أثناء إنبات البوغ. ومع ذلك ، فإن عددًا كبيرًا من جراثيم Sterilox المقتولة النابتة تضررت بشدة ، حيث تم تحليل الأبواغ المعالجة بـ Sterilox (99 ٪ قتلت) باستخدام LIVE / DEAD البكالورياأظهرت صبغة صلاحية الضوء أن ما لا يقل عن نصف الجراثيم المعالجة بـ Sterilox النابتة كانت ميتة ، على عكس الجراثيم النابتة غير المعالجة ، والتي كان 99 ٪ منها على قيد الحياة (الجدول 3).

إنبات الجراثيم مع أو بدون علاج مسبق بالستيرلوكس. تم إنبات أبواغ السلالة PS533 (النوع البري) مع أو بدون معالجة سابقة بـ Sterilox عند 37 درجة مئوية و O.D.600 نانومتر من 1 في 2 × YT وسط زائد 4 مليمول لتر -1 لتر-ألانين. في أوقات مختلفة ، تم فحص 100 جراثيم تحت مجهر تباين الطور وتم تحديد النسبة المئوية للجراثيم المظلمة في الطور كمقياس لإنبات البوغ. ○ ، جراثيم غير معالجة ▵ ، جراثيم قتل 96٪ بواسطة Sterilox و □ ، جراثيم 99 · 9٪ قتل بواسطة Sterilox

إنتاج خفيف أثناء إنبات الجراثيم غير المعالجة والمعالجة بـ Sterilox. جراثيم الإجهاد PS3379 (لوكساب) مع أو بدون معالجة سابقة بـ Sterilox وقياس الإنتاج الخفيف كما هو موصوف في المواد والطرق. ○ ، جراثيم غير معالجة ▵ ، جراثيم قتل 85٪ بواسطة Sterilox و □ ، جراثيم 99 · 8٪ قتل بواسطة Sterilox. لاحظ أنه يبدو أن هذه الجراثيم تنبت أسرع من تلك المستخدمة في التجربة الموضحة في الشكل 4 وقد تم تأكيد ذلك من خلال الفحص تحت مجهر تباين الطور


نتائج

LipB هو إنزيم خارج الخلية

إطار قراءة مفتوح بطول 630 نقطة أساس (شفة ب) من B. الرقيقة 168 تسلسل جينوم [[31 ، 32]] أظهر تشابهًا كبيرًا مع جينات الليباز المعروفة الشفاه من B. الرقيقة[[14]] و ب. بوميلوس[ [15] ]. كشفت محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات الناضجة عن هوية 77 ٪ لـ ب. بوميلوس الليباز و 74٪ هوية له B. الرقيقة ليباز ليبا علاوة على ذلك ، فإن النشاط التحلل الدهني المتبقي على لوحات مؤشر ثلاثي البوترين في الشفاه- ناقص B. الرقيقة أشارت السلالة BCL 1050 إلى وجود ليباز أو إستراز إضافي خارج الخلية (البيانات غير معروضة). لذلك ، قمنا بتضخيم شفة ب تسلسل الكروموسومات B. الرقيقة 168 بواسطة PCR وتم إنشاء ملف شفة ب إجهاد الإفراط في التعبير B. الرقيقة TEB 1003 عن طريق تحويل ملف الشفاهسلالة سلبية B. الرقيقة BCL 1050 مع التعبير البلازميد pMAlipB ، حيث يكون شفة ب كان الجين تحت سيطرة القوي هباالمروج الثاني الذي يتم التعبير عنه بشكل أساسي في B. الرقيقة.

لقد توقعنا توطين خارج الخلية لـ LipB الناضج لأنه يحتوي على تسلسل إشارة N-terminal مفترض [[33]]. لاختبار تنبؤنا ، قمنا ببناء بلازميد pMAlipB فيه شفة ب يتم التعبير عن الجين كبروتين يحتوي على تسلسل الإشارة الخاص به. تم تحديد نشاط الليباز خارج الخلية الناتج عن سلالة التعبير أثناء النمو عند 37 درجة مئوية على مدى 25 ساعة. تم تحديد أقصى نشاط للليباز بمقدار 2-3 U · مل -1 من المادة الطافية للثقافة في نهاية مرحلة النمو اللوغاريتمي ، والتي تم الوصول إليها بعد 15 ساعة من الحضانة (البيانات غير معروضة).

تم عزل بروتين LipB المفرز من المستنبتات الطافية بعد إزالة الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي. تم تعديل بروتوكول التنقية المكون من خطوتين الموصوف لـ LipA [17] لإنتاج كميات كبيرة من الإنزيم النقي. في خطوة التنقية الأولى ، أسفر تحليل كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء على فينيل سيفاروس عن تحضير إنزيم منقى ملوث بكمية صغيرة من بروتين 45 كيلو دالتون. نتج عن كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني اللاحق 1.3 مجم بروتين ليب بي بنقاوة 99٪ تم الحصول عليها من 1 لتر من مادة طافية للثقافة. كشف تحليل SDS / PAGE للكسور ذات النشاط التحلل الدهني عن نطاق الإستراز عند حوالي 20.5 كيلو دالتون كتلة مولية (الشكل 1). تم تلخيص نتائج التنقية في الجدول 3.

تحليل SDS / PAGE لـ LipB المعزول من B. الرقيقة 1003 TEB. ممرات مختلفة واردة مص بروتينات العلامة ، وطاف الثقافة ، و LipB بعد التنقية بالتفاعل الكارثي للماء وكروماتوجرافيا التبادل الكاتيوني اللاحق. وحدة واحدة من نشاط LipB ، على النحو الذي تحدده مقايسة الطيف الضوئي مع ص- نيتروفينيل - بالميتات كركيزة ، تم تحميلها على الجل.

خطوة التنقية بروتين [ملغ] نشاط [U] نشاط محدد [U · mg −1] أثمر [٪]
طاف الثقافة 280 2120 7.5 100
فينيل سيفاروس 5 440 88 20.7
HiTrapSP 1.3 260 200 12.3

تم نقل بروتين LipB المنقى إلى غشاء بولي (فينيلدين ديفلورايد) (PVDF) بواسطة النشاف الغربي وتم تحديد الأحماض الأمينية الطرفية N عن طريق تحلل Edman الآلي مثل Glu-Ser-Val-His-Asn-Pro-Val-Leu -Val ، تمامًا كما هو متوقع من تسلسل النوكليوتيدات لـ شفة ب. تم شق تسلسل إشارة البروتين المسبق خلف الموقع المتوقع Ala28 ، مع الاحتفاظ بإنزيم ناضج بكتلة مولارية محسوبة تبلغ 19490 Da ، والتي تتكون من 182 من الأحماض الأمينية.

يتكون الثالوث التحفيزي لـ LipB من Ser78 و Asp134 و His157

يتكون الموقع النشط للعديد من α /-hydrolase من ثالوث محفز يتكون من بقايا nucleophilic متبوعًا بحمض تحفيزي ، والذي لا يشارك بشكل مباشر في التحفيز ، والهيستيدين. في الليباز ، يتكون هذا الموقع النشط عادةً من سيرين ، وأسبارتاتي أو جلوتامات ، وهستيدين. تم اقتراح مواضع مخلفات الثالوث التحفيزي لـ LipB بناءً على محاذاة تسلسلية للليباز ذات الصلة الوثيقة من ب. بوميلوس و B. الرقيقة. في B. الرقيقة تم تحديد LipA Ser77 و Asp133 على أنهما جزء من الثالوث التحفيزي ولكن بقاياه ظلت مجهولة [[34]]. المخلفات المقابلة في LipB هي Ser78 المقيمين في عصية-بنتاببتيد Ala-X-Ser-X-Gly و Asp134. الأحماض الأمينية His157 في تسلسل LipB هي بقايا الهيستيدين الوحيدة المحفوظة في جميع الإنزيمات الثلاثة. لذلك ، اقترحنا أن تشكل Ser78 و Asp134 و His157 الموقع النشط لـ LipB. تم تأكيد هذا التنبؤ من خلال إنشاء المتغيرات S78C و D134N و H157N عن طريق الطفرات الموجهة للموقع. تم التعبير عن كل هذه البروتينات بمستويات بروتين مماثلة لبروتين LipB من النوع البري في المضيف غير المتجانسة بكتريا قولونية BL21 (DE3) ، لكنها كانت غير نشطة إنزيمياً (الشكل 2).

تحديد بقايا الثالوث التحفيزي في ليب من B. الرقيقة. (أ) تم التعبير عن الشفاه من النوع البري والمتغيرات S78C و D134N و H157N في بكتريا قولونية تم تقييم BL21 (DE3) ونشاط التحلل الدهني في محللات الخلية الكاملة باستخدام ص- نيتروفينيل بالميتات كركيزة. كان النشاط المطلق لـ LipB من النوع البري 5 U · mL −1 (± 0.5) من محلول الخلية. كان حد الكشف للمقايسة حوالي 5-10 U · L −1. بكتريا قولونية خدم BL21 (DE3) الذي يؤوي pET22b كعنصر تحكم سلبي.(ب) تم تحديد مدى تعبير LipB ومتغيراته بواسطة SDS / PAGE والتلطيخ اللاحق باستخدام Coomassie Brilliant Blue R-250. تتميز الفرقة 19.4 كيلو دالتون LipB بسهم.

تمت استعادة فكرة إجماع الليباز الكنسي في البديل A76G

متواليات خماسي الببتيد المحفوظة من سبعة عصية تمت محاذاة الليباز والإستيراز: أربعة منهم (B. الرقيقة شفة و شفة ، ب. بوميلوس و B. licheniformis) لديك تسلسل Ala-His-Ser-Met-Gly والثلاثة الآخرين (B. stearothermophilus, B. thermoleovorans و B. thermocatenulatus) لديك تسلسل Ala-His-Ser-Gln-Gly. جميعهم مشتركون في أن بقايا الألانين تحل محل الجلايسين الأول في الليباز الخماسي الببتيد المحفوظ Gly-X-Ser-X-Gly.

للتحقيق في الوظيفة المحتملة لهذا الشكل الهيكلي ، تم إنشاء متغير LipB A76G عن طريق الطفرات الموجهة بالموقع ، وبالتالي استعادة نموذج إجماع الليباز الكنسي. تمت مقارنة الاستقرار الحراري والنشاط التحفيزي للبروتين المتغير A76G المنقى مع إنزيم النوع البري LipB والليباز خارج الخلية LipA من B. الرقيقة.

الاستقرار الحراري ودرجة الحموضة لـ LipA و LipB والمتغير A76G

يوضح الشكل 3 أ ملامح ثبات درجة حرارة LipA و LipB والمتغير A76G. ظل كل من الإنزيمات البرية مستقرة حتى درجة حرارة حضانة تبلغ 45 درجة مئوية ، بينما يُظهر المتغير A76G ثباتًا كبيرًا يصل إلى 40 درجة مئوية عند درجات حرارة أعلى ، فقد فقدوا نشاطهم بسرعة. تم دراسة تأثير استبدال الأحماض الأمينية A76G على ثبات الإنزيم من خلال تسجيل ملامح تمسخ الحرارة للأنزيمات من النوع البري والأنزيمات المختلفة عند درجات حرارة مختلفة. يوضح الشكل 3 أ أن المتغير A76G أظهر حساسية ملحوظة لدرجة الحرارة بنصف عمر 8 دقائق عند 45 درجة مئوية ، بينما ظل النوع البري مستقرًا عند درجة الحرارة هذه. لاستبعاد التحلل البروتيني لبروتين A76G المتغير أثناء الحضانة عند 45 درجة مئوية ، تم تحليل الإنزيم المعالج حرارياً بواسطة SDS / PAGE. لم يُظهر الجل المصبوغ أي شرائط بروتينية بالإضافة إلى نطاق 19.4 كيلو دالتون LipB ، مما يشير إلى عدم حدوث تحلل بروتيني مهم (البيانات غير معروضة).

الاستقرار الحراري ودرجة الحموضة لـ LipA و LipB ومتغيرها A76G. تم تحديد أنشطة الإنزيم باستخدام المقايسة الطيفية ص- نيتروفينيل بالميتات كركيزة. (A) 4.0 ميكروغرام · مل -1 لكل من LipA (▵) و LipB () والمتغير A76G (○) تم تحضينها عند 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في محلول جليكاين 2 مم عند درجة الحموضة 11. (B) كانت العينات حضنت في مخازن 50 مم من الجلايسين / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 2-3 Na2HPO4/ سترات ، درجة الحموضة 4-6 تريس / حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7-9 والجليسين / هيدروكسيد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 11-12 ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة.

كان كل من إنزيمات النوع البري LipA و LipB مستقرين في نطاق درجة الحموضة القلوية من 11-12 حيث أظهروا نشاطًا متبقيًا بنسبة 80-95٪ بعد 48 ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة. عند قيم الأس الهيدروجيني المنخفضة ، كان النشاط المتبقي أقل من 20٪ من نشاط النوع البري. أظهر المتغير A76G حوالي 60٪ من النشاط المتبقي عند الرقم الهيدروجيني 11 وحوالي 30٪ عند الرقم الهيدروجيني 12 تحت نفس الظروف. ومع ذلك ، أظهر هذا المتغير أيضًا استقرارًا ملحوظًا عند الرقم الهيدروجيني 5-7 (الشكل 3 ب).

الأنشطة التحفيزية لـ LipA و LipB و A76G البديل ص- استرات نيتروفينيل وثلاثي جليسريد

تم تحديد الأنشطة التحفيزية أولاً باستخدام ثلاثي الجليسريد و صركائز نيتروفينيل استر. تم إجراء جميع فحوصات النشاط عند 37 درجة مئوية ، والتي تبين أنها درجة الحرارة المثلى لنشاط واستقرار الإنزيمات من النوع البري والمتغير (البيانات غير معروضة). يلخص الشكل 4 الملامح التحفيزية للأنزيمات الثلاثة. كل من إنزيمات النوع البري LipA و LipB ركائز ثلاثي الجليسريد المتحلل بالماء تفضيليًا مع الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (≤ C10) مع أقصى نشاط تجاه التريكابريلين (C8: 0) (الشكل 4 أ). كانت ركيزة الليباز النموذجية تريولين (C18: 1) ركيزة ضعيفة لـ LipA ولم يتم تحللها على الإطلاق بواسطة LipB. ومع ذلك ، أظهر بروتين LipB أنشطة محددة أعلى من LipA ضد ثلاثي الجليسريد مع أطوال سلسلة الأحماض الدهنية من C4 إلى C8. انخفضت الأنشطة المحددة لـ LipB مع ركائز ذات أطوال سلاسل أقصر وأعلى (الشكل 4 أ).

خصائص الركيزة لـ LipA و LipB المنقى والمتغير A76G نحو (A) ثلاثي الجليسريد و (B) ص-استرات نيتروفينيل مع أطوال سلاسل مختلفة. تم تحديد الأنشطة من خلال مقايسة الرقم الهيدروجيني الإحصائي لثلاثي الجليسريد ومع الفحص الطيفي الضوئي لـ ص-استرات نيتروفينيل.

الأنشطة التحفيزية المنخفضة جدًا لـ B. الرقيقة تم تأكيد إنزيمات LipA و LipB على الدهون الثلاثية ذات أطوال سلسلة الأحماض الدهنية الطويلة باستخدام ثلاثي الجليسريد الفلوري الطبيعي المحتوي على حمض الباريناريك (C18: 4) كركيزة. كانت الأنشطة المحددة 3.4 U mg 1 (± 0.5) و 0.010 U · mg −1 (± 0.0012) لـ LipA و LipB ، على التوالي.

يتم تحديد ملفات تعريف النشاط المحددة باستخدام صكانت ركائز -nitrophenyl-ester قابلة للمقارنة مع LipA و LipB (الشكل 4 ب). كان كلا الإنزيمين فعالين ضد جميع الإسترات المختبرة بأطوال سلاسل الأحماض الدهنية من C6 إلى C18 مع أقصى نشاط ضد إسترات أطوال سلسلة الأحماض الدهنية C8 و C14. كانت الأنشطة النوعية المطلقة لـ LipB دائمًا أعلى من تلك الموجودة في LipA (الشكل 4 ب).

يبدو أن متغير LipB A76G يحتوي على خصائص ركيزة قابلة للمقارنة مع إنزيم من النوع البري ، مع أقصى قدر من الأنشطة ضد ص-استرات نيتروفينيل مع أطوال سلاسل C8 و C14 (الشكل 4 ب) وضد ثلاثي الجليسريد ثلاثي التريكابريلين (C8: 0) (الشكل 4 أ) ، لكن القيم المطلقة للأنشطة المحددة اختلفت عن الأنشطة التحفيزية من النوع البري. الجميع صتم تحلل ركائز -nitrophenyl-ester بالماء بمعدل حوالي 50٪ من نشاط النوع البري. ومع ذلك ، فإن الأنشطة التحفيزية المحددة لمتغير LipB A76G ضد ركائز ثلاثي الجليسريد لم تتغير على ثلاثي الجليسريد مع أطوال سلاسل الأحماض الدهنية القصيرة (C2: 0 و C3: 0). مع ثلاثي الجليسريد طويل السلسلة ، لم يتم الكشف عن أي نشاط على التريولين لكل من LipB ومتغيره. عرضت هذه الإنزيمات أنشطة تحفيزية مماثلة على الدهون الثلاثية المحتوية على حمض الباريناريك وإن كانت منخفضة جدًا (0.010 يو مليغرام -1 (± 0.0012) و 0.0076 يو مليغرام -1 (± 0.0013) للـ LipB ومتغيره A76G ، على التوالي). بالنسبة إلى الدهون الثلاثية الأخرى (C4: 0 إلى C10: 0) كانت الأنشطة التحفيزية المقاسة للمتغير أعلى بنسبة 40٪ على الأقل من الأنشطة التي تم قياسها باستخدام النوع البري LipB.

تجدر الإشارة إلى أن الأنشطة المحددة لـ LipA و LipB و A76G من النوع البري كانت منخفضة مقارنةً بالليباز الآخر الذي تم اختباره ضد التريكابريلين بواسطة طريقة الرقم الهيدروجيني الإحصائي (الشكل 5).

نشاط التحلل الدهني B. الرقيقة LipA ​​و LipB والمتغير A76G تجاه التريكابريلين (C8: 0) مقارنةً بالليباز الأخرى من أصل بدائية النواة وحقيقية النواة. تم تحديد الأنشطة المحددة بمقايسة إحصائيات الأس الهيدروجيني كما وصفها روغالسكا وآخرون. [ [35] ].

التوصيف الحركي لـ LipA و LipB والمتغير A76G باستخدام تقنية الفيلم أحادي الجزيء

أظهر LipA و LipB أنشطة محددة قصوى مماثلة عند استخدام monoolein أو 1،2-dicaprin أو 2،3-dicaprin أو d -dodecanoic-IPG ester كركائز (الشكل 6 أ). ومع ذلك ، أظهر LipA خصوصية أعلى قليلاً من LipB للتحلل المائي لـ ل - أيزومر دوديكانويك - إستر IPG.

أنشطة محددة لـ LipA و LipB والمتغير A76G باستخدام تقنية الفيلم أحادي الجزيء وركائز مختلفة. (أ) كانت الركائز عبارة عن حمض دوديكانويك إستر (▴) ، حمض الدوديكانويك إستر IPG (●) ، 1،2-ديكابرين (◆) ، 2،3-ديكابرين (▪) و (ب) مونولين. كان الانحراف المعياري حوالي 10٪ لكل قيمة معطاة.

أظهر متغير LipB A76G أنشطة تحفيزية أعلى (1.3-2.9 ضعفًا) من LipB من النوع البري عند قياسه باستخدام كل من enantiomers من dicaprin وإسترات dodecanoic-IPG. عندما تم استخدام monoolein ، يؤدي استبدال الألانين بالجليسين إلى زيادة كبيرة في نشاط الليباز (على الأقل 10 3 أضعاف) (الشكل 6 ب).


ComC مطلوب لمعالجة ونقل ComGC ، وهو بروتين كفاءة شبيه بالبيلين العصوية الرقيقة

معهد أبحاث الصحة العامة ، 455 فيرست أفينيو ، نيويورك ، نيويورك 10016 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

معهد أبحاث الصحة العامة ، 455 فيرست أفينيو ، نيويورك ، نيويورك 10016 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

*للمراسلات. البريد الإلكتروني [email protected] Tel. (212) 578 0842 فاكس (212) 578 0804. ابحث عن المزيد من الأوراق البحثية للمؤلف

معهد أبحاث الصحة العامة ، 455 فيرست أفينيو ، نيويورك ، نيويورك 10016 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

معهد أبحاث الصحة العامة ، 455 فيرست أفينيو ، نيويورك ، نيويورك 10016 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

*للمراسلات. البريد الإلكتروني [email protected] Tel. (212) 578 0842 فاكس (212) 578 0804. ابحث عن المزيد من الأوراق البحثية للمؤلف

ملخص

ComGC هو بروتين موضعي على سطح الخلية مطلوب لربط الحمض النووي أثناء التحول في العصوية الرقيقة. إنه يشبه prepilins من النوع الرابع في ن- المجال النهائي ، لا سيما في تسلسل الأحماض الأمينية المحيطة بمواقع انشقاق المعالجة لهذه البروتينات. ComC هو بروتين آخر مطلوب لربط الحمض النووي ، والذي يشبه بروتياز المعالجة الذي يشق مادة البريبايلين من النوع الرابع. نوضح هنا أن ComGC تتم معالجتها في خلايا مختصة وأن هذه المعالجة تتطلب ComC. نظهر أيضًا أن بروتين PilD من النيسرية البنية، وهو متماثل ComC ، يمكنه معالجة ComGC بتنسيق الإشريكية القولونية، وأن بروتين ComC نفسه هو الوحيد B. الرقيقة البروتين اللازم لإنجاز انشقاق ComGC في الكائن الحي الأخير. بناءً على دراسات قابلية الذوبان في NaOH ، أظهرنا أنه في حالة عدم وجود ComC ، ولكن في وجود جميع البروتينات المختصة الأخرى ، B. الرقيقة غير قادر على نقل ComGC بشكل صحيح إلى الوجه الخارجي لغشاء الخلية. أخيرًا ، أظهرنا أنه يمكن ربط ComGC بشكل متبادل لإنتاج شكل ذي كتلة جزيئية أعلى ، ربما يكون ثنائيًا ، ونقدم أدلة تشير إلى أن تكوين مجمع الكتلة الأعلى يحدث في الغشاء ، قبل الانتقال. تشكيل هذا المجمع لا يتطلب ComC أو أي من كومج المنتجات ، بخلاف ComGC نفسها.


شكر وتقدير

نشكر S. Branda و R. Kolter على هدية حاج بناء حذف الإدراج و G. Ordal للتبرع السخي لسلالات متحولة MCP. نشكر S. Ben-Yehuda و S. Branda و J. Dworkin و E. Gonzalez-Pastor و D. Rudner و C. van Ooij على المناقشات المفيدة والقراءة النقدية للمخطوطة. نحن ممتنون له. بيرج ول. تم دعم هذا العمل من خلال جائزة المعهد الوطني للصحة للخدمات البحثية الوطنية GM66612 إلى D.K ومنح المعهد الوطني للصحة GM18568 إلى R.L.


المواد والأساليب

البلازميدات والسلالات البكتيرية وظروف النمو

تم سرد السلالات البكتيرية والبلازميدات المستخدمة في الجدول 1. احتوى وسط TY على Bacto tryptone (1٪) ، مستخلص خميرة Bacto (0.5٪) ، و NaCl (1٪). B. الرقيقة يتكون وسط التبويض من (لكل لتر): 8 جم مرق مغذي ، 0.5 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، 1 ملي مولار MgSO4، و 13 ملي بوكل. بعد التعقيم ، تمت إضافة المكونات التالية لإكمال وسط التبويض: 1 ملي مولار الكالسيوم (NO3)2، 0.01 ملي MnCl2، و 0.001 ملي مولار FeSO4. B. الرقيقة الحد الأدنى من الأملاح المستخدمة في تجارب التحويل يتكون من (لكل لتر): 2 جم كلفن2وبالتالي410.8 جرام ك2HPO46 جرام KH2ص4، 1 جم Na- سترات ، و 0.02 جم MgSO4. بعد التعديل على الرقم الهيدروجيني 7.0 والتعقيم ، تمت إضافة المكونات التالية (لكل 50 مل): 0.5٪ جلوكوز ، 0.02٪ أحماض كازامينية (ديفكو) ، 1.4 مجم / مل لتر تريبتوفان ، و 2.2 مجم / مل سيترات أمونيوم حديديك. تم استخدام المضادات الحيوية في التركيزات التالية: الكلورامفينيكول (سم) ، 5 ميكروغرام / مل إريثروميسين (إم) ، 100 ميكروغرام / مل (الإشريكية القولونية) أو 5 ميكروغرام / مل (B. الرقيقة) والكاناميسين (كم) 20 ميكروغرام / مل. نمت مزارع الدُفعات الهوائية لـ [13 درجة مئوية] - تجارب وضع العلامات والتحليلات الفسيولوجية عند 37 درجة مئوية في قوارير اهتزاز محيرة سعة 500 مل مع 50 مل من وسط M9 الأدنى ، وتتكون من المكونات التالية (لكل لتر): 8.5 جم Na2HPO4.2H2O ، 3 جرام KH2ص4، 0.5 جم كلوريد الصوديوم ، 1 جم NH4Cl ، 0.25 جم MgSO47 ح2O، 11 مجم CaCl2، 50 مجم من التربتوفان والعناصر النزرة (Harwood and Archibald 1990). تمت إضافة الجلوكوز المعقم بالفلتر إلى تركيز نهائي قدره 5 جم / لتر. تم إجراء تجارب مستقلة إما باستخدام الجلوكوز [1 - 13 درجة مئوية] بالكامل أو خليط من 20٪ [U - 13 درجة مئوية]6] جلوكوز و 80٪ جلوكوز غير مصنف. تم تلقيح هذه الثقافات بنسبة 0.5 ٪ (حجم / حجم) من ثقافة ليلية في وسط M9 ، مع إضافة 10 جم / لتر جلوكوز.

تقنيات الحمض النووي

إجراءات تنقية الحمض النووي وتقييده وربطه ورحلان هلام الاغاروز الكهربائي وتحويل المختص بكتريا قولونية تم تنفيذ الخلايا كما وصفها Sambrook و Fritsch و Maniatis (1989). B. الرقيقة كما وصفه كونست ورابوبورت (1995). يتم سرد متواليات النيوكليوتيدات للاشعال المستخدمة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الجدول 1.

لبناء B. الرقيقة تم استخدام سلالة Δ6 ، أنظمة استئصال تكامل الكروموسومات القائمة على البلازميد. سلالة B. الرقيقة تم استخدام ΔSPβ (Dorenbos et al. 2002) لحذف ملف جلد عنصر (2655129-2699959 bp إحداثيات قائمة فرعية). لهذا الغرض ، فإن المناطق المرافقة لـ جلد تم تضخيم PCR باستخدام أزواج التمهيدي YqcM1 / YqcM2 و YqaB1 / YqaB2 ، وتم استنساخها في ناقل تكامل الكروموسومات pG + host4. تم استخدام البلازميد الناتج للتحويل B. الرقيقة ΔSPβ للتكامل الكروموسومي في yqcM أو يكاب. تم اختيار المحولات (Em r) عند 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، يتم استئصال البلازميد المتكامل (مع جلد) من الكروموسوم عن طريق النمو عند 42 درجة مئوية ، مما أدى إلى السلالة المزدوجة المحذوفة TFC7A (ΔSPβ Δجلد). تم حذف PBSX (1312952-1347172 bp SubtiList إحداثيات) من TFC7A باستخدام بلازميد استئصال تكامل قائم على المضيف 4 يحتوي على المناطق المرافقة لهذه الجرعات ، تم تضخيمها PCR مع أزواج التمهيدي YjnA1 / YjnA2 و XlyA1 / XlyA2. أدى ذلك إلى إجهاد TF8A (ΔSPβ Δجلد ΔPBSX). لحذف Prophage 1 (202092-220145 bp إحداثيات SubtiList) تم تضخيم جزأين يحيطان بمنطقة Prophage 1 بواسطة PCR باستخدام أزواج التمهيدي GlmS1 / GlmS2 و YbdG1 / YbdG2 وربطهما في pORI280 بعد الربط بوساطة PCR عن طريق تمديد التداخل (Horton et آل 1989). تم استخدام البلازميد الناتج ، p280GY ، للتحويل B. الرقيقة لتكامل الكروموسومات في glmS أو ybdG. تمت زراعة المحولات (Em r والأزرق على ألواح TY مع X-gal) في غياب الاريثروميسين للحصول على سلالة محذوفة بأربعة أضعاف Δ4 (ΔSPβ Δجلد ΔPBSX Δ prophage 1 Em s والأبيض على ألواح TY مع X-gal) بسبب الاستئصال التلقائي للبلازميد من الكروموسوم (مع منطقة prophage 1). الجزء الأكبر من pks تم استبدال operon (1781306–1857233 إحداثيات SubtiList) في سلالة Δ4 بعلامة Cm r عن طريق إعادة التركيب المتصالب المزدوج. لهذا الغرض ، تم استخدام البلازميد pJMΔ80 القائم على pJM105A ، والذي يحتوي على أ pks تم تضخيم المنطقة المرافقة مع زوج التمهيدي EUP1 / ELO1 (الذي يشتمل على نهاية 5 ′ من pksA) ومنطقة محاطة مستنسخة من pks (تتألف من نهايات 5 من pksR و pkss). توجد علامة Cm r بين الاثنين pks المناطق المرافقة في pJMΔ80. تم استخدام هذا البلازميد لأول مرة ليحل محل pks مشغل B. الرقيقة تم استخدام 168 مع علامة Cm r ، وبالتالي ، الحمض النووي الكروموسومي للسلالة الناتجة (PB1862) للتحويل B. الرقيقة Δ4. نتج عن ذلك سلالة محذوفة بخمسة أضعاف Δ5 (ΔSPβ Δجلد ΔPBSX Δ Prophage 1 pks::قط). تم استخدام سلالة Δ5 لحذف Prophage 3 (651866–665067 bp إحداثيات SubtiList). تم صنع مشتق من pMTL20E (يحمل علامة Em r) ، والذي يحتوي على جزأين مصاحبين لـ prophage 3 تم تضخيمهما بواسطة PCR مع أزواج التمهيدي قبل ydiM1 / pre-ydiM2 و post-gutR1 / gutR2. يقع كاسيت Km r بين منطقتي Prophage 3 المتجاورتين. تم استخدام البلازميد الناتج للتحويل B. الرقيقة لتكامل الكروموسومات. تم تحويل المحولات (Km r) بمشتق pEpUCΔ1 ، والذي يحتوي على نفس المناطق المحيطة من prophage 3 ولكنه يفتقر إلى علامة Km r بينهما. تم اختيار مجموعة متكاملة متقاطعة مفردة (Km r Em r) عند 51 درجة مئوية. أخيرًا ، تم إثارة استئصال pEpUCΔ1 المتكامل (مع علامة Km r) عن طريق النمو عند 30 درجة مئوية. تم تسمية سلالة Km s Em s الناتجة B. الرقيقة Δ6 (ΔSPβ Δجلد ΔPBSX Δ Prophage 1 pks::قط Δ نفاثة 3). تم التحقق من الإدخال المتسلسل لعمليات الحذف بواسطة التهجين الجنوبي و / أو PCR.

التنميط نسخة

تم إجراء التنميط النصي باستخدام العصوية الرقيقة مصفوفات الماكرو البانورامية من Sigma-Genosys. إجمالي RNA من B. الرقيقة تم عزل 168 باستخدام مجموعة عزل RNA عالية النقاء من Roche Molecular Biochemicals. لتفاعلات النسخ العكسي المتزامنة على جميع mRNAs في عينة RNA ، تمت إضافة 4 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى 1 pmol من الاشعال الخاص بـ ORF (Eurogentec). تم تسخين هذا الخليط إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم تخزينه بعد ذلك على الجليد. بعد ذلك ، 10 ميكرولتر من 5 × أول مخزن مؤقت حبلا (Invitrogen) ، 5 ميكرولتر من 0.1 M DTT ، 0.5 ميكرولتر RNasin 40 U / ميكرولتر (Roche Molecular Biochemicals) ، و 2.5 ميكرولتر dNTPs (5 ملي dATP ، dGTP ، dTTP ، و 0.1 ملي مولار تمت إضافة dCTP) إلى مزيج RNA التمهيدي. تم تعديل حجم التفاعل الكلي إلى 42.5 ميكرولتر مع الماء المعالج باستخدام 0.1٪ داي إيثيل بيروكربونات (DEPC). بعد إضافة 5 ميكرولتر [α- 33 P] dCTP (50 μC) (Redivue ، Amersham Biosciences) و 2.5 ميكرولتر من النسخ العكسي Superscript II (Invitrogen) ، تم تحضين خليط التفاعل لمدة ساعتين عند 42 درجة مئوية ، متبوعًا بـ 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية. تم إيقاف التفاعل وتم تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي بإضافة 2 ميكرولتر من 0.5 M EDTA ، 2 ميكرولتر من 10 ٪ SDS ، و 6 ميكرولتر من 3 N هيدروكسيد الصوديوم. عند الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 68 درجة مئوية ، تمت معادلة الخليط بإضافة 6 ميكرولتر من 2 N HCl. تمت تنقية [كدنا- α- 33 P] باستخدام أعمدة Sephadex G-25 (Roche Molecular Biochemicals). تم فحص النسبة المئوية لتضمين الملصق عن طريق عد التلألؤ. قبل التهجين ، تم غسل زجاجات التهجين والمصفوفات بـ 2 × SSPE (0.36 مولار كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار من فوسفات الصوديوم درجة الحموضة 7.7 ، و 2 ملي مولار EDTA). تم بعد ذلك تهجين المصفوفات مسبقًا في محلول تهجين (Sigma-Genosys) مكملًا بـ 100 ميكروغرام / مل من DNA خصية سمك السلمون (Sigma-Genosys) لمدة ساعة واحدة على الأقل. تمت إضافة cDNA المسمى إلى الصفيف بعد 10 دقائق من الحضانة عند 90 درجة - 95 درجة مئوية في محلول التهجين بالإضافة إلى DNA الخصية السلمون. تم إجراء التهجين لمدة 12-18 ساعة. بعد غسلها بمحلول غسيل (0.5 × SSPE ، 0.2٪ SDS) ، تم لف المصفوفة بغلاف ساران وتعريضها لشاشات فسفوميجر (Packard Instrument Company) لمدة يومين أو ثلاثة أيام.تم فحص الشاشات بواسطة Cyclone Imager (Packard Instrument Company). تم استخدام حزمة برامج Array-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics) لتحليل الصور. تم حساب متوسط ​​الإشارات من النقاط المكررة وتم التعبير عن كثافتها كنسب مئوية من إجمالي الإشارة.

تحليل نسبة التدفق الأيضي (METAFoR)

قسامات الكتلة الحيوية B. الرقيقة تم حصادها خلال النمو الأسي المتأخر في OD600 نانومتر القيم بين 2.5 و 3.0. تم غسل كريات الكتلة الحيوية من 2 مل من مرق الثقافة مرة واحدة باستخدام 1 مل 0.9 ٪ (وزن / حجم) كلوريد الصوديوم وتحللها في 1.5 مل 6 م حمض الهيدروكلوريك عند 110 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في أنابيب زجاجية محكمة الغلق. تم اشتقاق التحلل المائي المجفف بـ N- (ثلاثي-butyldimethylsilyl) -N-methyl-trifluoracetamide (Fluka) وتعرض لتحليل GC-MS كما هو موضح سابقًا (Dauner and Sauer 2000). تم بعد ذلك استخدام التوزيعات الكتلية المشتقة من GC-MS في الأحماض الأمينية المولدة للبروتين لحساب نسب تدفق الكربون داخل الخلايا باستخدام المعادلات الاحتمالية (Fischer and Sauer 2003) ونموذج الشبكة الأيضية لـ B. الرقيقة (Sauer وآخرون 1996). تم تحديد نواتج التمثيل الغذائي الأسيتات والأسيتوين بواسطة كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). تم قياس تركيزات الجلوكوز باستخدام المحلل التلقائي Beckman Synchron CX5CE باستخدام مجموعة كاشف الجلوكوز التي يوفرها Beckman. معدلات النمو القصوى (μالأعلى) من خلال تحليل الانحدار اللوغاريتمي الخطي لـ OD600 نانومتر مقابل الوقت ، مع μالأعلى كمعامل الانحدار. تم حساب تركيزات المادة الجافة للكتلة الحيوية باستخدام عامل ارتباط محدد مسبقًا يبلغ 0.33 جم وزن جاف خلوي لكل OD600 نانومتر وحدة.

فحوصات الكفاءة ، الأبواغ ، وإنبات البوغ

ال B. الرقيقة تم اختبار سلالة Δ6 والأبوية 168 من أجل الكفاءة باستخدام طريقة من خطوتين كما هو موضح سابقًا (Bron and Venema 1972). تم تحويل السلالات بالحمض النووي الكروموسومي لـ B. الرقيقة OG1 (trp+) ، وتم اختيار المحولات لبروتروفان التربتوفان على أجار ضئيل بدون التربتوفان. تم التعبير عن قابلية التحويل بعدد المحولات بالنسبة إلى العدد الإجمالي القابل للتطبيق. تم اختبار قدرة السلالات على التبويض والإنبات من خلال زراعة 25 مستعمرة لمدة 2 إلى 3 أيام على صفيحة أجار متوسطة التبويض في درجة حرارة الغرفة. تم نقل المستعمرات على ورق ترشيح ، وبعد ذلك تم تعريضهم لبخار الكلوروفورم في غرفة مفرغة لمدة 45 دقيقة. تم استخدام المرشحات لعمل نسخة طبق الأصل من جهات الاتصال على لوحات TY ، والتي تم تحضينها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. أخيرًا ، تم حساب عدد المستعمرات التي تنمو على اللوحات المتماثلة. تم اختبار التبويض أيضًا عن طريق زراعة الخلايا طوال الليل في وسط التبويض ، وبعد ذلك تم تسخين جزء من المستنبت إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تم فحص وجود جراثيم قابلة للحياة عن طريق الطلاء.

البروتيوميات

ال B. الرقيقة نمت سلالة متحولة Δ6 والسلالة الأبوية 168 عند 37 درجة مئوية تحت التحريض القوي في وسط TY سعة 1 لتر. بعد ساعة واحدة من النمو اللاحق الأسي ، تم فصل الخلايا عن وسط النمو بالطرد المركزي. تم جمع البروتينات التي تم إفرازها في وسط النمو من أجل ثنائي الأبعاد (2D) دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) وما تلاه من تأين لامتصاص الليزر بمساعدة المصفوفة لقياس الطيف الكتلي لوقت الطيران (MALDI-TOF MS) ، مثل الموصوفة سابقًا (Jongbloed et al. 2002 Antelmann et al. 2001). تم إجراء تحليل صورة الهلام ثنائي الأبعاد باستخدام برنامج Decodon Delta 2D ، والذي يعتمد على تحليل صورة القناة المزدوجة (Bernhardt et al. 1999). باستخدام هذا البرنامج ، يتم تشويه الصورة الرئيسية (ممثلة ببقع بروتين خضراء) مع صورة العينة (ممثلة ببقع بروتين حمراء) بعد تعيين نقاط متجه محددة. وبالتالي ، فإن بقع البروتين الخضراء في صورة القناة المزدوجة موجودة في الغالب في الصورة الرئيسية ، بينما توجد بقع البروتين الحمراء في الغالب في صورة العينة. توجد بقع بروتين صفراء بكميات مماثلة في كلتا الصورتين. بعد طرح الخلفية ، يتم إجراء التسوية من أجل معادلة القيم الرمادية في كل صورة. تم تكرار كل تجربة مرتين على الأقل.

فحوصات نشاط الإنزيم

لتحديد نشاط الليباز (أي الإستريز) ، تم تطبيق المقايسة اللونية كما وصفها Lesuisse و Schanck و Colson (1993) مع بعض التعديلات. باختصار ، 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل (0.1 MH2KPO4 تم استكمال الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 0.1٪ الصمغ العربي ، 0.36٪ Triton X-100) بـ 10 ميكرولتر من يجند 4-nitrophenyl caprylate (10 ملي مولار في الميثانول). بدأ التفاعل بإضافة 10 ميكرولتر من المادة الطافية للثقافة. تم تحديد نشاط الليباز عن طريق قياس الزيادة في الامتصاصية عند 405 نانومتر / دقيقة من الحضانة عند درجة حرارة الغرفة ، لكل OD600 من الثقافة في وقت أخذ العينات.

تم قياس نشاط البروتياز باستخدام الآزوكاسين (سيغما). تم خلط وسط النمو (250 مل) مع 2 ٪ من تعليق azocasein (150 مل) في 50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 4 ملي كلوريد الكالسيوم2، وحضنت لمدة 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية. تم إيقاف التفاعل بإضافة 1.2 مل 10٪ TCA. بعد الطرد المركزي ، تم تحديد تغيرات الامتصاصية (440 نانومتر) للمادة الطافية.

تم تقييم نشاط α-Amylase بمقايسة الهالة. نمت الخلايا إلى المرحلة الثابتة ، وبعد ذلك تم فصلها عن وسط النمو بالطرد المركزي. تم رصد الكسور المتوسطة على مرشحات غشاء Durapore (Millipore) التي تم وضعها على ألواح TY-agar التي تحتوي على 1٪ نشا (Merck). تم تصحيح كميات الوسيط التي تم رصدها على المرشحات من أجل OD600 نانومتر لكل ثقافة. بعد الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، تم تحليل الصفائح لتحلل النشا عن طريق تلطيخها ببخار اليود. تم قياس أقطار المناطق الصافية الناتجة (الهالات).

لمعايرة نشاط β-galactosidase ، تم تخفيف الثقافات الليلية في وسط جديد وأخذت العينات على فترات زمنية مختلفة لـ OD600 نانومتر القراءات وتحديد نشاط بيتا-جالاكتوزيداز. للسلالات التي تحتوي على نسخ لاكز الانصهار ، ومقايسة β-galactosidase وحساب وحدات gal-galactosidase (وحدات Miller: nmol.OD600 1 · min −1) كما وصفها Hyyryläinen et al. (2001). تم تكرار التجارب مرتين على الأقل ، بدءًا من المحولات التي تم الحصول عليها بشكل مستقل. في جميع التجارب ، تم إجراء الضوابط ذات الصلة بالتوازي. على الرغم من وجود بعض الاختلافات في أنشطة β-galactosidase المطلقة ، إلا أن النسب بين هذه الأنشطة في السلالات المختلفة التي تم اختبارها كانت ثابتة إلى حد كبير.

النشاف الغربي والكشف المناعي

لفحص B. amyloliquefaciens مستويات إنتاج α-amylase (AmyQ) ، تم فصل الخلايا عن وسط النمو بالطرد المركزي. تم تحضير عينات لـ SDS-PAGE كما هو موصوف سابقًا (van Dijl et al.1991). بعد الفصل بواسطة SDS-PAGE ، تم نقل البروتينات إلى غشاء نقل نيتروسليلوز Protran (Schleicher و Schuell) كما وصفه Kyhse-Andersen (1984). تم تصور AmyQ و LipA بأجسام مضادة محددة وبيروكسيداز الفجل - أو اقتران IgG القلوي المضاد للأرانب (Jackson ImmunoResearch).

فحص لوحة الحركة

لدراسة حركية عصية الخلايا ، تم نقل 2 ميكرولتر من الثقافات بين عشية وضحاها إلى لوحة TY-agarose تحتوي على 0.75٪ ، 0.5٪ ، أو 0.27٪ agarose. قبل نقلها إلى لوحات ، OD600 نانومتر تم قياس وتعديل كل مزرعة إلى 1. بعد فترة الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية ، تم تقييم درجة الاحتشاد.


اثنان ، أنظمة إشارات المكونات ، الجزء أ

هندريك زورمانت. جيمس أ.هوتش ، في طرق في علم الإنزيمات ، 2007

مقدمة

يمكن القول إن نظام YycFG ثنائي المكون هو أكثر أنظمة نقل الإشارات إثارة للاهتمام في العصوية الرقيقة والبكتيريا الأخرى إيجابية الجرام نظرًا لدورها الأساسي في حيوية الخلية والحفاظ العالي على الأحماض الأمينية (Fabret and Hoch، 1998 Martin وآخرون، 1999). منذ اكتشافنا لطبيعته الأساسية ، تمت دراسة هذا النظام بشيء من التفصيل في العديد من الكائنات الحية ، وقد ساهمت العديد من المعامل بشكل جيد في توضيح الدور المهم الذي يلعبه هذا النظام (Fukuchi وآخرون. ، 2000 هويل وآخرون. ، 2006 نغ وآخرون. ، 2003). يتنوع النظام الذي يتحكم فيه هذا النظام المكون من مكونين بين الكائنات الحية المختلفة ، ولكن الموضوع المشترك هو التحكم في الجينات لعمليات التمثيل الغذائي لجدار الخلية ، وتكوين غشاء الخلية ، وانقسام الخلية (Dubrac and Msadek، 2004 Fukuchi وآخرون. ، 2000 هويل وآخرون. ، 2003 موهيدانو وآخرون., 2005 ).

سؤالان مهمان يجب الإجابة عليهما عند دراسة نظام جديد مكون من مكونين هما ما هي إشارات الإدخال التي تغذي النظام وما هو الإخراج الذي ينظمه هذا النظام؟ يتم تعريف المدخلات على أنها الإشارات التي يتم استشعارها بواسطة هيستيدين كيناز ، والتي يمكن أن تكون متنوعة مثل العناصر الغذائية أو درجة الحموضة أو درجة الحرارة أو التفاعل مع البروتينات الأخرى (Kaspar and Bott، 2002 Mansilla وآخرون. ، 2005 Neiditch وآخرون. ، 2006 Tiwari وآخرون. ، 1996). يتم تعريف الإخراج على أنه الجينات التي يتحكم فيها هذا النظام (التنظيم) لمنظم الاستجابة المعياري لربط الحمض النووي. في الكائنات الحية المدروسة جيدًا ، يتم تحديد اللائحة عن طريق تحليل ميكروأري لسلالة حذف مقارنة بالسلالة من النوع البري. يكون الإجراء أكثر تعقيدًا عندما يكون النظام المكون من مكونين ضروريًا. نظرًا لأنه لا يمكن تعطيل النظام ، يجب تصميم تقنية تسمح بالتحكم في نشاط النظام المكون من عنصرين لتغيير مستويات التعبير عن النظام. النهج الأكثر وضوحًا هو إما الإفراط في التعبير عن نظام مكونين ذي أهمية أو بناء سلالة مستنفدة لمستشعر كيناز أو منظم الاستجابة (موهيدانو وآخرون، 2005). على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي الإفراط في التعبير عن بروتينات الإشارة إلى تأثيرات ثانوية وتعقيد التحليل.

صمم Howell وزملاؤه (2003) نهجًا مثيرًا للاهتمام أدى إلى تحديد توافق توافق تسلسل ربط الحمض النووي لـ B. الرقيقة YycF. استخدم هذا النهج حقيقة أن B. الرقيقة يعبر عن نظام مكون من مكونين وثيق الصلة نسبيًا بـ YycFG ، نظام PhoPR. تمت دراسة هذا النظام جيدًا بواسطة Hulett وزملائه (1996). يتم تحفيز نشاط كيناز PhoR في ظل ظروف تقييد الفوسفات (Hulett وآخرون.، 1994). يسمح إنشاء منظم استجابة هجين يتكون من مجال منظم استجابة PhoP ومجال ربط YycF DNA للتنظيم المعتمد على الفوسفات للتعبير الجيني المعتمد على YycF.

لو كانت هناك إشارة معروفة لنظام YycFG ، لكان تحديد Regulon أسهل. لسوء الحظ ، كان تحديد إشارات الإدخال للأنظمة المكونة من عنصرين صعبًا ولم يكن مباشرًا مثل تحديد النظام. في الواقع ، تظل الإشارات التي تتحكم في نشاط كيناز الهيستيدين غير معروفة لمعظم أنظمة المكونين اثنين قيد التحقيق حاليًا. مع بعض الاستثناءات ، تتوفر إشارات محددة جيدًا فقط للأنظمة المسؤولة عن استخدام مصادر المغذيات.

تم تصميم دراساتنا ، الموصوفة هنا ، للمساعدة في تحديد الإشارات التي تغذي نظام YycFG ثنائي المكون. بعض هذه الطرق ضرورية بسبب أهمية نظام YycFG ، في حين أن البعض الآخر قابل للتطبيق على نطاق واسع لدراسة العديد من الأنظمة المكونة من مكونين. بالتأكيد ، هذه الدراسات مكملة لتلك التي تحدد مخرجات نظام مكون من عنصرين وتقدم نهجًا بديلاً عند دراسة نظام جديد مكون من مكونين.


مناقشة

مراقبة جودة منتجات البروبيوتيك هي محور اهتمام العديد من المنظمات في جميع أنحاء العالم ، حيث سلطت الجمعية الأوروبية لأمراض الجهاز الهضمي والكبد والتغذية للأطفال الضوء مؤخرًا على أهمية وجود رقابة أكثر صرامة على منتجات البروبيوتيك التجارية [37]. كما هو محدد في إرشادات منظمة الأغذية والزراعة (الفاو) ومنظمة الصحة العالمية (WHO) ، لاستخدامها كبروبيوتيك ، من الضروري اعتبار الكائن الحي GRAS (معترف به عمومًا على أنه آمن) [38]. وضعت الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية (EFSA) قائمة بالعوامل البيولوجية الآمنة التي تم تعريفها على أنها QPS (الافتراض المؤهل للسلامة) لتقييم السلامة قبل طرحها في الأسواق. في عام 2018 ، نشرت وزارة الصحة الإيطالية إرشاداتها حول البروبيوتيك التي يعتبر فيها تقييم الوضع التصنيفي نقطة حاسمة لضمان سلامة الكائنات الدقيقة المستخدمة [39].

يتوسع سوق الكائنات الحية المجهرية باستمرار ويتم تطوير منتجات جديدة باستمرار. تتكون التركيبات بشكل أساسي من العصيات اللبنية أو البكتيريا المشقوقة أو مسببات البوغ أو الخميرة. في السوق العالمية للمغذيات والمستحضرات الصيدلانية ، تعتمد البروبيوتيك المحتوية على بوغ عصية النيابة. تقدم مساهمة كبيرة [6] ، وفي بعض البلدان ، لها تقاليد طويلة في الاستخدام. الجنس عصية خضعت لتغييرات تصنيفية كبيرة وتم تطوير مناهج وراثية مختلفة ومقايسات بيولوجية لتمييز أكثر من 300 نوع تنتمي إلى هذا الجنس [40 ، 41].

تحسين إجراءات تحديد البروبيوتيك عصية السلالات ضرورية لمراقبة جودة المستحضرات المحتوية على جراثيم بكتيرية. تم استخدام ثلاث طرق تعتمد على مناهج مختلفة (الكيمياء الحيوية / التمثيل الغذائي ، البروتين ، والوراثي) في هذه الدراسة لتحديد عصية السلالات الموجودة في تركيبات الكائنات الحية المجهرية. تشير نتائجنا الإجمالية إلى أن اختبار بطاقة BCL الكيميائي الحيوي كان جيدًا في تحديد جميع عصية سلالات الكائنات الحية المجهرية. تم تحديد الملوثات المعزولة من الصيغتين 9 و 10 فقط ب. كوشينينسيس بدلا من إل. مغزلي. كانت النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام MALDI-TOF MS متوافقة دائمًا مع تسلسل 16S rDNA. ومع ذلك ، كانت الدرجات التي تم الحصول عليها في بعض الأحيان أقل من القيم التي اقترحتها إرشادات الشركة المصنعة لتحديد الأنواع بشكل صحيح ، خاصة عند التعامل معها ب. coagulans سلالات [16]. ومع ذلك ، فإن التكرارات المختلفة دائمًا ما تنتج تحديدًا صحيحًا ، مما يشير إلى أنه حتى قيم الدرجات المنخفضة يمكن اعتبارها دقيقة لـ عصية الأنواع الأكثر شيوعًا الموجودة في تركيبات الكائنات الحية المجهرية.

فيما يتعلق بجودة الصيغ التي تم تحليلها ، كل المسمى عصية من الأنواع التي تم استردادها ، مع الاستثناء الوحيد للمنتج 8 الذي يتضمن ب. الرقيقة بدلا من ب. كلوسي. ومع ذلك ، لوحظ في كثير من الأحيان الكائنات الحية الدقيقة الملوثة. تحتوي الصيغ 2 و 6 و 9 و 8 على كائن ملوث واحد وحتى نوعين إضافيين تم العثور عليهما في المنتج 10. تثير هذه النتائج بعض القلق بشأن مراقبة الجودة في الإجراءات أثناء تحضير هذه التركيبات.

يبدو من الملائم اكتشاف أن معظم الملوثات المعزولة قد تتصرف كمسببات الأمراض البشرية. ب. حزاز الشكل يُعرف بشكل متزايد بأنه سبب لأمراض خطيرة مثل تجرثم الدم والتهاب الصفاق والتسمم الغذائي والتهابات العين بشكل رئيسي في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة [42-45]. إل. مغزلي، عادة ما تكون معزولة عن بيئات مختلفة ، تم الإبلاغ عنها أحيانًا كممرض انتهازي [46]. أ. بوماني هو أحد مسببات الأمراض الانتهازية في المستشفيات المسؤولة عن مجموعة واسعة من العدوى مع معدل وفيات مرتفع وواحد من أهم ستة كائنات دقيقة مقاومة للأدوية المتعددة في المستشفيات في جميع أنحاء العالم. والجدير بالذكر أن استعمار القناة الهضمية أ. بوماني وقد ثبت أنه يسبق تجرثم الدم بشكل متكرر في المرضى ذوي الحالات الحرجة [47]. ب. سيريس من المعروف جيداً أنه يسبب التسمم الغذائي بالإضافة إلى الالتهابات الموضعية والجهازية لدى البشر [42 ، 48]. ترتبط القدرة الممرضة لهذه البكتيريا بإفراز العديد من بروتينات الفوعة مثل الهيمولايسين والفوسفوليباز والسموم الثلاثية (HBL و NHE) و CytK [48-50]. اكتشاف أن ب. سيريس السلالة الواردة في الصيغة 10 لديها القدرة على إنتاج العديد من عوامل الضراوة مما يبرز أن وجود هذا العامل الممرض الغذائي في تركيبة بروبيوتيك بعيد عن كونه ذو أهمية ضئيلة.

عدد الخلايا القابلة للحياة الموجودة في تركيبة الكائنات الحية المجهرية هو أحد المؤهلات التي أوصت بها وثيقة منظمة الأغذية والزراعة ومنظمة الصحة العالمية [38]. تشير إرشادات وزارة الصحة الإيطالية إلى أن الحد الأدنى من البروبيوتيك الذي يجب أن يكون نشطًا هو 1 × 10 9 CFU يوميًا [39] نظرًا لأن انخفاض عدد الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن يحول دون الحصول على فائدة صحية فعالة. في دراستنا ، غالبًا ما لا يتوافق عدد الخلايا القابلة للحياة من الأنواع التي تم الإعلان عن احتوائها في التركيبات التي تم تحليلها مع الملصق ومتطلبات الإرشادات الإيطالية.

تعد الهوية المؤكدة للكائن الدقيق ، ليس فقط على مستوى الأنواع ، ولكن أيضًا على مستوى السلالة شرطًا أساسيًا لضمان أن المنتج التجاري سيحقق التأثير الصحي المفيد المزعوم. الكتابة الجزيئية الأكثر شيوعًا عصية الأنواع الموجودة في المنتجات الإيطالية التي تم اختبارها من الكائنات الحية المجهرية (ب. كلوسي و ب. coagulans) يشير إلى وجود سلالات مختلفة. لذلك ، لا يمكن ترجمة الفعالية المثبتة لمنتج واحد تلقائيًا إلى منتج آخر يحتوي عليه عصية محيط.

في الختام ، اثنتان فقط من الصيغ العشر التي تم تحليلها (1 و 4) تحترمان نوعًا وكميًا ما هو موجود على الملصق ، مما يشير إلى أن منتجات البروبيوتيك يجب أن تتمتع بعملية مراقبة جودة أكثر صرامة تضمن تطابق المحتويات مع ما هو موجود على الملصق. بالمناسبة ، يتم تسجيل هاتين الصيغتين فقط كمنتجات طبية وبالتالي تخضعان لضوابط جودة أكثر صرامة. فيما يتعلق بالصيغ التي تحتوي على عصية تتطلب ضوابط الجودة وجود أفراد مدربين قادرين على التعرف شكليًا على المستعمرات البكتيرية المختلفة والتقنيات الحديثة لتحديد هذه البكتيريا.


شاهد الفيديو: BACILLUS SUBTILIS (كانون الثاني 2022).