معلومة

التطور الموجه: طفرة النقطة مقابل الإدراج والحذف مقابل الخلط


عند محاولة تحسين وظيفة الإنزيم عبر Directed Evolution ، يمكنني رؤية ثلاث استراتيجيات مختلفة لتوليد التباين في تسلسل الجينات:

  1. الطفرات النقطية
  2. الإدراج / الحذف
  3. خلط

هل هناك فرق منهجي بين مدى نجاح كل من هذه الأساليب على الأرجح بالنسبة لجين معين أو بشكل عام؟ هل يختار المرء واحدًا على الأساليب الأخرى في أي مشروع محدد بناءً على أي خصائص / اختلافات في الهدف؟

سؤال ذو صلة: على صعيد منهجي ، أعلم أنه يمكن للمرء استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المعرض للخطأ للحصول على رقم 1 ، أي الطفرات النقطية.

ما هي الأساليب المماثلة للرقم 2 و # 3؟ أي كيف يتم تنفيذ خلط الجينات أو الإدراج / الحذف في الممارسة؟


بشكل عام ، يتم إدخال الطفرات النقطية في البروتينات ذات الأهمية أثناء التطور الموجه. يمكن أن تكون هذه طفرات محددة في الموقع النشط للإنزيم إذا كنت ترغب في تغيير خصوصيته نحو ركيزة جديدة ، على سبيل المثال. يمكن تقديم الطفرات النقطية باستخدام البادئات عندما تقوم بتضخيم الجين الذي يهمك. ومع ذلك ، إذا كنت لا تعرف على وجه التحديد ما هي التغييرات التي يجب إجراؤها ، فعندئذ نعم ، هناك طريقة لتوليد الطفرات عن طريق PCR عرضة للخطأ أو عن طريق التغيير السريع PCR. إذا كنت ترغب في معرفة ما إذا كان تغيير معين في الأحماض الأمينية يلغي النشاط / الاستقرار / إلخ ، فيمكنك إجراء مسح الألانين (https://en.wikipedia.org/wiki/Alanine_scanning).

لم أسمع الكثير عن إدخال عمليات الحذف أو الإدخالات للتطور الموجه. بادئ ذي بدء ، يجب أن تكون في إطار حتى لا يتغير تسلسل التشفير الكلي. عادةً ما يقوم الأشخاص بإدخال علامات حلقية على الطرف N أو C لسببين: 1) لتنقية البروتينات. 2) لزيادة قابليته للذوبان. ولكن بشكل عام ، سيؤدي إدخال الحذف إلى تغييرات غير متوقعة في البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين محل الاهتمام.

غالبًا ما يستخدم خلط الحمض النووي للتطور الموجه. هنا شكل من ورقة نيتشر [1] يصف خلط الحمض النووي. الطريقة التي يتم إجراؤها عادة هي باستخدام متماثلات التسلسل للبروتين محل الاهتمام. يمكن الحصول على الأجزاء المختلفة عن طريق تضخيم PCR وإدخال تداخلات قصيرة مع الأجزاء المجاورة. يمكن بعد ذلك تجميع الأجزاء بطرق مختلفة ، بما في ذلك تجميع جيبسون وإعادة تركيب الخميرة المتماثلة. تتمثل ميزة خلط الحمض النووي على إدخال طفرات فردية في أنه يجب عليك فحص عدد أقل من الطفرات ويمكن تحسين نشاط / استقرار البروتين عدة مئات من المرات.

شكل خلط الحمض النووي من [1]

ومن المثير للاهتمام ، أن خلط الحمض النووي باستخدام طريقة تسمى SCHEMA [2] تم تطويرها في مختبر كريس فويجت. باختصار ، SHEMA عبارة عن خوارزمية حسابية تُستخدم لتحديد أجزاء البروتينات ، أو المخططات ، التي يمكن إعادة تجميعها دون الإخلال بسلامة البنية ثلاثية الأبعاد. يعتمد على بنية ثلاثية الأبعاد (لأحد الوالدين) ومحاذاة التسلسلات الأبوية. يحسب التفاعلات بين المخلفات ويحدد عدد التفاعلات التي تعطلت في تكوين بروتين هجين. يتم تحديد نافذة المخلفات w ويتم حساب عدد التفاعلات الداخلية في هذه النافذة. يتم تمرير النافذة ويتم إنشاء ملف تعريف المخطط. على سبيل المثال. في الشكل أدناه ، عدد التفاعلات التي تم كسرها في الكيميرا المحتملة هي 0 على الوهم الأيمن و 3 على الوهم الأيسر. سيتم استخدام الوهم الصحيح في الفحص.

طريقة SHEMA من [2]


في ضوء التطور الموجه: مسارات تطور البروتين التكيفي

التطور الموجه هو إستراتيجية هندسية مستخدمة على نطاق واسع لتحسين الثبات أو الوظائف الكيميائية الحيوية للبروتينات عن طريق جولات متكررة من الطفرات والاختيار. تقدم هذه التجارب دروسًا تجريبية حول كيفية تطور البروتينات في مواجهة ضغوط الاختيار المختبرية المحددة بوضوح. كشف التطور الموجه أن طفرات الأحماض الأمينية الفردية يمكن أن تعزز خصائص مثل النشاط التحفيزي أو الاستقرار وأن التكيف يمكن أن يحدث غالبًا من خلال مسارات تتكون من طفرات مفيدة متتابعة. عندما لا توجد طفرات مفردة تعمل على تحسين بروتين معين ، فإن التجارب دائمًا ما تجد ثروة من الطفرات المحايدة فيما يتعلق بمقياس اللياقة المحدد في المختبر. يمكن لهذه الطفرات المحايدة أن تفتح مسارات تكيفية جديدة من خلال آليتين مختلفتين على الأقل. يمكن للطفرات المحايدة وظيفيًا أن تعزز استقرار البروتين ، وبالتالي تزيد من تحمله للطفرات المفيدة وظيفيًا والطفرات المزعزعة للاستقرار. يمكن أن تؤدي أيضًا إلى تغييرات في الوظائف "المختلطة" التي لا تخضع حاليًا لضغط انتقائي ، ولكن يمكن أن تصبح فيما بعد نقاط البداية للتطور التكيفي للوظائف الجديدة. تقدم هذه الدروس حول الاقتران بين تطور البروتين المتكيف والمحايد في المختبر نظرة ثاقبة لتطور البروتينات في الطبيعة.

البروتينات هي أحصنة العمل الجزيئي في علم الأحياء ، وهي مسؤولة عن تنفيذ مجموعة هائلة من الوظائف البيوكيميائية الأساسية. إن وجود البروتينات التي يمكنها أداء مثل هذه المهام المتنوعة هو شهادة على قوة التطور ، وفهم القوى التي تشكل تطور البروتين كان هدفًا طويل الأمد لعلم الأحياء التطوري. في الآونة الأخيرة ، أصبح أيضًا موضوعًا محل اهتمام المهندسين البيولوجيين ، الذين يسعون إلى تكييف البروتينات لمجموعة متنوعة من التطبيقات الطبية والصناعية من خلال محاكاة التطور. على الرغم من أنهم يقتربون من دراسة تطور البروتين من وجهات نظر مختلفة وبأهداف نهائية مختلفة ، إلا أن علماء الأحياء التطورية والمهندسين الحيويين مهتمون بالعديد من الأسئلة العريضة نفسها.

عند فحص هذه الأسئلة ، نبدأ بالنظر في الأهمية المستمرة لأحد التحليلات الأولى لتطور البروتين ، والتي أجراها الكيميائي العظيم لينوس بولينج وزميله إميل زوكيركاندل منذ 40 عامًا (1). أثناء العمل في الوقت الذي أصبح فيه الحصول على متواليات الأحماض الأمينية ممكنًا لأول مرة ، قام Pauling و Zuckerkandl بتجميع تسلسل بروتينات الهيموغلوبين والميوغلوبين من مجموعة من الأنواع. قارنوا التسلسلات بعين نحو تحديد التغيرات الجزيئية التي رافقت الاختلاف التطوري لهذه الأنواع. ولكن على الرغم من أنه كان معروفًا بالفعل [جزئيًا من عمل بولينج السابق حول فقر الدم المنجلي (2 ، 3)] أنه حتى طفرة واحدة يمكن أن تغير وظيفة الهيموجلوبين ، فإن عدد البدائل المتراكمة بدا أكثر انعكاسًا لمقدار الوقت التطوري المنقضي أكثر من أي وقت مضى. قياس التغيير الوظيفي. كتب بولينج وزوكيركاندل تلخيصًا لأبحاثهما (1) ، ولعل أهم اعتبار هو ما يلي. لا يوجد سبب لتوقع أن مدى التغيير الوظيفي في سلسلة البولي ببتيد يتناسب مع عدد بدائل الأحماض الأمينية في السلسلة. قد تؤدي العديد من هذه البدائل إلى تغيير وظيفي ضئيل نسبيًا ، بينما في أوقات أخرى قد يؤدي استبدال بقايا حمض أميني واحد بآخر إلى تغيير وظيفي جذري. بالطبع ، الجانبان ليسا غير مرتبطين ، لأن التأثير الوظيفي لاستبدال واحد سيعتمد في كثير من الأحيان على وجود أو عدم وجود عدد من البدائل الأخرى. يسلط هذا المقطع الضوء على قضيتين رئيسيتين ما زالتا تشغلان الباحثين بعد نصف قرن تقريبًا. أولاً ، تتطور البروتينات الطبيعية من خلال مزيج من الانجراف الجيني المحايد والبدائل المختارة وظيفيًا. على الرغم من أنه من المحتمل أن يعترف كل عالم أحياء تطوري بوجود كلا النوعين من البدائل ، إلا أن انتشارهما النسبي يناقش في كثير من الأحيان بشدة مذهلة (4 ، 5). يعود سبب صعوبة هذا النقاش في جزء كبير منه إلى صعوبة التحديد بأثر رجعي ما إذا كانت الاستبدالات القديمة تخضع لضغوط انتقائية.

المسألة الثانية التي أبرزها Pauling و Zuckerkandl ، وهي إمكانية اعتماد تأثير الطفرة التكيفية على وجود طفرات أخرى غير قابلة للتكيف ، كان موضوع نقاش كبير بين مهندسي البروتين (6 –8). والسبب هو أن وجود الاقتران المعرفي بين الطفرات لديه القدرة على التأثير بعمق على نجاح استراتيجيات تحسين البروتين. في حالة عدم وجود epistasis ، يمكن دائمًا تحسين البروتين من خلال نهج بسيط لتسلق التلال ، حيث تتحرك كل طفرة مفيدة متتالية في المسار نحو هدف مرغوب فيه. لكن مثل هذا النهج لتسلق التلال يمكن من حيث المبدأ أن يربكه النزيف ، لأن الخطوات المفضلة بشكل انتقائي "صعودًا" (طفرات مفيدة) قد لا تكون ممكنة إلا بعد عدة خطوات "جانبية" أو "منحدرة" (طفرات محايدة أو ضارة).

على مدى العقد الماضي ، أجرى مهندسو البروتين مئات من تجارب التطور الموجهة لتحسين الخصائص مثل النشاط التحفيزي ، أو تقارب الارتباط ، أو الاستقرار (9 - 11). تقدم نتائج هذه التجارب نظرة ثاقبة للمسارات المحتملة لتطور البروتين التكيفي والتفاعل بين الطفرات التكيفية والمتحايدة. في القسم التالي ، نصف كيف يتم تنفيذ تجربة التطور الموجه النموذجية. ثم نقدم مثالًا محددًا لكيفية تطبيق التطور الموجه بنجاح على إنزيم السيتوكروم P450. بالاعتماد على هذا المثال وثروة من الأعمال الأخرى ، نقوم بعد ذلك بالتعميم لاستخلاص ما نعتبره ثلاثة من الدروس التجريبية الرئيسية من التطور الموجه. أخيرًا ، نناقش كيف يمكن أن تساعد هذه الدروس في فهم تطور البروتين الطبيعي.


ملخص

التطور الموجه هو استراتيجية قوية لتحسين وظائف البروتينات. من خلال توليد آلاف المتغيرات ، يستخدم التطور الموجه فحصًا عالي الإنتاجية للوصول إلى أفضل حل عندما تكون الوظيفة البيولوجية غامضة أو عندما تكون المعرفة الكيميائية حول الركيزة وبنية البروتين محدودة. أتاح التطور الموجه إنتاج العديد من البروتينات المهندسة ، بما في ذلك أيزومرات نقية من المستحضرات الصيدلانية والبروتينات لتطبيقات علوم الحياة الهامة. من خلال توفير الوقت المستغرق السريع لتوليد بروتينات جديدة من خلال التطور الموجه ، من المرجح أن تستمر البروتينات والإنزيمات المهندسة في التأثير بشكل كبير في تعزيز فهمنا للعديد من العمليات البيولوجية والتحفيز الحيوي. 14


حذف متحولة - تطور - (أغسطس / 20/2012)

Pito: يحدث خلط الجينوم في الطبيعة: إعادة التركيب V (D) J هو خلط الحمض النووي ، وهذه هي الطريقة التي يصنع بها جسمك الأجسام المضادة من خلال الجمع بين الأليلات في موقع MHC من الفئة I علاوة على ذلك في الخطوة التالية ، يطور جسمك الأجسام المضادة المنتجة بواسطة epPCR - مثل العملية التي تستخدم كلتا الطريقتين عن طريق التطور الموجه التي تحدث في جسمك بعد 4 أيام من الإصابة بفيروس.

الهدف من epPCR هو أنه يعيد في الواقع إنشاء نفس الطفرات / الأخطاء المحتملة التي تحدثها بوليميرات الحمض النووي في البكتيريا. هناك أطنان من الأوراق البحثية التي تحسب احتمالات بعض التحولات / التحولات والنقاط الساخنة للطفرات وهي متشابهة إلى حد كبير بغض النظر عن البوليميراز الذي تستخدمه. إذن ما تحصل عليه في أنبوب الاختبار هو ما تنتجه الطبيعة في ملايين السنين. هذا هو سبب تعريف التطور الموجه بأنه التطور الطبيعي سريع التقديم في أنبوب الاختبار. (يستخدم بعض الناس هذه العبارة المبتذلة مرارًا وتكرارًا في مجال التطور الموجه)

prabhubct: إذا كنت ترغب في قراءة المزيد عن التطور الموجه: http: //www.sesam-bio. ected-Evolution مراجعة جيدة جدًا لحالة الفن منذ 2-3 سنوات (كتبتها: P) كما أنها تحتوي على إشارات إلى المواد التي وجهت المتوازيات التطور إلى التطور الطبيعي.


@ asacioc كما قلت & # 39 & # 39 إذن ما تحصل عليه في أنبوب الاختبار هو ما تنتجه الطبيعة في ملايين السنين. لهذا السبب يُعرَّف التطور الموجه بأنه تطور طبيعي سريع التوجيه في أنبوب اختبار. & # 39 & # 39 هل يمكن أن يكون تطورًا طبيعيًا سريعًا؟

بيتو في الأربعاء 22 آب (أغسطس) 20:04:47 2012 قال:

ascacioc في الأربعاء 22 أغسطس 19:06:14 قال:

Pito: يحدث خلط الجينوم في الطبيعة: إعادة التركيب V (D) J هو خلط الحمض النووي ، وهذه هي الطريقة التي يصنع بها جسمك الأجسام المضادة من خلال الجمع بين الأليلات في موقع MHC من الفئة I علاوة على ذلك في الخطوة التالية ، يطور جسمك الأجسام المضادة المنتجة بواسطة epPCR - مثل العملية التي تستخدم كلتا الطريقتين من خلال التطور الموجه التي تحدث في جسمك بعد 4 أيام من الإصابة بفيروس.

الهدف من epPCR هو أنه يعيد في الواقع إنشاء نفس الطفرات / الأخطاء المحتملة التي تحدثها بوليميرات الحمض النووي في البكتيريا. هناك أطنان من الأوراق البحثية التي تحسب احتمالات بعض التحولات / التحولات والنقاط الساخنة للطفرات وهي متشابهة إلى حد كبير بغض النظر عن البوليميراز الذي تستخدمه. إذن ما تحصل عليه في أنبوب الاختبار هو ما تنتجه الطبيعة في ملايين السنين. هذا هو سبب تعريف التطور الموجه بأنه التطور الطبيعي سريع التقديم في أنبوب الاختبار. (يستخدم بعض الناس هذه العبارة المبتذلة مرارًا وتكرارًا في مجال التطور الموجه)

prabhubct: إذا كنت ترغب في قراءة المزيد عن التطور الموجه: http: //www.sesam-bio. ected-Evolution مراجعة جيدة جدًا لحالة الفن منذ 2-3 سنوات (كتبتها: P) كما أنها تحتوي على إشارات إلى المواد التي وجهت المتوازيات التطور إلى التطور الطبيعي.

بالطبع يحدث التغيير الجيني في الطبيعة ، ولكن هناك فرق بين ما تسميه خلط الجينوم الذي يحدث في الطبيعة (يوجد نظام وراءه ، وأنا أتحدث عن إعادة تركيب VDJ الآن) وخلط الجينوم الذي نقوم به في المختبر.

وأنا لا أتفق مع ما قلته هنا ، من "المخاطرة" بعض الشيء أن أذكرها على هذا النحو: "يطور جسمك الأجسام المضادة المنتجة من خلال عملية شبيهة بـ epPCR ، وكلا الطريقتين المستخدمتين من خلال التطور الموجه يحدث في جسمك بعد 4 أيام من الإصابة بـ فيروس"
هذا ليس صحيحا تماما.
إن الجسد لا "يتطور" مثلما تقوله أنت.
يحتوي الجسم بالفعل على مجموعة من الأجسام المضادة الموجودة ، من خلال الحظ الخالص ، يصادف عدد قليل من تلك الأجسام التي تربط المستضد ، لأنهم يفعلون ذلك ، سيتم تفضيلهم والأخرى التي لا تلتزم لن (أو أقل) من خلال إثرائها (إعادة تكوينها) بواسطة هيئة. وهذا ما يسمى تقارب النضج للأجسام المضادة. يحدث هذا لأن الخلايا البائية التي تحتوي على أفضل مستقبلات الارتباط ستربط المولد وسيتم اختيارها (وتبقى على قيد الحياة / تتكاثر وتمرر جيناتها) لأنها قادرة على ربط الخلايا المتغصنة المسامية (تلك ستربط المستضد ، لذا فإن B الخلايا تربط غير مؤكد) هذه هي الطريقة التي يحدث بها النضج التقارب وكيف يعمل "تطور" المستضدات. ونعم ، بسبب الطفرات البسيطة في تلك الخلايا ، ستنشئ أيضًا خلايا أفضل في النهاية. لكن الأمر يختلف قليلاً عن مجرد ذكر ما قلته.


ولكن في البداية: كل العمليات العشوائية ، جسدك "يخلق" أجسامًا مضادة عشوائية عن طريق إعادة تركيب VDJ (عشوائي ولكن بنظام معين).

هذا مختلف تمامًا عن خلط الجينوم الذي تتحدث عنه. في خلط الجينوم ، تقوم بقطع الحمض النووي وإنشاء قطع جديدة عشوائية من الحمض النووي عن طريق تمديدها مرة أخرى ، وربطها.
+ خلط الجينوم ثم مقارنته بـ VDJ .. غريب بعض الشيء حيث كنت أتحدث عن البكتيريا ، لكن ربما لم أذكر هذا بوضوح كاف.
في البكتيريا لا يوجد شيء مثل إعادة تركيب VDJ.
ولا أرغب في ربط الأنظمة التي نستخدمها في البكتيريا / الخميرة للأنظمة / الجينات البشرية أو الحيوانية.

أيضًا: يمكن بالفعل استخدام epPCR كأداة لدراسة ما يحدث للبكتيريا / الخميرة على سبيل المثال ويمكنك بالفعل تسميتها التطور السريع ، لكنها لا تمثل حقًا 100٪ ما يحدث في الطبيعة.
إنها مجرد أداة لإحداث طفرة ، لا أكثر.
ونعم ، يمكنك القول أن هذه الطفرة (أو بعضها) ستحدث بالفعل في الطبيعة ، لكن الطبيعة أكثر تعقيدًا بكثير.

أيضًا: ربط خلط الجينوم و epPCR هو جسر بعيد جدًا بالنسبة لي.
يتم التحكم في epPCR بشكل أكبر بينما يكون خلط الجينوم (أو يمكن أن يكون) أقل تحكمًا ويمكنك الحصول على نتائج أكثر غرابة.
أخيرًا ، في النهاية يتعلق الأمر بكيفية تعريفك لأشياء معينة.

وأيضًا ، وقلت ذلك بنفسك: يطلق عليه التطور "الموجه" ، هذا فقط: نحن (الباحثون) نوجه التطور .. لا يمكنك ببساطة أن تقول: آه ، هذا ما سيحدث في الطبيعة.
من السهل بعض الشيء أن أذكر ذلك.

ما تصنعه في المختبر ، لن أسميه تطورًا. أود أن أسميها: ملاحظة للتغيرات في الحمض النووي التي تسبب تأثيرًا معينًا (مُلاحظ / مُقاس) ، والذي في النهاية يمكن أن يكون بالفعل تمثيلًا لتطور معين (محتمل).
عليك أن تضع في اعتبارك أن العديد مما يسمى "التطورات" التي تسببها تقنيات التطور المباشر لن تعيش في الطبيعة أو تظل متطورة على هذا النحو لأننا نريد هذا التطور ونستمر فيه ، بينما في الطبيعة قد نكون "أغبياء" و غير مرغوب فيه وبالتالي تضيع في النهاية.

لكن هذا أكثر عن الدلالات.

لكن لا توافق على "يُعرَّف التطور الموجه بأنه تطور طبيعي سريع التقديم في أنبوب اختبار" لأن هذا ليس صحيحًا بالنسبة لي. الكثير مما يسمى "التطور المباشر" ليس تطورات يمكن أن تحدث في الطبيعة.

شكرا.
@ pito: كما قلت & # 39 & # 39 ، يمكن بالفعل استخدام epPCR كأداة لدراسة ما يحدث للبكتيريا / الخميرة على سبيل المثال ويمكنك بالفعل تسميتها التطور السريع ، لكنها لا تمثل حقًا 100٪ ما يحدث في الطبيعة. . & # 39 & # 39 أنا أتفق معك لأن التطور الموجه لا يمكن أن يمثل 100 ٪ من الطبيعة. لكنها تمثل بعض القيمة الاحتمالية للتطور إذا أردنا أن نؤمن بالانتقال ، والانعكاس ، وإعادة التركيب كوسيلة للتطور.

prabhubct في الخميس 23 أغسطس 05:58:08 2012 قال:

بيتو في الأربعاء 22 آب (أغسطس) 20:04:47 2012 قال:

ascacioc في الأربعاء 22 أغسطس 19:06:14 قال:

Pito: يحدث خلط الجينوم في الطبيعة: إعادة التركيب V (D) J هو خلط الحمض النووي ، وهذه هي الطريقة التي يصنع بها جسمك الأجسام المضادة من خلال الجمع بين الأليلات في موقع MHC من الفئة I علاوة على ذلك في الخطوة التالية ، يطور جسمك الأجسام المضادة المنتجة بواسطة epPCR - مثل العملية التي تستخدم كلتا الطريقتين عن طريق التطور الموجه التي تحدث في جسمك بعد 4 أيام من الإصابة بفيروس.

الهدف من epPCR هو أنه يعيد في الواقع إنشاء نفس الطفرات / الأخطاء المحتملة التي تحدثها بوليميرات الحمض النووي في البكتيريا. هناك أطنان من الأوراق البحثية التي تحسب احتمالات بعض التحولات / التحولات والنقاط الساخنة للطفرات وهي متشابهة إلى حد كبير بغض النظر عن البوليميراز الذي تستخدمه. إذن ما تحصل عليه في أنبوب الاختبار هو ما تنتجه الطبيعة في ملايين السنين. هذا هو سبب تعريف التطور الموجه بأنه التطور الطبيعي سريع التقديم في أنبوب الاختبار. (يستخدم بعض الناس هذه العبارة المبتذلة مرارًا وتكرارًا في مجال التطور الموجه)

prabhubct: إذا كنت ترغب في قراءة المزيد عن التطور الموجه: http: //www.sesam-bio. ected-Evolution مراجعة جيدة جدًا لحالة الفن منذ 2-3 سنوات (كتبتها: P) كما أنها تحتوي على إشارات إلى المواد التي وجهت الموازاة التطور إلى التطور الطبيعي.

بالطبع يحدث التغيير الجيني في الطبيعة ، ولكن هناك فرق بين ما تسميه خلط الجينوم الذي يحدث في الطبيعة (يوجد نظام وراءه ، وأنا أتحدث عن إعادة تركيب VDJ الآن) وخلط الجينوم الذي نقوم به في المختبر.

وأنا لا أتفق مع ما قلته هنا ، من "المخاطرة" بعض الشيء أن أذكرها على هذا النحو: "يطور جسمك الأجسام المضادة المنتجة من خلال عملية تشبه epPCR ، وكلا الطريقتين المستخدمتين من خلال التطور الموجه يحدث في جسمك بعد 4 أيام من الإصابة بـ فيروس"
هذا ليس صحيحا تماما.
إن الجسد لا "يتطور" مثلما تقوله أنت.
يحتوي الجسم بالفعل على مجموعة من الأجسام المضادة الموجودة ، من خلال الحظ الخالص ، يصادف عدد قليل من تلك الأجسام التي تربط المستضد ، لأنهم يفعلون ذلك ، سيتم تفضيلهم والأخرى التي لا تلتزم لن (أو أقل) من خلال إثرائها (إعادة تكوينها) بواسطة هيئة. وهذا ما يسمى تقارب النضج للأجسام المضادة. يحدث هذا لأن الخلايا البائية التي تحتوي على أفضل مستقبلات الارتباط ستربط المولد وسيتم اختيارها (وتبقى على قيد الحياة / تتكاثر وتمرر جيناتها) لأنها قادرة على ربط الخلايا المتغصنة المسامية (تلك ستربط المستضد ، لذا فإن B الخلايا تربط غير مؤكد) هذه هي الطريقة التي يحدث بها النضج التقارب وكيف يعمل "تطور" المستضدات. ونعم ، بسبب الطفرات البسيطة في تلك الخلايا ، ستنشئ أيضًا خلايا أفضل في النهاية. لكن الأمر يختلف قليلاً عن مجرد ذكر ما قلته.


ولكن في البداية: كل العمليات العشوائية ، جسدك "يخلق" أجسامًا مضادة عشوائية عن طريق إعادة تركيب VDJ (عشوائي ولكن بنظام معين).

هذا مختلف تمامًا عن خلط الجينوم الذي تتحدث عنه. في خلط الجينوم ، تقوم بقطع الحمض النووي وإنشاء قطع جديدة عشوائية من الحمض النووي عن طريق تمديدها مرة أخرى ، وربطها.
+ خلط الجينوم ثم مقارنته بـ VDJ .. غريب بعض الشيء حيث كنت أتحدث عن البكتيريا ، لكن ربما لم أذكر هذا بوضوح كافٍ.
في البكتيريا لا يوجد شيء مثل إعادة تركيب VDJ.
ولا أرغب في ربط الأنظمة التي نستخدمها في البكتيريا / الخميرة للأنظمة / الجينات البشرية أو الحيوانية.

أيضًا: يمكن بالفعل استخدام epPCR كأداة لدراسة ما يحدث للبكتيريا / الخميرة على سبيل المثال ويمكنك بالفعل تسميتها التطور السريع ، لكنها لا تمثل حقًا 100٪ ما يحدث في الطبيعة.
إنها مجرد أداة لإحداث طفرة ، لا أكثر.
ونعم ، يمكنك القول أن هذه الطفرة (أو بعضها) ستحدث بالفعل في الطبيعة ، لكن الطبيعة أكثر تعقيدًا بكثير.

أيضًا: ربط خلط الجينوم و epPCR هو جسر بعيد جدًا بالنسبة لي.
يتم التحكم في epPCR بشكل أكبر بينما يكون خلط الجينوم (أو يمكن أن يكون) أقل تحكمًا ويمكنك الحصول على نتائج أكثر غرابة.
أخيرًا ، في النهاية يتعلق الأمر بكيفية تعريفك لأشياء معينة.

وأيضًا ، وقلت ذلك بنفسك: إنه يسمى التطور "الموجه" ، هذا فقط: نحن (الباحثون) نوجه التطور .. لا يمكنك ببساطة أن تقول: آه ، هذا ما سيحدث في الطبيعة.
من السهل بعض الشيء أن أذكر ذلك.

ما تصنعه في المختبر ، لن أسميه تطورًا. أود أن أسميها: ملاحظة للتغيرات في الحمض النووي التي تسبب تأثيرًا معينًا (مُلاحظ / مُقاس) ، والذي في النهاية يمكن أن يكون بالفعل تمثيلًا لتطور معين (محتمل).
عليك أن تضع في اعتبارك أن العديد مما يسمى "التطورات" التي تسببها تقنيات التطور المباشر لن تعيش في الطبيعة أو تظل متطورة على هذا النحو لأننا نريد هذا التطور ونستمر فيه ، بينما في الطبيعة قد نكون "أغبياء" و غير مرغوب فيه وبالتالي تضيع في النهاية.

لكن هذا أكثر عن الدلالات.

لكن لا توافق على "يُعرَّف التطور الموجه بأنه تطور طبيعي سريع التقديم في أنبوب اختبار" لأن هذا ليس صحيحًا بالنسبة لي. الكثير مما يسمى "التطور المباشر" ليس تطورات يمكن أن تحدث في الطبيعة.

شكرا.
@ pito: كما قلت & # 39 & # 39 ، يمكن بالفعل استخدام epPCR كأداة لدراسة ما يحدث للبكتيريا / الخميرة على سبيل المثال ويمكنك بالفعل تسميتها التطور السريع ، لكنها لا تمثل حقًا 100٪ ما يحدث في الطبيعة. . & # 39 & # 39 أنا أتفق معك لأن التطور الموجه لا يمكن أن يمثل 100 ٪ من الطبيعة. لكنها تمثل بعض القيمة الاحتمالية للتطور إذا أردنا أن نؤمن بالانتقال ، والانعكاس ، وإعادة التركيب كوسيلة للتطور.


نعم ، إنها تمثل بعض الاحتمالات.
هذه هي الفكرة الكامنة وراءها ، لكن يجب ألا تنسى أبدًا ما تفعله حقًا مقارنة بالتطور

prabhubct في الخميس أغسطس 23 05:52:13 2012 قال:

ascacioc في الأربعاء 22 أغسطس 19:06:14 قال:

Pito: يحدث خلط الجينوم في الطبيعة: إعادة التركيب V (D) J هو خلط الحمض النووي ، وهذه هي الطريقة التي يصنع بها جسمك الأجسام المضادة من خلال الجمع بين الأليلات في موقع MHC من الفئة I علاوة على ذلك في الخطوة التالية ، يطور جسمك الأجسام المضادة المنتجة بواسطة epPCR - مثل العملية التي تستخدم كلتا الطريقتين من خلال التطور الموجه التي تحدث في جسمك بعد 4 أيام من الإصابة بفيروس.

الهدف من epPCR هو أنه يعيد في الواقع إنشاء نفس الطفرات / الأخطاء المحتملة التي تحدثها بوليميرات الحمض النووي في البكتيريا. هناك أطنان من الأوراق البحثية التي تحسب احتمالات بعض التحولات / التحولات والنقاط الساخنة للطفرات وهي متشابهة إلى حد كبير بغض النظر عن البوليميراز الذي تستخدمه. إذن ما تحصل عليه في أنبوب الاختبار هو ما تنتجه الطبيعة في ملايين السنين. هذا هو سبب تعريف التطور الموجه بأنه التطور الطبيعي سريع التقديم في أنبوب الاختبار. (يستخدم بعض الناس هذه العبارة المبتذلة مرارًا وتكرارًا في مجال التطور الموجه)

prabhubct: إذا كنت ترغب في قراءة المزيد عن التطور الموجه: http: //www.sesam-bio. ected-Evolution مراجعة جيدة جدًا لحالة الفن منذ 2-3 سنوات (كتبتها: P) كما أنها تحتوي على إشارات إلى المواد التي وجهت المتوازيات التطور إلى التطور الطبيعي.


@ asacioc كما قلت & # 39 & # 39 إذن ما تحصل عليه في أنبوب الاختبار هو ما تنتجه الطبيعة في ملايين السنين. لهذا السبب يُعرَّف التطور الموجه بأنه تطور طبيعي سريع التوجيه في أنبوب اختبار. & # 39 & # 39 هل يمكن أن يكون تطورًا طبيعيًا سريعًا؟

أنت فقط تسبب الطفرات ، إلى الوراء أو إعادة التوجيه .. من يدري.

انها قليلا أكثر تعقيدا. لكننا نتحدث عن البكتيريا هنا ، لذلك لا يوجد دليل حقيقي عما إذا كنا نتقدم إلى الوراء. محاولة تحديد ما هو خلفي وما بعد .. ليس بهذه السهولة في ظروف معينة.

رائع. حدث الكثير هنا أثناء وجودي في المختبر. بضع كلمات فقط إلى أول مشاركة بعد مشاركتي:
التحور الجسدي المفرط هو epPCR: في النظام الليمفاوي ، يكون معدل الطفرة أعلى بمقدار 10 ^ 6 من الخلايا الطبيعية epPCR وهو تضخيم بمعدل طفرة مرتفع. وهذه ليست دلالات.
أعطيك هذا على الأقل: في الواقع إعادة تركيب VDJ هو نظام مختلف تمامًا عن خلط الحمض النووي. على الرغم من إمكانية استخلاص المتوازيات.
يتم التحكم في كل من خلط الحمض النووي و epPCR: الآن ، إذا كنت تستخدم خلط الجينوم على سبيل المثال لا ستامر (أول بروتوكول تم نشره على الإطلاق) ، فلا يمكنك التحكم فيه بالفعل ، ولكن البروتوكولات الحديثة لكل من epPCR وخلط الحمض النووي تتميز بشكل جيد للغاية ويمكنك التنبؤ بما تريده. لديك في النهاية في أنابيب الاختبار. هناك برامج وخوارزميات / نصوص تقوم بذلك نيابة عنك. عملت على تطوير بعض نفسي خلال أطروحة الماجستير. وكان هناك شيء جيد بشكل غير متوقع في إخباري بما يحصل عليه بعض الأشخاص الآخرين في أنابيب الاختبار الخاصة بهم مما يعني أنه لم يكن لدينا الكثير من الأشياء التي لا يمكن السيطرة عليها والتي تحدث في أنبوب الاختبار (كما اعتقدت في بداية أسياد عندما كنت مثلك: من ناحية أخرى يمكنك التحكم فيه)
لم أقم بربط خلط الحمض النووي و epPCR أكثر من البروتوكولين الأساسيين المستخدمين في التطور الموجه. هم مختلفون تماما
بالطبع هذا ما نسميه التطور الموجه في الأنبوب لن يحدث في الطبيعة: يعتمد على مكان وجود الضغط الانتقائي. أعني: إذا قمت بتطوير الجلوكوز أوكسيديز على سبيل المثال ليكون أكثر نشاطًا لاستخدامه في وقود حيوي (مشروع حقيقي يعمل فيه الأشخاص بالفعل) فلن تحصل على نفس الأشياء كما في الطبيعة لأنك بينما تقوم بتخفيض الكيلومتر وتصنع kcat أعلى من خلال التطور الموجه لغرضك ، ربما في الحياة الواقعية ليس من الجيد لهذا الإنزيم أن يستهلك في جزء من الثانية كل الجلوكوز في الكائن الحي ويطلق H2O2 مثل أطنان منه في نفس الجزء من الثانية لأن الكائن الحي سوف يتضورون جوعا ويقتلون بسبب السمية على الفور. ومع ذلك ، لا يهم أين تضع ضغط الاختيار: إذا اخترت ضغط اختيار ذكي للحفاظ على الطفرات الجيدة التي تعود بالفائدة على الكائن الحي ، يمكنك محاكاة التطور.

وحول عدم الموافقة على هذه الجملة: حسنًا ، أنت لا توافق على مجال بأكمله.

prabhubct: الترجيع السريع: لا أعرف كيف سيعمل ضغط الاختيار على شيء سريع إلى الوراء. أنا أعرف فقط كيفية تحسين الأشياء ، وليس كيفية جعلها أسوأ

ascacioc في الخميس 23 أغسطس 21:43:09 2012 قال:

رائع. حدث الكثير هنا أثناء وجودي في المختبر. بضع كلمات فقط إلى أول مشاركة بعد مشاركتي:
التحور الجسدي المفرط هو epPCR: في النظام الليمفاوي ، يكون معدل الطفرة أعلى بمقدار 10 ^ 6 من الخلايا الطبيعية epPCR وهو تضخيم بمعدل طفرة مرتفع. وهذه ليست دلالات.
أعطيك هذا على الأقل: في الواقع إعادة تركيب VDJ هو نظام مختلف تمامًا عن خلط الحمض النووي. على الرغم من إمكانية استخلاص المتوازيات.
يتم التحكم في كل من خلط الحمض النووي و epPCR بشكل كبير: الآن ، إذا كنت تستخدم خلط الجينوم a la Stamer (أول بروتوكول تم نشره على الإطلاق) ، فلن تتمكن بالفعل من التحكم فيه ، ولكن البروتوكولات الحديثة لكل من epPCR وخلط الحمض النووي تتميز بشكل جيد للغاية ويمكنك التنبؤ بما تريده. لديك في النهاية في أنابيب الاختبار. هناك برامج وخوارزميات / نصوص تقوم بذلك نيابة عنك. عملت على تطوير بعض نفسي خلال أطروحة الماجستير. وكان هناك شيء جيد بشكل غير متوقع في إخباري بما يحصل عليه بعض الأشخاص الآخرين في أنابيب الاختبار الخاصة بهم مما يعني أنه لم يكن لدينا الكثير من الأشياء التي لا يمكن السيطرة عليها والتي تحدث في أنبوب الاختبار (كما اعتقدت في بداية أسياد عندما كنت مثلك: من ناحية أخرى يمكنك التحكم فيه)
لم أقم بربط خلط الحمض النووي و epPCR أكثر من البروتوكولين الأساسيين المستخدمين في التطور الموجه. هم مختلفون تماما
بالطبع هذا ما نسميه التطور الموجه في الأنبوب لن يحدث في الطبيعة: يعتمد على مكان وجود الضغط الانتقائي. أعني: إذا قمت بتطوير الجلوكوز أوكسيديز على سبيل المثال ليكون أكثر نشاطًا لاستخدامه في وقود حيوي (مشروع حقيقي يعمل فيه الناس بالفعل) فلن تحصل على نفس الأشياء كما هو الحال في الطبيعة لأنك بينما تقوم بتخفيض الكيلومتر وتصنع kcat أعلى من خلال التطور الموجه لغرضك ، ربما في الحياة الواقعية ليس من الجيد لهذا الإنزيم أن يستهلك في جزء من الثانية كل الجلوكوز في كائن حي ويطلق H2O2 مثل أطنان منه في نفس الجزء من الثانية لأن الكائن الحي سوف يتضورون جوعا ويقتلون بسبب السمية على الفور. ومع ذلك ، لا يهم أين تضع ضغط الاختيار: إذا اخترت ضغط اختيار ذكي للحفاظ على الطفرات الجيدة التي تعود بالفائدة على الكائن الحي ، يمكنك محاكاة التطور.

وحول عدم الموافقة على هذه الجملة: حسنًا ، أنت لا توافق على مجال بأكمله.

prabhubct: الترجيع السريع: لا أعرف كيف سيعمل ضغط الاختيار على شيء سريع إلى الوراء. أنا أعرف فقط كيفية تحسين الأشياء ، وليس كيفية جعلها أسوأ

أنت على حق ، خطأي.

لقد أخطأت في قراءة رسالتك الأولى وكنت أتحدث أكثر عما حدث قبل الطفرة.

إنه بالفعل كما قلت: يبدأ هذا بعد ارتباط المستضدات ، لكن المستقبلات نفسها (الأولى) تكون جاهزة في ذلك الوقت. كنت أفكر في أنك قمت بالإجراءات بأكملها منذ البداية وهو بالطبع ليس صحيحًا.

ملاحظة: لقد ذكرت أنني لا أتفق مع مجال بأكمله ، ولا أعرف ما إذا كنت متخصصًا في علم المناعة ، ولكن إذا كنت أنت ، فيجب أن تعلم أنه حتى لم يوافقوا تمامًا ، فلا يزال هناك الكثير من علامات الاستفهام في هذا المجال المحدد حقل. انه مجال جديد جدا. بالرغم من أنهما يبدو أنهما متفقان على الإجراءات ، ولكن كيف يحدث ذلك بالضبط وما إلى ذلك ، لا يزال النقاش مستمرًا.

هذا فقط: إما أن تتحكم فيه ثم لا تعمل حقًا مع التطور ، لأن التطور لا يتم التحكم فيه على الإطلاق .. (على الأقل ليس على المستوى الذي يتحكم فيه الناس في أنابيب الاختبار أثناء هذا النوع من التجارب). أو لا يمكنك التحكم فيه وتقوم بخلط عشوائي تمامًا ومن ثم لا يوجد ارتباط بالتطور على الإطلاق لأنك تقوم بخلطه بطريقة أكثر من الطبيعة.

الشيء هو: يمكنك التحكم فيه لأنك تحدد قيمًا معينة بنفسك في البداية & # 33 تبدأ في التحكم فيه بنفسك. ليس هذا ما تسميه التطور.
You pick the strains, you pick enzymes (sometimes, or more often then not, they work with restriction enzymes not even natural to the organisms), you pick the working temp, the media, . you control a lot of the parameters.
BTW: the entire discussion here is nothing more then what physicist (and biologists) are debating for yours: chaostheory, randomness etc
Or on a footnot: what religious people are also stating.

Also, I like what you said about "evolving", but this sentence kinda breaks it down:

All you can do is mimick what you think happens in nature, you define those boundaries.. A lot of "you" here and not a lot of "nature".

A lot of the work done on micro-organisms in the field of "evolution" is not really following the debate about what evolution now really is. The definition of evolution is changing almost every 10 years and even when people (like you?) speak about fast foward evolution in bacteria/yeast, we arent even able to correctly link protists based on evolutionary mutations etc.
All we do in the lab is cause mutations to occur , have genes rearranged , check for "better" organisms we can use or "new" organims and then we call this evolution. There are papers out there describing the "evolution" of a bacterium towards a better bacterium to bio-degrade some toxicA, is this really evolution? Is putting genes from yeast 1 in bacterium 4 and then caling this evolution really correct?
Dont forget that in many shuffeling experiments you mix genes from different yeasts .
Or you push the organisms towards a certain evolution.. like you allready said: you select based on what you (we) want. weird view of evolution to be honest.
Your sentence said it, it makes my point:

@prabhubct: fast-backwarding: I do not know how the selection pressure would work to fast backward something. I only know how to improve stuff, not how to make them worse

You only know how to improve stuff.. not to make them worse.. well there you go. evolution doesnt work like that at all.
what we call improving is based on our needs, and the definition of making things worse is also based on our standards. Dont forget that in the history of evolution a lot of the so called "bad" evolutions turned out to be good.

Evolution seems to be a very wide definition for many biotechnologists.

I think there should be some new definition or general agreement on what we do: evolve things like we want vs (real) evolution.

I was not talking about not agreeing with Immunology I was talking about the directed evolution field. I used to work (3 years) in directed evolution. I only took a specialization class in Immunology (still, I can say that I have a bit more knowledge than the average trained biologist in immunology). So. the directed evolution people really think that they are simulating evolution in their test tubes. BTW, FYI the view of one of these people about directed evolution:
http://www.chymiatrie.de/index.php/component/content/article/133-video-37

One of the popes in directed evolution explaining some things here.

And now, let's stop the discussion and call it a truce because we are getting too philosophic, polemic and semantic and too little scientific


Engineering genetic variation

The processes of genetic mutation and recombination are often considered to be random in nature. However, the types of variation that can occur and their associated probabilities are often heavily biased and constrained by the biochemistry of the biosystem itself, limiting the paths accessible to evolution 25 . As these constraints are partly determined by the biosystems genotype, genetic variation is something that can, in theory, be genetically engineered. For example, not all point mutations are equally likely transversions and transitions differ in their likelihoods 26 , and methylation 27 , genomic context 28 and species 29 all influence local and global mutation rates. Furthermore, algorithmic mutations 30 may occur. These are mutations that result in changes of several nucleotides in one event (thus, an algorithm can describe the change) and can be thought of as shortcuts through sequence space (Fig. 1b, left). The likelihood of an algorithmic mutation may be much greater than the summed likelihoods of the equivalent sequence of individual point mutations. For example, the chance of an insertion of the two-base motif ‘AC’ into a tandem repeat region due to slipped-strand mispairing may be more likely than two insertion events of ‘A’ and ‘C’ occurring independently 31 . Recombination 32 and mobile genetic elements 33 are other examples of biological processes capable of producing algorithmic mutations.

Sequence space is therefore not explored in a uniformly random way, even discounting for the role of selection. Instead, the paths evolution can take are determined by the ‘variation operator set’, which defines all the different point and algorithmic mutations that can occur in the system. Each variation operator in this set has an associated probability distribution that represents the likelihood of arriving at a given sequence from another (i.e., by this operator acting on the design type). The distributions of the variation operator set combine to produce the ‘variation probability distribution’. This describes the chance of arriving at any given sequence from the design type due to all the biochemical and physical processes capable of causing genetic variation that are present in the system (Fig. 1b, right). The variation operator set defines the rate and the likely directions in sequence space a design will explore during evolution. As a design type evolves, the variation probability distribution changes, as further dispositions become available.

The variation operator set depends on the specifics of the biosystem being engineered and the set to be applied in practice is dependent on available knowledge of the system. For example, the variation operator set of a design-type biosystem may be said to include transition mutations, transversion mutations and recombinations, each associated with a unique probability that varies across the design type’s sequence. A sample population can be generated by applying the operator set to the design type. This population, with the design type at its centre, may be named a quasispecies, as is used for the related concept in viral evolution 34 .

The variation probability distribution can be considered at all stages of the design process: from specifying mutation rates of specific parts, designing new biochemical mechanisms capable of specific forms of genetic variation and thinking of genetic variation as a feature of a system that can be designed and built. Such integration would allow for global and local mutation rates to be specified as part of the design and standardised mutation rates could even be listed in part datasheets 35 . It is likely that improvements in the prediction of mutation probabilities will be made with the increasing availability of sequence data and associated computational methods. Furthermore, some design rules for influencing local genetic variability are already known (e.g., avoiding the reusing of parts and repetitive sequences to reduce homologous recombination and indel mutations) 36,37,38 , and global mutation rates can also be rationally engineered and manipulated 12,39 .

A large toolkit for controlling genetic variation has already been created by bioengineers, which could be used to improve evolutionary stability or increase specific evolvability (i.e., the ability of the biosystem’s evolution to be directed as the designer intended). New tools will doubtless be developed from the diverse mechanisms that generate genetic variation in nature. The variation probability distribution of the design type can be modified by either adding or removing variation operators (e.g., by adding or removing DNA modifying enzymes) or by modulating existing operators in the system across the genotype. This may be through altering DNA sequence properties (e.g., avoiding simple sequence repeats to reduce the chance of indels through slipped-strand mispairing 36 ). Variation operators can be highly targeted like the DNA methylation of specific bases to increase likelihood of mutation through spontaneous deamination 27 or may have a global effect such as the removal of error-prone polymerases from a host organism 40 . Orthogonal mutation systems that modulate genetic variation of a specific plasmid or region of DNA can be used to overcome genomic error thresholds, increasing the potential for directed evolution 41 .

Larger-scale genetic variation can be achieved through mechanisms such as site-specific recombination, which can be used for inserting, removing, duplicating, inverting or shuffling large segments of DNA, exemplified by the SCRaMbLE system used in the synthetic yeast Sc2.0 42 . Finally, acquisition of foreign DNA either from other organisms in the population through sex, horizontal gene transfer or from free oligonucleotides in the environment 12 may also be engineered. The recombinant approaches of genetic engineering can be thought of as a highly orchestrated form of horizontal gene transfer, which is also increasingly being acknowledged as a source of innovation in natural evolution. For example, it is a major mechanism used by bacteria to acquire antibiotic resistance 43 . As with sexual recombination, it enables large jumps through sequence space. This increases the breadth of search and potentially enables the crossing of valleys in the evolutionary landscape to access peaks that would otherwise be inaccessible.

By combining these and other biochemical tools, it may eventually be possible to precisely design the variation operator set to produce complex combinations of genetic variation. For example, the variation operator set of a genetic circuit may be engineered by avoiding repeated parts (removing the homologous recombination operator), using a host with a high-fidelity DNA polymerase (globally reducing probability of point mutations), and by incorporating DNA recombination sites (adding an operator for specific DNA recombination, perhaps to be used for future directed evolution). Table 2 provides some examples of methods for controlling variation operators that have been developed so far.


Stabilization of GPCRs by Point Mutations and their Combination

Currently there is no clear design strategy for stabilization of GPCRs by mutations. Therefore, stabilizing mutations have to be identified experimentally by testing many different point mutations in either one-by-one or by ensemble evolutionary approaches. When single mutations are identified, they can be combined to further increase the thermostability of the protein. The process of combining the mutations is also experimental because the effects of individual mutations are not always additive and the structural basis for stabilization is not necessarily obvious. However, some general observations have been formulated. Effects of replacing residues which are neighbors in sequence or structure usually do not lead to a further increase and may even decrease the stability of the protein, as effects of single mutations may cancel each other when combined. Combinations of non-neighboring mutations may lead to a further stabilization, though the increase in stability is usually smaller than the summed up stabilization effects conferred by single mutations (Magnani et al., 2008 Serrano-Vega et al., 2008 Shibata et al., 2009, 2013 Lebon et al., 2011a). It has been observed that mutations stabilizing the agonist-bound state are more difficult to combine as they may stabilize slightly different active conformations. In addition, active conformations are more open on the intracellular side which may be more difficult to stabilize compared to a more compact, less dynamic inactive state (Magnani et al., 2008).


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


Acknowledgements

The authors thank Professors Aaron P. Mitchell and Lorraine S. Symington for helpful discussions both in the design of this project and during the writing of this manuscript. They also like to acknowledge Prof. Jingyue Ju and the Columbia Genome Center for high-throughput DNA sequencing.

Additional Supporting Information may be found in the online version of this article.

اسم الملف وصف
PRO_513_sm_suppinfo.doc369.5 KB Supporting Information

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


Engineering enzymes to catalyze new biosynthetic reactions

Enzymes have indeed found significant applications in synthetic processes but the full realization of their potential has been limited because they are often unstable, rarely accommodate alternate substrates, function under a limited range of reaction conditions and frequently require expensive cofactors. The drawbacks an enzyme exhibits are determined by the architecture and dynamics of the active site and their encompassing protein scaffold. To address these issues, structure-based redesign strategies are often undertaken that endeavor to identify mutations, usually based on analysis of enzyme active sites, to improve binding and catalysis for a desired substrate or reaction context. Many successes have been reported, but it is likely that for every success there are at least as many unreported failures. This is perhaps unsurprising, since there are inherent limits to the mutability of active sites for very divergent substrates and because enzyme-engineering hypotheses are often based on structural studies that are incomplete, both in terms of knowledge of substrate, transition state, product-binding modes and in understanding the dynamics of active sites and their ancillary-protein scaffolding.

Directed evolution methodologies have been developed, in part, to bypass this knowledge gap [4,5]. Inspired by natural selection, these methods endeavor to identify productive protein-sequence substitutions and their useful combinations by generating libraries of enzyme variants. على سبيل المثال، random mutagenesis of an encoding gene and then selecting for improved characteristics via desired function- or property-screening strategies. In principle, by emulating the search algorithm employed by nature (mutation followed by selection), directed evolution is capable of identifying solutions to problems in the generation of new biocatalysts from progenitor enzymes lacking complete characterization, without knowledge-based biases. In practice, however, structural and biochemical data are often used to guide directed evolution experimental designs for greater success.

For over two decades, directed evolution methods have been applied throughout numerous studies, for the generation of optimized biocatalysts, in some cases with impressive results. Rate enhancements in excess of five orders of magnitude have been reported [6], in addition to the generation of biocatalysts for previously unknown biochemical reactions. While these successes have been reviewed in other recent publications [2,5,7,8], we will highlight a few here to illustrate the power and scope of these methods.

P450 monooxygenases have been developed by Arnold and co-workers for the biochemical fermentation of alcohols from straight chain alkanes. Using a medium-chain fatty acid oxidase as a progenitor enzyme, directed evolution methodologies introduced catalytic competence for the oxidation of successively shorter and less oxidized alkyl chain precursors, first octane [9] and later to propane [10]. Step-wise improvements via mutagenesis throughout the individual domains of the monooxygenase variants ultimately resulted in an efficient P450, propane monooxygenase [11]. Furthermore, one of the variants resulting from these campaigns was evolved to convert ethane to ethanol, currently an important biofuel for use in automobiles [12]. Zhao and co-workers have demonstrated how the cofactor-regeneration problem may be addressed using directed evolution of phosphite dehydrogenase. Through a combination of multiple-mutagenesis methods over several generations, the t1/2 of phosphite dehydrogenase at 45ଌ was improved greater than 23,000-fold from the parent enzyme without sacrificing catalytic efficiency, providing a useful biochemical method for NADH cofactor regeneration [13,14]. Impressive results have also been reported in the improvement of enzyme enantioselectivity for new substrates through the process of iterative saturation mutagenesis and Combined Active site Saturation Testing (CASTing) [15]. To demonstrate the utility of these methods, Reetz applied iterative saturation mutagenesis to Pseudomonas aeuriginosa lipase, a well studied enzyme, to increase the enantioselectivity for a selected chiral ester, succeeding in generating a mutant with an enantiomeric ratio (E-value) 594-fold improved over the original enzyme. In comparison, previous efforts using conventional mutagenesis protocols (error prone polymerase chain reaction [epPCR], saturation mutagenesis of hot spots, gene shuffling and recombination) identified a lipase possessing a comparatively lower E-value of 51 [16].

While there are several similar impressive success stories, a cursory survey of the literature also reveals a substantial number of studies in which the enhancements are more modest. Further complicating the task of quantifying the successes of many studies is that many articles report improvement in properties that do not refer directly to kinetic parameters (e.g., total yield of reaction). Presumably, this is not an intentional obfuscation. Rather, many directed evolution studies are simply goal oriented and the goal is a desired phenotype. Desired phenotypes may be 𠆊n organism survives’, 𠆊 colony changes color’ or that 𠆊 percent conversion is achieved’. Indeed, almost all reported studies to date appear to succeed in generating their desired phenotype or chemophenotype and by these criteria, can be viewed as bona fide successes in directed evolution.

In the context of combating the problem of 𠆏inancial toxicity’, two recent studies demonstrate the potential of directed evolution methods for reducing costs. A synthetic-biology campaign for the economical production of artemisinin has used directed evolution methodology as a tool in optimizing production in heterologous expression of this antimalarial metabolite [17�]. In a more recent example, the Sitagliptin synthetic pathway was streamlined via the directed evolution of an enantioselective transaminase, which obviates the need for a costly resolution step in the synthesis of this clinically prescribed antihyperglycemic compound. Given the annual market for sitagliptin (tradename Januvia/Janumet) of US$2.8 billion, these improvements have a large potential economic and health impact [20].

However, given the substantial body of literature describing successes in directed evolution, the diversity of the methods employed and the variety of enzyme classes improved, we became interested in performing an objective assessment of success of the methods in directed evolution for the creation or optimization of discreet biosynthetic enzymes. Correspondingly, for this study, we selected articles from the last ten years using objective selection criteria. Using the GoPubMed.com semantic server [21], we identified the top 20 research journals publishing articles with the search phrases 𠆍irected evolution’ or 𠆍irected molecular evolution’. Additionally, all citations comprised studies that reported improvements in a small molecule biotransformation enzyme, reported kinetic parameters, including كcat/كم و / أو كcat (أو Vmax) and/or كم, for both the progenitor enzyme and the evolved enzyme, are target-based studies in other words, the reported improved turnover was for the substrate used in the screen and more than one site was mutated, reflecting a departure from single site saturation mutagenesis.

Before presenting the results of our literature analysis we review the most common methods used in typical directed evolution campaigns, to investigate the current state of the art and to define the classifications used in our subsequent analysis.


Result and discussion

Screening high specific activity mutants produced by directed evolution

For the purpose of enhancing the specific activity of ManAK at 37°C, an error-prone PCR-based directed evolution methodology was undertaken to construct a mutation library in P. pastoris. As described in Fig. 1, the mutation library was first constructed in بكتريا قولونية DH5α, in order to gain a collection of recombinant plasmids that were used for the sequential transformation and selection of positive mutants in P. pastoris. Approximately 10 000 clones were picked up and inoculated into 48-well deep plates for the first round of screening, during which the mutants showing > 20% higher enzymatic activity than the control group (

200 clones) were selected for the second round of screening. The second round of screening was also performed in 48-well deep plates to further confirm the results from the first round of screening. From this, 120 clones were left for the third round of screening in 100-ml shake flasks, and 42 transformants showing enhanced enzymatic activity were used for preparation and purification of enzymes. Because these mutants were fusion proteins with 6xHis tags at the C-terminal end, the target protein was easily purified by the Ni-affinity chromatography method. Finally, four positive mutants (P191 M, P194E, S199G and S268Q) with enhanced specific activity were selected for biochemical analysis. Multiple copies of target genes with apparently enhanced enzymatic yield can be achieved in P. pastoris (Teng وآخرون., 2015 ). This might be responsible for most of the excluded mutants in the final selection process. Therefore, making directed evolution in S. cerevisiae by using episomal vectors, and thereafter transferring the best variants to P. pastoris for overproduction in bioreactor might be a good option for future campaigns (Molina-Espeja وآخرون., 2015 ).

Biochemical characterization and kinetics of positive mutants

Resolution of mutants by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) indicated that four positive mutants shared the same molecular weight (

55 kDa) with the wild-type enzyme (Fig. S2), and the molecular weight of deglycosylated mutants was about 45 kDa, which was 10 kDa lower than their glycosylation forms. This suggested that the glycosylation pattern of ManAK was not apparently altered by these four single-point mutations (P191 M, P194E, S199Gand S286Q) (Cheng وآخرون., 2015 Liu وآخرون., 2021 ). As shown in Table 1, the specific activities of four mutants were improved, with 25.5%–60.9% enhancement compared with ManAKH. According to the temperature profiles (Fig. 2A and B), three mutants (P194E, S199G and S268Q) shared the same optimal temperature (75°C), while that of the P191 M mutant decreased to 70°C. It was also noteworthy that the relative activities of the four positive mutants at a low temperature range (40–65°C) were also apparently increased compared with ManAKH. This might be responsible for their enhanced specific activities at 37°C. As for their thermostability, the half-life (ر1/2) parameters for enzymatic activity at 75°C of P191 M and P194E were decreased to 1.5 min and 15.6 min, respectively. By comparison, no significant changes to the thermostability of the S199G and S268Q mutants were detected. Compared with ManAKH, the pH properties of the four mutants were virtually unchanged (Fig. 2C and D). The optimal pH scales for enzymatic activity were 2–6, and these four mutants retained 80% of their initial activity after a 2-h pre-incubation at different buffered pHs (pH 2–8).


شاهد الفيديو: Mutation الطفرة الوراثية (كانون الثاني 2022).